全 文 ：第 13 卷第 1 期 菌 物 研 究 Vol. 13 No. 1
2015 年 3 月 Journal of Fungal Ｒesearch Mar． 2015
! 基金项目:吉林省科技发展重点项目(2010ZX09401-305-46)
作者简介:代欢欢，女，硕士研究生，研究方向:菌物生态。
收稿日期:2014-03-15
!! 通讯作者:李长田，E-mail:308840096@ qq． com
瘦柄红石蕊次生代谢产物
Biruloquinone的抗氧化作用研究*
代欢欢1，李长田2＊＊
(1．吉林农业大学中药材学院，长春 130118;2．吉林农业大学食药用菌教育部工程研究中心，
长春 130118)
摘 要:讨论了从瘦柄红石蕊 Cladonia macilenta发酵液中分离得到的一种自然界罕见的菲醌化合物 birulo-
quinone的体外抗氧化能力;分别采用 DPPH·自由基清除法和 ABTS· +自由基清除法对其抗氧化活性进行测
定。结果显示，biruloquinone具有较高的抗氧化活性，且在检测浓度范围内对自由基的清除效果呈现剂量依
赖关系，在浓度分别为 100 μg /mL 和 1． 2 mmol /L 时对 DPPH·和 ABTS· +自由基清除能力最大值分别达到
90． 83%和 75． 39%，其自由基半数清除浓度(EC50)分别为 24． 91 μg /mL 和 0． 488 mmol /L，在 ABTS
· +法中，
biruloquinone的总抗氧化能力为 2． 5 TEAC。
关键词:瘦柄红石蕊;Biruloquinone;抗氧化活性;DPPH·法;ABTS· +法
中图分类号:Ｒ285 文献标识码:A 文章编号:1672-3538(2015)01-0035-06
DOI:10． 13341 / j． jfr． 2014． 1012
引文格式:代欢欢，李长田．瘦柄红石蕊次生代谢产物 Biruloquinone 的抗氧化作用研究［J］．菌物研究，2015，
13(1):35-40．
Antioxidant Activity of Biruloquinone from
Secondary Metabolites of Cladonia macilenta
DAI Huan-huan1，LI Chang-tian2＊＊
(1． College of Chinese Medicinal Materials，Jilin Agricultural University，Changchun 130118，Chi-
na;2． Engineering Ｒesearch Center of Chinese Ministry of Education for Edible and Medicinal Fun-
gi，Jilin Agricultural University，Changchun 130118，China)
Abstract:This paper focused on the antioxidant ability of biruloquinone from Cladonia macilenta
fermentation broth． Biruloquinone is a phenanthraquinone compound，which is extremely rare among
natural quinones． The antioxidant activity was measured using their ability to scavenge DPPH and
ABTS free radicals in vitro． The results showed that biruloquinone exhibited high antioxidant activi-
ties in dose-dependent manner in the test concentration range． DPPH and ABTS free radical clear-
ance rates were 90. 83% with an EC50 value of 24． 91 μg /mL and 75． 39% with an EC50 value of
0. 488 mmol /L，respectively，when the concentrations were 100 μg /mL and 1． 2 mmol /L． The total
antioxidant capacity of biruloquinone was found to be 2． 5 times TEAC by ABTS method．
Key words:Cladonia macilenta;Biruloquinone;antioxidant activity;DPPH·;ABTS· +
菌 物 研 究 2015 年
地衣(Lichen)是一种真菌和藻类的共生生
物，其生物学特性主要是菌藻共生体中真菌的体
现，故又称为地衣型真菌(Lichen-forming fungi，
LFF)［1］。由于其共生的特殊性，地衣的次生代谢
产物构成了天然有机化合物中独特的类群［2］，主
要有缩酚酸类及其衍生物、蒽醌类、脂肪酸类、萜
类、甾体类等［3］。目前，分离鉴定出的地衣次生
代谢产物超过 1 000 余种，其中大部分为地衣所
特有［4］。近年来的研究发现，地衣产物具有诸多
的生物学活性，如抗氧化、抗真菌、抗病毒、抗炎
症、抗癌、抗辐射等［5］，具有较大的药用开发潜
力，引起了国内外的关注。在目前陆地植物发现
新骨架化合物几率急剧下降的形势下，地衣生物
有潜力成为作用机制新颖、化学结构多样化的新
药或先导化合物的一个重要来源。
瘦柄红石蕊(Cladonia macilenta Hoffm．)是地
衣门(Lichenes)、子囊衣纲(Ascolichens)、石蕊科
(Cladoniaceae)、石蕊属(Cladonia)的一种朽木生
地衣。目前国内外对瘦柄红石蕊的研究主要从分
类学、形态学、生态分布［6-9］等角度进行，对其活
性的研究很少。据报道其含有的次生代谢产物包
括 barbatic acid，decarboxythamnolic acid，4-O-
demethylbarbatic acid， didymic acid， thamnolic
acid，usnic acid等［10］。而近期的一项研究表明，
来自于 C． macilenta 的化合物 biruloquinone 能够
阻断胆碱酯酶活性，具有作为新型抗阿尔茨海默
病(Alzheimers disease，AD)药物开发的潜力［11］。
biruloquinone为 9，10-菲醌类物质，是极其罕见的
天然醌类化合物，纯化后呈暗紫色晶体［12］，该类
化合物已被发现具有多种重要的活性，如丙肝肝
炎病毒(HCV)蛋白酶抑制剂活性、CD45 抑制剂
活性等［13］，但对其抗氧化研究尚未见报道。有关
AD发病机制的氧化应激假说认为:氧化应激导
致 AD 神经细胞凋亡，具有清除自由基活性的抗
氧化成分在 AD治疗中具有良好的发展前景［14］。
本文通过对 biruloquinone清除二苯代苦味酰基自
由基［1，6-Bis(diphenylphosphino)hexane，DP-
PH·］及 2，2-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺
酸)二铵盐自由基［Diammonium 2，2-azino-bis(3-
ethylbenzothiazoline-6-sulfonate) ，ABTS· +］能力
进行测试研究，进一步评价其以活性氧及自由基
为靶点的抗 AD 方面的潜在价值，为将该地衣型
真菌次生代谢物 biruloquinone开发成为新的天然
药物提供依据。
1 材料与方法
1． 1 试验材料
1． 1． 1 供试菌株 瘦柄红石蕊采自云南省，凭
证标本由中国科学院昆明植物研究所王立松鉴定
为瘦柄红石蕊(Cladonia macilenta Hoffm．) ，地衣
标本存放于昆明植物研究所标本馆(CH050136) ，
地衣体经内生真菌分离得到的紫色 C． macilenta
LFF保存于韩国国立顺天大学地衣资源银行
(KOLABIC)。
1． 1． 2 试剂药品 总抗氧化能力检测试剂盒
(ABTS法，碧云天生物技术研究所) ，二苯代苦味
酰基自由基 DPPH，乙酸乙酯、乙醇、氯仿、甲醇、
甲酸、苯等试剂均为国产分析纯。
1． 1． 3 主要仪器 旋转蒸发器 ＲE-52AA(上海
亚荣生化仪器厂) ，Synergy HT多功能微孔板酶标
检测仪(美国 Bio Tek 公司) ，紫外可见分光光度
计(756PC型，上海光谱仪器有限公司) ，电子分
析天平(BS210 S 型，北京赛多利斯天平有限公
司)。
1． 2 试验方法
1． 2． 1 C． macilenta LFF的大量培养 在超净工
作台中，从培养平板上收集 LFF 菌丝体，放入装
有 3 mL PDB 培养基的无菌研钵中，用无菌研钵
和杵轻轻地粉碎，至直径约 0． 5 mm，用移液枪将
研碎的菌种接种于 PDB 培养基中(5 瓶，300 mL /
1 000 mL 三角瓶) ，15℃、150 r /min，保持黑暗
培养。
1． 2． 2 Biruloquinone 的提取和分离 培养 30 d
后(发酵液呈深紫色) ，将全部 1． 5 L 发酵液，用乙
酸乙酯等体积萃取 24 h。将有机层通过Whatman
No． 1 定性滤纸除去菌丝体。该过程重复 2 次，并
将提取液合并，使用旋转蒸发器在 40℃条件下真
空浓缩至 500 mL。依照文献［11］，将浓缩的提取
物过硅胶柱(230 ～ 400 目，3． 5 × 80 cm)纯化，用
V(甲苯)∶ V(乙酸乙酯)∶ V(甲酸)= 90∶ 20∶ 2(4 L)
洗脱，得到暗紫色组分(980 mL) ，将该组分用旋
转蒸发器集中在真空 30℃浓缩，获得 110 mg bir-
uloquinone固体粗提物。然后将粗提物用 V(氯
仿)∶ V(甲醇)= 1∶ 1 重结晶法纯化，得到 35 mg
暗紫色的化合物晶体。
用核磁共振(NMＲ)分析方法鉴定该化合物，
63
第 13 卷 第 1 期 代欢欢等:瘦柄红石蕊次生代谢产物 Biruloquinone的抗氧化作用研究
结果如下:1 H-NMＲ:11． 52(-OH，s) ，11． 50(-
OH，s) ，7． 12(H，s) ，7． 01(H，s) ，4． 07(CH3，
s) ，2． 81(CH3，s) ;
13 C-NMＲ:183. 63，183. 94，
172. 33， 161. 71， 157. 32， 157. 33， 155. 08，
155. 08， 140. 11， 124. 08， 117. 06， 114. 20，
111. 26，110. 44，108. 00，58. 10，25. 44。
该数据与文献［11］中 biruloquinone(C17 H10
O7，图 1)的碳谱和氢谱数据基本一致，由此确定
通过以上方法纯化获得的暗紫色化合物晶体为
biruloquinone。
图 1 Biruloquinone的化学结构
Fig． 1． Chemical structure of biruloquinone
1． 2． 3 Biruloquinone 的抗氧化试验 (1)DPPH
体系。
样品准备:将 biruloquinone 用 80%乙醇溶液
配成 6． 25，12． 5，25，50，75，100 μg /mL 的质量浓
度。DPPH的配制:准确称取 2 mg DPPH，用 80%
乙醇定容至 50 mL，得到浓度为 0． 1 mmol /L 的
DPPH溶液。加样方法:1． 5 mL DPPH 溶液 +
1. 5 mL 80%乙醇，标记为 A0;1. 5 mL DPPH 溶液 +
1. 5 mL样品，标记为 Ai;1． 5 mL 样品 + 1． 5 mL
80%乙醇，标记为 Aj。混匀置于黑暗条件下反应
30 min，在 517 nm 处测量吸光度 A0、Ai、Aj。每组
数据 3 次重复。根据文献［15］，清除率计算公式
如下:
清除率 SA =［1 －(Ai － Aj)/A0］× 100% (1)
式(1)中，A0为 DPPH
·的起始吸光度;Ai为
DPPH·与样品反应后的吸光度;Aj为样品本身的
吸光度(空白试验)。
(2)ABTS体系。
样品准备:将 biruloquinone 用 80%乙醇溶液
配成 0. 15，0. 30，0. 60，0. 90，1. 20，1. 50 mmol /L
的摩尔浓度。标准曲线测定的准备:用 80%乙醇
把 10 mmol /L Trolox标准溶液稀释成 0. 15，0. 30，
0. 60，0. 90，1. 20 和 1. 50 mmol /L。ABTS 工作液
的配制:用移液器取 100 mL ABTS溶液与 100 mL
氧化剂溶液混合，得 ABTS工作母液，室温避光保
存 16 h。用 80%乙醇将 ABTS 工作母液稀释成
ABTS工作液(稀释倍数约 100 ～ 110 倍) ，使得
ABTS 工作液的吸光度减去 80%乙醇空白对照
后，A734为 0. 748(0. 7 ± 0. 05)。总抗氧化能力的
测定:96 孔板的每个检测孔中加入 200 μL ABTS
工作液;标准曲线检测孔内加入 10 μL 各种浓度
的 Trolox标准溶液，样品检测孔内加入 10 μL 不
同浓度的 biruloquinone，空白对照孔中加入 10 μL
80%乙醇，轻轻混匀;室温孵育 6 min后测定 A734;
每组数据 3 次重复。根据文献［16］，ABTS· +自
由基清除率计算公式如下:
清除率 SA =
A对照 － A样品
A对照
× 100% (2)
式(2)中:A对照为 ABTS工作液的起始吸光值
(空白对照) ;A样品 为加入 biruloquinone 后的吸
光值。
以标准品 Trolox 为参照，将待测物质的清除
自由基的能力与 Trolox 清除自由基的能力相对
比，通过对应的摩尔浓度比值计算出样品的总抗
氧化能力，即样品的 OD 值和 1 mmol /L 的 Trolox
测得的 OD值相同时，Trolox与样品的摩尔浓度的
比值，单位为 TEAC (Trolox Equivalent Antioxidant
Capacity-Trolox抗氧化当量)。
(3)验证试验。
由于试验样品 biruloquinone 本身带有颜色，
为避免被测样品本身的颜色对试验产生干扰，造
成试验数据不够准确，所以对样品 biruloquinone
的吸收光谱及加入样品后 DPPH 和 ABTS 体系的
吸收峰的影响进行验证［17］。
Biruloquinone:将 biruloquinone 用 80% 乙醇
溶液配成 25 μg /mL 的质量浓度，在 96 孔板的检
测孔中加入 200 μL biruloquinone 溶液，置于多功
能酶标仪中扫描 UV － Vis 光谱(波长范围 400 ～
900 nm)。
DPPH体系:将 biruloquinone 用 80%乙醇溶
液配成 10，25，60 μg /mL 3 个质量浓度，在 96 孔
板的每个检测孔中加入 170 μL DPPH 溶液;样品
检测孔内加入 30 μL 不同浓度的 biruloquinone，
空白对照孔中加入 30 μL 80%乙醇，轻轻混匀;室
温避光反应 30 min后，置于多功能酶标仪中扫描
UV － Vis光谱(波长范围 300 ～ 700 nm)。
73
菌 物 研 究 2015 年
ABTS体系:将 biruloquinone 用 80% 乙醇溶
液配成 0. 15，0. 30，0. 60 mmol /L 3 个摩尔浓度，
在 96 孔板的每个检测孔中加入 200 μL ABTS 工
作液;样品检测孔内加入 10 μL 不同浓度的 biru-
loquinone，空白对照孔中加入 10 μL 80%乙醇，轻
轻混匀;室温孵育 6 min后，置于多功能酶标仪中
扫描 UV － Vis光谱(波长范围 400 ～ 900 nm)。
2 结果与讨论
2． 1 Biruloquinone清除 DPPH·自由基的能力
DPPH·是一种化学性质较稳定的以氮为中
心的自由基，其醇溶液呈深紫色，在波长 514 nm
下具有最大光吸收［18］。如果样品能够使 DPPH
醇溶液吸光值下降，则说明样品的存在使得 DP-
PH的单电子被捕捉而颜色变浅，即具有较强的
自由基清除能力。本试验考察质量浓度分别为
6． 25，12． 5，25，50，75，100 μg /mL的 biruloquinone
的 DPPH·自由基清除率。以浓度为横坐标，清除
率平均值为纵坐标作图 2，从图 2 可知，biruloqui-
none在测试浓度范围内呈现较好的量效关系，根
据曲线方程计算其 EC50为 24． 91 μg /mL。在最大
浓度为 100 μg /mL 时，清除率达 90． 83%。随着
浓度的增加，清除能力增幅不大，趋于平稳。故当
biruloquinone质量浓度达到 100 μg /mL时，对 DP-
PH·自由基具有较强的清除能力。
图 2 Biruloquinone对 DPPH·的清除能力
Fig． 2． DPPH· scavenging activity of biruloquinone
2． 2 Biruloquinone清除 ABTS· +自由基及总抗
氧化能力
ABTS 在氧化剂作用下会氧化成绿色的
ABTS· +，在抗氧化活性物质存在时能够抑制
ABTS· +的产生。因此可以通过测定 ABTS· +在
734 nm处的吸光度值来计算样品的总抗氧化能
力。本试验考察浓度分别为 0. 15，0. 3，0. 6，0. 9，
1. 2，1. 5 mmol /L的 biruloquinone的 ABTS· +自由
基清除率。以浓度为横坐标，清除率平均值为纵
坐标作图 3。由图 3 可以看出，biruloquinone 在较
低的浓度下，随着浓度的增大，自由基清除能力迅
速增强，在 0. 15 ～ 1. 2 mmol /L浓度范围内呈现较
好的量效关系，根据曲线方程计算其 EC50 为
0. 488 mmol /L。在浓度为 1. 2 mmol /L 时达到最
大清除率 75. 39%，随后浓度继续增加，清除率不
再增强。
图 3 Biruloquinone对 ABTS· +自由基的清除能力
Fig． 3． ABTS· + scavenging activity of biruloquinone
以 Trolox浓度(mmol /L)为横坐标、抑制率为
纵坐标绘制标准曲线(图 4)。根据 Trolox 的标准
曲线方程及图 3 中 biruloquinone的曲线方程计算
得知，当样品测得的 OD 值和 1 mmol /L 的 Trolox
测得的 OD值相同，即自由基清除率同为 42． 57%
时，样品的浓度为 0. 4 mmol /L，因此 0． 4 mmol /L
biruloquinone的总抗氧化能力为 2. 5 TEAC，具有
较高的抗氧化能力。
图 4 Trolox的标准曲线
Fig． 4． The standard curve of Trolox
83
第 13 卷 第 1 期 代欢欢等:瘦柄红石蕊次生代谢产物 Biruloquinone的抗氧化作用研究
2． 3 验证试验结果
(1)Biruloquinone:UV － Vis 光谱(波长范围
400 ～ 900 nm)扫描结果见图 5。由图 5 可见，样
品在 517 nm 和 734 nm 处均未出现特征吸收峰，
虽然在 517 nm处有一定的光吸收，但在 DPPH体
系抗氧化试验中，DPPH·自由基清除率的计算已
去掉样品本身的吸光值，因此 biruloquinone 本身
不会对反应测定造成干扰。
图 5 biruloquinone的吸收光谱
Fig． 5． Absorbance spectra of biruloquinone
(2)DPPH 体系:UV － Vis 光谱(波长范围
300 ～ 700 nm)扫描结果见图 6。由图 6 可见，DP-
PH溶液(空白对照)在 517 nm 处出现特征吸收
峰，加入不同浓度的 biruloquinone 后，DPPH 溶液
在 517 nm处的吸收峰呈剂量效应的降低，且线性
关系良好，说明样品 biruloquinone 本身的颜色不
会对 DPPH反应体系的测定结果造成干扰。
图 6 加入不同浓度 biruloquinone后 DPPH的吸收
光谱的变化
Fig． 6． Changes in absorbance spectra of DPPH
with addition of different concentration biru-
loquinone
(3)ABTS 体系:UV － Vis 光谱(波长范围
400 ～ 900 nm)扫描结果见图 7。由图 7 可见，
ABTS工作液(空白对照)在 734 nm 处出现特征
吸收峰，加入不同浓度的 biruloquinone 后，ABTS
工作液在 517 nm处的吸收峰呈剂量效应降低，且
线性关系良好，说明样品 biruloquinone 本身的颜
色不会对 ABTS反应体系的测定结果造成干扰。
图 7 加入不同浓度 biruloquinone 后 ABTS 的吸收
光谱的变化
Fig． 7． Changes in absorbance spectra of ABTS
with addition of different concentration biru-
loquinone
3 结 论
将液体培养的瘦柄红石蕊地衣型真菌发酵液
用乙酸乙酯等体积萃取，采用硅胶柱层析法和氯
仿 －甲醇重结晶法分离纯化，得到化合物晶体，用
核磁共振(NMＲ)分析方法鉴定该化合物为 biru-
loquinone，用 DPPH·法和 ABTS· +法对 biruloqui-
none进行抗氧化试验研究。结果表明，在 DPPH
法中，biruloquinone 在测试浓度范围内呈现较好
的量效关系，当质量浓度达到 100 μg /mL 时，bir-
uloquinone对 DPPH·自由基具有较强的清除能
力，清除率达 90． 83%。在 ABTS 法中，biruloqui-
none在 0． 15 ～ 1． 20 mmol /L浓度范围内呈现量效
关系，在浓度为 1． 2 mmol /L 时，对 ABTS· +的清
除能力最强，达到 75． 39%。与阳性物质 Trolox
对照结果显示，biruloquinone 的总抗氧化能力为
2． 5 TEAC。根据文献报道和实际测定结果，维生
素 C的抗氧化能力为 1． 0 TEAC，鲜橙汁的总抗氧
化能力为 2． 2 TEAC，β-Carotene 的抗氧化能力为
93
菌 物 研 究 2015 年
2． 6 TEAC。由此可见，biruloquinone 具有一定的
清除自由基和活性氧等方面的能力，这种特性为
将瘦柄红石蕊的次生代谢产物 biruloquinone 开发
成为多靶点的抗 AD及治疗由过氧化胁迫引发疾
病的天然药物提供科学依据。
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