全 文 ：裂叶牵牛 psaH基因的克隆 、序列分析及其表达研究
郑成超　张宪省
(山东农业大学生命科学学院　泰安　271018)
摘要　从裂叶牵牛(Pharbitis nil Choisy)子叶的 cDNA 文库中 ,分离了一个 520 bp 的 psaH cDNA 克隆 , DNA 序列分析
表明其开放阅读框架由 144个氨基酸构成 ,包括 49 个氨基酸长的转运肽和 95 个氨基酸长的成熟 PSⅠH(subunit H
of photosystem Ⅰ)。利用 Northern杂交技术 , 发现在高等植物中 psaH 基因的表达明显地受内生昼夜节奏的调控 , 在
幼苗阶段呈现出组织特异性 ,并证明光是迅速启动 PNpsaH 基因高水平表达的重要因子。
关键词　裂叶牵叶 , psaH cDNA克隆 , 内生昼夜节奏调控 ,基因表达
Cloning and Characterization of a Circadian Rhythm_regulated
psaH cDNA in Pharbitis nil
ZHENG Cheng_Chao　ZHANG Xian_Sheng
(College of Life Sciences , Shandong Agricultural University , Taian 271018)
Abstract　A cDNA clone encoding a PS ⅠH subunit of photosystem Ⅰ from Pharbitis nil Choisy was charac-
terized with regard to its sequence and pattern in response to light treatments.The psaH cDNA contained an
open reading frame of 432 nucleotides encoding a 144 amino acid protein of approximately 16 kD which con-
sisted of a 49 amino acid transit peptide and a 95 amino acid mature PS ⅠH peptide.Northern analysis indi-
cated that the expression of the psaH gene was regulated by an endogenous circadian rhythm and light was a
key factor for promoting its transcription.Moreover , the level of psaH mRNA was rather different among
cotyledon , stem and root of the tested seedling.
Key words　Pharbits nil , psaH cDNA clone , Endogenous circadian rhythm , Gene expression
　　光合作用是地球最重要的生命活动过程之一 ,
它是由存在于植物叶绿体类囊体膜上的 6种蛋白质
复合体协同完成[ 1 ,2] 。其中光系统 Ⅰ(PS Ⅰ)作为复
合体之一在这一过程中起了关键作用。研究表明 ,
PS Ⅰ位于类囊体的非压缩区域(non_appressed re-
gion),它由至少 13种大小差异悬殊的多肽组成[ 3] ,
多肽之间的相互作用或某种多肽的突变均会影响
PS Ⅰ复合体的形成[ 4～ 6] 。编码这 13种多肽的基因
已分别从高等植物和藻类中克隆出来[ 3] ,根据发现
先后 ,将它们依次命名为 psaA ～ psaN ,其中 psaA 、B 、
C 、I 和J 存在于叶绿体基因组中 ,而其余存在于核
基因组中[ 2 ,3] 。PS ⅠH(subunit H of photosystem Ⅰ)
是由核基因 psaH 编码的分子量约 10 kD的膜周边
蛋白 ,与 PSⅠA 、PSⅠD接触 ,位于 PSⅠ的表面 ,并可
能与捕光复合体蛋白作用 ,但其功能不详[ 1 ,3] 。显
然 ,克隆 psaH基因 ,深入研究它的表达及调控 ,对阐
明PSⅠH的功能和进一步利用基因工程技术调控
psaH 基因表达进而调节植物的光合作用均有重要
意义。迄今 ,人们已从烟草[ 7] 、菠菜[ 8]和水稻[ 9]等植
物中分离出了 psaH 的 cDNA 克隆或核基因克隆 ,但
对它的基因表达研究不多。基于此 ,我们以裂叶牵
牛为材料 ,分离了一个 psaH cDNA 克隆 ,在 DNA序
列分析的基础上 ,着重探讨了该基因的时空表达 。
1　材料和方法
1.1　材料准备
裂叶牵牛(Pharbitis nil Choisy , Violet)原种由日
本东京Marutane公司提供。本实验所用材料为在校
园温室的自交种子 。
种子用浓硫酸处理 45 min ,流水冲洗过夜。(1)
播种于 26 ℃、连续光照(250 μmol·m-2·s-1)的生长
箱内 ,生长至第六天:①分别收获根 、茎和子叶;②移
入暗室中的无光照生长箱内处理 48 h ,每 4 h取样 1
次 。(2)播种于暗室中的 26 ℃无光照生长箱内 ,至
第六天:①在黑暗中收获黄化幼苗;②分别照光 1
min 、1 h和 10 h后同时收获幼苗 。
收稿日期:1998-07-15　接受日期:1999-01-18
植　物　学　报　1999 , 41(8):820～ 824
Acta Botanica Sinica
8 期 郑成超等:裂叶牵牛 psaH 基因的克隆 、序列分析及其表达研究 821　
1.2　方法
cDNA克隆的筛选 、DNA序列分析 、RNA提取和
Northern杂交分析按我们报道的方法进行[ 10 ～ 13] 。
2　结果和分析
2.1　psaH cDNA克隆的分离及序列分析
短日植物裂叶牵牛是研究植物光周期现象的经
典材料 ,为此我们构建了一个暗期诱导子叶的 cDNA
文库 ,在利用差异筛选法分离光暗差异表达的 cDNA
克隆过程中 , 分离到一个 520 bp 的 cDNA 克隆 。
DNA序列分析表明该基因编码 PS ⅠH ,故命名为
PNpsaH 。其开放阅读框架由 144个氨基酸构成 ,包
括49 个氨基酸的转运肽和 95 个氨基酸的成熟
PS ⅠH 。氨基酸序列比较发现 ,它与烟草 、菠菜和水
稻成熟 PS ⅠH 的同源性分别高达 93.7%、87.4%和
83.3%(图1),表明 psaH 基因在不同植物的基因组
中是非常保守的 ,成熟 PS ⅠH 多肽的结构和功能也
极可能是相似的 。然而 ,不同植物 PS ⅠH的转运肽
序列却差异很大(图 1),其原因尚待查明。
图 2　PNpsaH mRNA 在幼苗不同组织中的积累
Fig.2　Northern blot hybridization analysis of PNpsaH mRNA ac-
cumulation in different Pharbitis organs
Each lane contained 30 μg of total RNA isolated from cotyledons ,
stems , or roots of 6 d old seedlings.Hybridization with a ubiquitin
cDNA probe which served as a control for equal loading of RNA in
each lane.
2.2　PNpsaH 基因的组织特异性表达
为探明 PNpsaH基因在幼苗不同组织中的表达
情况 ,我们分别收获光下生长 6 d的幼苗的子叶 、茎
和根 ,进行 Northern 杂交分析。并用 Ubiquitin 基因
作探针检测电泳时 RNA上样量的一致性。结果表
明 ,在总 RNA 上样量几乎完全一致的情况下 ,
PNpsaH 基因在子叶中的表达极显著地高于其他组
织 ,特别是根中的 mRNA积累量极低 ,几乎检测不到
(图 2)。
为进一步研究 PNpsaH 基因的转录是否完全取
决于光照 ,我们还将暗中生长 6 d的黄化苗进行了
照光比较实验 。结果发现 ,黄化苗中已能检测到少
量的 PNpsaH mRNA ,1 min 的短时间照光便可迅速
增加 PNpsaH 的 mRNA 含量(图 3), 表明光是启动
PNpsaH 基因高水平表达的重要因子 ,但并非唯一因
子 。
图 3　光对 PNpsaH mRNA 积累的影响
Fig.3　Effect of light on mRNA accumulation of PNpsaH
Lane 1.Etiolated seedling grown in darkness for 6 d;Lane 2.1
min light exposure to the etiolated seedling;Lane 3.1 h light expo-
sure to the etiolated seedling;Lane 4.10 h light exposure to the e-
tiolated seedling.Each lane contained 30 μg of total RNA isolated
from the cotyledons with different treatments described above.Hy-
bridization to a Actin cDNA probe served as a control for equal load-
ing of RNA in each lane.
2.3　PNpsaH基因表达受内生昼夜节奏调控
植物的许多生命现象是属于昼夜周期性 ,即受
生物钟或近似昼夜节奏调控 ,如叶片运动 、气孔开
关 、呼吸作用 、光合作用 、细胞分裂等[ 14 ,15] 。已经证
明 ,参与光合作用的 Rubisco 、cab 基因的表达亦受到
内生昼夜节奏的调控[ 16～ 18] 。本研究发现 ,当 6 d幼
苗从光下移入暗中 , 在其后的 48 h 暗期阶段 ,
PNpsaH mRNA的积累呈现出精确的 24 h 周期性变
化 ,两个积累高峰分别在 12 h和 36 h(图 4),表明该
822　 植　　　物　　　学　　　报 41 卷
基因的表达也受内生昼夜节奏的调控。
图 4　PNpsaH mRNA 含量在幼苗 48 h 暗处理期间的动态变化
Fig.4　Northern blot hybridization analysis of PNpsaH mRNA levels for 48 h in extended dark treatment
Seedlings were grown in continuous light for 6 d and then transferred to darkness for 0 to 48 h.At the hours indicated , plants were harvested
and their RNA was isolated.Each lane contained 30μg of total cotyledon RNA.Hybridization with a Ubiquitin cDNA probe which served as
a control for equal loading of RNA in each lane.
3　讨论
PS ⅠH作为 PSⅠ复合体的成员之一 ,与参与光
合作用的 Rubisco 、PS ⅠA和 Lhc等一样 ,其氨基酸序
列在不同的植物种中有高度的同源性 ,一般均在
80%以上 。但 psaH 基因的保守性也因物种的亲缘
关系远近而略有差别 ,如裂叶牵牛(双子叶)与烟草
和菠菜(双子叶)PSⅠH 的同源性就比裂叶牵牛与水
稻(单子叶)PS ⅠH的同源性高(图 1)。与此相反 ,
psaH 基因的转运肽序列在不同物种间却差异很大 ,
几乎没有同源性 。
大多数植物基因的表达均受到植物发育程序和
环境因子的调控并具有组织特异性 。光影响植物生
长发育的许多过程 ,实质上是通过调控大量基因的
表达来实现的 。本研究证明 PNpsaH 的 mRNA 积累
量在子叶中最丰富 ,茎中次之 ,根中很少(图 2);光
是迅速启动 PNpsaH 基因高水平表达的重要因子
(图 3),这些结果与在烟草上的研究具有类似趋
势[ 6 ,17] 。这种组织特异性表达和光调控现象恰好与
植物的光合器官 、光合作用相吻合 。
近似昼夜节奏(生物钟)调控许多生命现象 ,尽
管钟基因 frq 和per 已分别从果蝇和脉胞菌中克隆
出来[ 20] ,但在植物上至今没有克隆到钟基因[ 21] ,以
致难以阐明其机理。近年来一些研究证明 ,许多基
因的表达明显受植物内生近似昼夜节奏的影
响[ 10～ 13 , 17 ,18] ,并分离到了可能的顺式作用元件[ 22] 。
本研究发现高等植物中 PNpsaH 的 mRNA积累量亦
受到内生近似昼夜节奏的调控 ,且两个积累高峰恰
好在光暗转换后的第 12 h和第 36 h(图 4),这与我
们先前报道的受内生昼夜节奏调控的 HMG1 和
PNZIP 等基因的表达时间有所不同[ 11 ,12] ,表明植物
由光下转入暗中 ,虽然不同基因表达的周期长度基
本不变 ,但节奏相位不一致 ,这可能与基因的调控途
径不同有关。由于 HMG1 和 PNZIP 是分别含有
HMG 盒和亮氨酸拉链结构域的 DNA 结合蛋
白[ 11 ,12] ,作为核基因转录因子 ,它们是否与 PNpsaH
基因之间存在某种调控关系 ,尚待进一步查明。基
于植物光合作用受内生近似昼夜节奏影响的事实 ,
我们推测编码 PS Ⅰ和 PS Ⅱ的其他基因的表达也可
能同样受内生近似昼夜节奏调控 。显然 ,该领域的
进一步深入研究将对揭示植物光合作用实质和生物
钟调控现象具有重要意义。
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