全 文 ：福 建 师 范 大 学 学 报 ( 自 然 科 学版 )
J O U R N A L O F F U J IA N N O 尺 M A ` U N I V已 R S I T Y
〔 N A T U R A L S C I E N C E )
6 ( 2 )
:
63
·
6 8
19 9 0
赤 小 豆 胰 蛋 白 酶 抑 制 剂 的 分 离
纯 化 及 其 性 质 研 究 .
杨 同成 李田 土
( 高分子研究所生 化研究室 )
摘 要
用酸抽提 、 2。 5肠 T C A热处理 、 硫 酸按盆析 、 凝胶层析和 D E A E 纤维素离子 交换层
析 等方 法 , 从 中药赤小豆 中分离得到一种徒蛋白酶抑制 剂 . 聚丙烯既胺凝胶 电泳呈单一
谱带 . 经 S D S 一聚丙烯酞胺凝胶 电泳法测 定 , 其分子量 为 7 4 0 0 . N 一末端分析和氛基酸组成
测 定结果表明 , 赤 小豆胰蛋白酶抑制 剂不含半脆氛酸和耽 氛酸 , 是以酪氛酸 为N 一 末端 ,
由 5 4个氛基酸残基组成的单一 多肤链 . 它仅对胰 蛋白酶有较强 的抑制作用’ , 时胰凝乳蛋
白酶 、 枯草杆菌蛋白酶和木瓜蛋 白酶均无明 显的抑制 活力 , 对热及酸碱亦较稳定二
关键词 : 赤小豆 , 胰蛋白酶抑制 剂 , 分离纯化 , 顶体粒蛋白
胰蛋白酶抑制剂的研究 , 国内外曾作过广泛的报 导 〔` 一幻 . 我 们 发 现 中 药 赤 小 豆
扭加 se 。玩: ca 比 ar Qt su R ox b) 中含有分子量较小 , 稳定性较好的胰蛋白酶抑制剂 . 它除
了能较强地抑制胰蛋白酶外 , 对人体精子顶体粒蛋白 ( 类胰蛋白酶 ) 也有一定的抑制作
用川 , 对其他动植物蛋白酶均无明显的抑制活力 . 这些特征将为进一步探素它在避孕新
药方面的应用提供可能 . 本文报道这种胰蛋白酶抑制剂的分离纯化 , 并对其性质进行了
研究 .
1 材料与方法
1
。
1 实验材料
新鲜赤小豆购 自福州医药商店 , 实验前洗净 , 浸泡后除去表皮 , 置冰箱 中备用 .
1
.
2 酶样品
羊胰蛋白酶 ( 结晶品 ) 、 枯草杆菌蛋白酶 ( 2 0 0 0国际单位 /m g ) 、 核糖核酸酶均 由
上海生物化学研究所提供 , 胰凝乳蛋白酶为上海化学试剂站分装厂产品 , 木瓜蛋白酶系
E
.
M e r e k产品 ( 6 0 0 0U S p /m g ) .
1
.
3 底物及试荆
N
一苯甲酞一 D L 一精氨酸一对硝基苯胺 ( B A P N A ) 、 苯甲酞精氨酸乙醋 ( B A E E ) 均为
上海生物化学研究所东风试剂厂产品 ; 酪蛋白 、 牛血清白蛋白 (电泳单点纯 ) 、 丙烯酞胺
` 本文初稿于 1 9 8 9年 8月 28 日收到 .
《福 建 师 范 大 学 学 报 》 自 然 科 学 版 19 9 0年 6月
夔产、
为上海化学试剂采购供应站分装品 ; 血红蛋白系日本武 田化学株式会社产品 ; 甲叉丙烯
酞胺 、 十二烷基硫酸钠 ( s D s ) 均为 S e rv a产品 ; 细胞色素 C为美国 s i gm a化学公司产品 ,
se p ha de x G
一
5。和 D E A E一纤维素 D -E 52 均为上海化学试剂厂进 口分装品邝 . 4一 二硝基
氟苯 ( F D N B ) 结晶品系中国金山县兴塔化工厂产品 ; 其他试剂均为 A . R试剂 .
1
.
4 分析方法 - -
1
.
.4 1 胰蛋白酶抑制剂活力的测定 : 分别以酪蛋白 、 B A P N A和 B A E E为底物 ,
参照文献〔5〕的方法侧定 . 一
1
·
4
.
2 胰凝乳蛋白酶抑制活力的测定 : 以血红蛋白为底物进行测定 .
1
.
.4 3 枯草杆菌蛋白酶和木瓜蛋白酶抑制活力的测定 : 以血红蛋白为底物 进 行
\测定 .
.1 4
.
4 聚丙烯酸胺凝胶电泳 : 采用垂直板型电泳 . 分离胶 浓 度 为 7呱 , 以 。 . 05
m o l压 的 〔 p H 7 . 8 ) T ir s 一 甘氨酸为缓冲液 , 在室温下 电泳 e 小时 (2 50 伏 ) , 考马斯亮蓝
G
一
25 0染色 . -
1
.
4
_
.
s s D s
一聚丙烯酞胺凝胶电泳 : 参考w e be r和 o s b or n的方法图 , 采用 s D s 一聚丙
稀酞胺凝胶垂直板电泳法 , 凝胶浓度为 10 如 , 样品溶解于含 1呱琉 」基 乙 醇 , 1场 s D s 的
.0 0i1n ol / L ( pH入幻磷酸缓冲液中 ,在 10 召℃加热 5分钟变性 . 用含 0 . 1肠 s D S的 。 . l m of / L
( p7H
`
2) 磷酸为缓冲液 , 考马斯亮蓝 R 一 25 0染色 . 1 -
.1 4
.
6 光谱测定 : 用国产 53 w U v / v IS 型分光光度计侧定 .
.14
·
7 N
一末端氨基酸残基的测定 : 用二硝基氟苯法在聚酞胺薄膜上进行双 向层
科析 .1 .4 , 8 氨基酸组成分析 : 蛋白质酸水解按M o er 和 s t ie n的步骤 〔7 “ , 用 5 . 7mo l/ L盐酸于 1 D℃水解 24 小时 , 在日立 一曲5型氨基酸组成 自动分析仪上进行分析犷色氨 酸 的
含量用 s iP se 〔“ ,方法测定 ; 己糖用费林试剂法测定 .
-
.
.1 .4 9 抑制剂的热和酸碱稳定性: 抑制剂 ( 40 协g /m l) 在 10 0℃下间接加热 , 时 间
为 2 、 5 、 10 、 1 5 、 30 分钟 , 或在 60 ℃下间接加热 30 分钟 . 抑制剂对酸碱的稳定性实验 ,
是将其分别置于 p H 为 2 、 3 、 6 、 9 、 n 的溶液中 , 放置 2 4小时后 , 再调 p H至 8币 , ` _然后按前
法测定抑制剂对胰蛋白酶抑制活力的变化 .
.
4
.
10 蛋白质浓度的测定 : 分别采用双缩脉法和紫外吸收法测定 .
2 结果 _
2
·
1 抑制剂的分离纯化和纯度鉴定 ·
取去皮处理的赤小豆 1 0 克 , 用 4语体积的 0 . 25 m ol / L 硫酸溶液浸泡 24 小时 . 经组织
捣碎机捣碎 , 并在室温下放置 2小时后离心分离 . 向清液滴加 10杨 T c A溶液 , 使 T c A的
终浓度达。。 5呱 . 内清液在 60 ~ 70 ℃保持 5分钟 , 然后用冰水迅速冷却 , 置冰箱中过夜 .睿漂雳磊撬蕊鼎纂黯瑞;荔篡瓢窟霭篡氛轰.
置冰箱 中过夜 . 离心 , 沉淀物用 3~ 4倍体积的 0 . 2 5m ol / L ( 内含价 Zm ol / L N . C )I p H 7 . 8
2 期 赤小豆胰蛋白酶抑制剂的分离纯化及其性质研究
己`O的牲才
《答 5 。净 -
图 ,抑制荆粗制品的 s e p h 歌 d e x G 一导0柱层析洗脱图
柱 ` · 2 “ 3 c0 。 , 流速示肠垃 1/。 城一 。一二蛋白质浓度 ,
一 。一一 抑制剂活力 _ 一
自肠ù占
切
俘八洲扒
幼切日篇临叨以叱
的磷酸缓冲液溶解 , 离心除去不溶
物 , 即为赤小豆胰蛋白酶抑制剂粗
制 品 . 分 2 批上 S eP h a de x G 一 s a 柱
( 1
.
2 火 3 Oc m )分 离 , 用 o . 25 m ol / L
( 内含。 . 2m 。灯L N a C I )p H 7 . 8 的磷
酸缓冲液洗脱 , 得到 3个组分 (见图
1 )
. 经活力 鉴定 , 收集有 抑 制活
力的部分 . 经聚乙二醇浓缩后 , 用
0
.
ol m ol / L p H 7
.
8的磷酸缓冲液透
析平衡 . 再经 D E A E 一纤维素 l( 。 Z X
3 c0 耐离 子 交 换 层 析 , ` 用 切 o m l
2二。 1/ L的 N a c l 溶液梯度洗脱 , 分
离得到廷个主要峰 . 经活力鉴定 ,收
集 有抑制活力的第 l 峰组分 ( 见图
2 )
.
经聚丙烯酞胺凝胶电泳 , 显示
单一谱带 ( 见图 3) , 说明赤小豆胰
蛋白酶抑制剂为单点纯电泳样品 .
经紫外吸收光谱测定 , 呈现典
型蛋白质吸收光谱 ( 见图 4 ) 、
乙
艺 0 召 0 e o
一 《 肚 3二赞》
图 2 抑制剂的D E A E 一纤维素柱层析的梯度 洗 脱图
柱 1 . 2 又 30 c 。 , 流 速 。 . 25 m l/ m in 。 一 . 一一 蛋白质浓
度 , 一 ·一一 抑制剂活力 . -
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滚长孟肛娜图 4 掷制荆的紫外吸收光谱
p H 6
.
o
, 浓度。 . l m刀m l 。
令、双尹浦
2
.
2 抑制剂的活为特征
赤小豆抑制剂的专一活力 , 通过抑制曲线加以鉴定 . 结果表明 , 赤小豆抑制剂不能
抑制胰凝乳蛋白酶 、 枯草杆菌蛋白酶及木瓜蛋白酶对各自底物的水解 , 仅专一地抑制胰
蛋白酶对酪蛋白 、 B A P N A 和 B A E E等底物的水解 . 其当量抑制比值 分 别 为 :1 3 . 85 、
1 : 3
·
3 3和 1 : 3 0 2 (见图 5 ~ 7) , 抑制常数 分别为 乳 5 X 10 一 “ 、 4 。 5 X 10 一 “和 6 . 8 x l企 “ .
2
·
3 抑制荆的分子股测定
采 用S D S 一聚丙烯酞胺凝胶电泳法侧定分子量 . 以牛血清白 蛋 白 ( MW 67 叻 O ) 、 胰
凝乳蛋白酶 (M w 2 3 5 0 )核糖核酸酶 (M w 1 3 7。。 )和细胞色素 c (Mw 12 切 。 )为标准蛋白 ,
经考马斯亮兰R 一仑50 染色 , 均呈现单一谱带 . 以每一样品的又血对M W的对数作图 , 呈线
《 福 建 师 范 大 学 学 报 》 自 然 科 学 版 2 0 9 0年 6月
性关系 ( 见图 8 ) , 求得赤小豆抑制剂分子量约为 7 4 0 0 .
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图导视制剂对胰蛋白酶水解
酪蛋白的抑制濒线
底物 : l %酪蛋白 l lm ,胰蛋白酶 。 1 0协g / m l
1 2 3 4 5
抑制剂如 g 》
图 6 抑制剂对胰蛋白酶水解 _
B A P N A的抑制曲线
底物 : B A P N A 36 叩哪 mI ,胰蛋白酶 : 10 内 /耐
二〔
O幻
三
哎口)、司奋叭on,
君要世再旧、趾派硬
抑 制剂 `叱 ,
图了 抑制荆对胰蛋白酶水解
B A E E的抑制曲线
底物 : B A E E o . s x l o一 3 0 0 1/ L
胰蛋白酶 : 10 协叮。 l
图 8 s D s 一聚丙烯醉胺凝胶
电泳分子盆测定
1
. 牛血清白蛋白 2 . 胰凝乳蛋白酶 3 . 核糖核酸酶
4
。细胞色素C 5 . 赤小豆抑制剂
表 1
2
.
4 抑制剂的氮基酸组成及其 N 一末端
分析
赤小豆抑制剂氨基酸组成分析结果见表
1
. 抑制剂邮 4个氨基酸残基 组 成 , 其中 ,
极性氨基酸的含量较高 , 约占7 . 7 肠 . 碱性
氨基酸约占18 . 5肠 ,酸性氨基酸约占1 6 . 7肠 ,
不含色氨酸、 脯氨酸 、 半耽氨酸和胧氨酸 . 由
抑制剂中氨基酸残基总和 , 推算其最小分子
量为 67 25 , 与所钡孵的分子量大致相符 ` 从
N
一 末端层析图谱 ’ ( 图 9 ) , 仅见一个淡黄色
D N P
一 氨基酸 , 确定其N 一末端氨基酸为酪氨
酸 . 赤小豆抑制剂不含己糖 .
氨基酸翟霆纂馨 衡 .了户、1了ù I沪、 1矛、声,止、.户、产飞了、、且产、少`少尹1才,廿q自叮刁丹01Q目O乙它上n勺口,ó门a月Jdō叉盯介幼72肠0D4软516一卜`.-。 · 8导 1仓0 . 5连0 71 。 7 9 0 3
1
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.
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.
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.
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,
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。
3 9 3 0
0
.
38 0 3
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。
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.
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.
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0
.
7 4 18
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.
0 8 0 1
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2
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3
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3 8
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缝,u字呛5下0sP滋比曰yh积! tr到了rl
乙 5 抑制荆的稳定性 合计最小 M W 6 7 2 5
赤小豆抑制剂在 p H为2、 1 的溶液中放 紊水解 24 小时 . “ 括弧内为最接近整数值
2 期 赤小豆胰蛋白酶抑制剂的分离纯化及其性质研究
今;`ìù专赞
置2 4小时 , 仍保持9 肠的抑制活力 . 在 10 0 ℃加热 10 分钟
或 6 0 ℃保温 30 分钟 , 仍 保 留 98 肠 的 抑 制 活 力 . 仅在
10 。℃加热 15 分钟和 30 分钟 , 其抑制活 力 才 分 别 丧 失
3 0肠和 6 6% . 由于它较稳定 , 可在较剧烈条 件 下 除 去
杂蛋 白 , 既可简化手续 , 又有利于获得较纯的样品 .
口 ,
T梦E
3 讨论
通过酶活力和光谱侧定 , 证实赤小豆中含有能专一
抑制胰蛋白酶活力的蛋白质成分 . 聚丙烯酞胺凝胶电泳
和 S D S 一 聚丙烯酞胺凝胶电泳均显示单一谱带 . 用 S D S -
聚丙烯酞胺凝胶电泳法测得其分子量为 74 0 0 , 按抑制剂
落齐叮七r一一 ,
图 g -N 末端 D N P 一橄基酸色谱图
溶剂 I 苯 : 醋酸 = 8 : 2
溶剂 l 水 : 85 %甲酸 = 1 : 1
对胰蛋白酶当量抑制比的平 均 值 ( 1 : 3 。 47 ) , 求得其分子量为 6 9 0 0左右 , 按其氨基酸
残基总数为 54 个 , 推算其最低分子量为 6 7 2 5 , 故赤小豆抑制剂分子量在 7 0 0 。左右 . 该抑
制剂极性氨基酸含量在 60 % 以 上 , 不含色氨酸 , 而且对 2 . 5肠 T C A热处理较为稳定 , 属于
aL
s
ko w sk i
仁。 ]提出的小分子胰蛋白酶抑制剂 . 从赤小豆抑制剂氨基酸组成看 , 比其 他 植
物性胰蛋白酶抑制剂含有较多的碱性氨基酸及较少的酸性氨基酸 , 因而易与胰蛋白酶结
合 , 故其抑制活力 比较高 . 蛋 白质分子的稳定性与分子 中的二硫键密切相关 . 赤小豆抑
制剂不含半胧氨酸 、 胧氨酸 , 但它对酸碱 及热却较稳定 , 这可能与它不含脯氨酸及含较
多的极性氨基酸 , 容易形成 a 一螺旋结构和氢键 , 有利于维持其分子结构的稳定性有关 .
近年来 , 人们还发现一类不含胧氨酸的抑制剂 , 如大麦胰凝 乳 蛋 白 酶抑制剂 , 及唯一
对胰蛋白酶有当量专一抑制作用 , 且分子量低的苦瓜子胰蛋 白酶抑 制 剂 ( M C I一 3) 〔` 。了,
但它们对酸碱和热的稳定性不如赤小豆胰蛋白酶抑制剂 , 这可能与它们的分子组成中含
有脯氨酸有关 . 因此 , 赤小豆胰蛋 白酶抑制剂可能又是一种对胰蛋白酶有专 一 抑 制 作
用 , 理化性质较稳定 , 低分子量且不含胧氨酸的特殊的蛋白酶抑制剂 . 经我 们 初 步 试
验 t ` 1 , 证实赤小豆抑制剂对人体精子顶体粒蛋白 ( 类胰蛋白酶 ) 亦有较强的抑制作用 .
动力学研究表明 〔` ’ l , 它对胰蛋 白酶有显著的不可逆竞争性抑制作用 . 因此 , 对 赤 小 豆
胰蛋白酶抑制剂的结构和功能作进一步研究 , 将具有现实意义 .
木文 曾于 1 9 8 8年 12 月 4臼在国际水溶性高分子学术讨论会上宣读过 .
参 考 文 南充
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弓 8 《 福 建 师 范 大 一学 学 报 》 自、 然 科 学 版 1 9。。年 它月
连林拓示 at i e
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黔忠耀未黯概呱熟犷盆;笋以七扭 .
〔 , o〕曾福跃 ,
〔 1 2〕杨同成 .
钱瑞卿 , 汪酞 . 生物化学与车物物理学报 ,
生物化学杂志 , 飞990 (待发表 ) 、
1公3 9 , 2 1 ( 4 ) , 2 6 7 ~ 2 6 9
反硕d娜 _ 冲珍 t h 色 几。 l at io n an d C h ar ct e ir azt lo n of ht e rT 即s认 婀
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