全 文 ：中国药理学通报 i的2 年 第 8卷 第 i期
令论著令
人工培养冬菇菌丝体中抗血栓形成
成分的分离和生物学性质
台内自尝窝含六之吕肉
程桂芳 杨永春 刘大培 白金叶 田金英 朱秀媛
( 中国 医学科学院 药物研 究所 北京 1 0 0 0 5 0)
提要 从人工培养冬菇菌丝体 中用 阳离子 交换纤维 素层析分离 , 获得
一种具有杭血检形成作用 的蛋 白质 , 分子量为 1 . 7 5 X I 。 ` u , 等电点 为4 . 3 , 给
大鼠 i v 1 0一 “ nr o l / k g , 能 完全预 防体外血检形成 , I C 。 。为 4 . 4 x 1 0一 , m ol /
k g
。 无论是体 内或体外 , 都具 有对杭胶原引起的血 小板聚集作用 , 体外全
对抗浓度 为 7 . 5 x i 0一 ` m o l / L , 其 I C 。 。 为 4 x i o一 “ m o l / L , 体内剂量 1 . 2 5
x 1 0一 “ m ol / k g ( iv ) 时 , 血小 板聚集抑制率可达 60 % , 抗血凝的 最 低浓
度 为 3 X 1 0一 m o l / L 。
关键词 冬菇菌丝 体 抗血栓形成成分 杭血小 板聚集 抗凝血作用
t内六兑(自t`山两t
冬菇 , 又名构菌 ( F l a m m u l i n a v e -
l u t i p e s )
, 为食药兼用菌 。 近年 来 , 国
外对其化学和药理作用研究较多 , 据报道
菌丝体 内含有多种生理活性成分 , 如抗实
验性肿瘤作用的多糖 〔 ’ 〕 、 增强机体 免 疫
功能的糖肤 二 2 二、 促使红细胞聚集的 凝 集
素 二 s 〕等 , 我们研究发现 , 菌丝体内 还 有
对实验性炎症有较强抑制作用的多糖和抗
体外血栓形成作用的蛋白质 。 本文仅报道
抗血栓形成成分的分离 、 生化性质及生物
学活性 。
材料和方法
1 材料
1
.
1药品 冬菇菌丝体 , 本所生物合成
室王淑芳副研究员提供 ; C M C e l l u l o s e
C M 5 2系 W h a t m a n产品 ; S e p h a d e x G
一 1 0 为 S电m a 产品 ; 蛋 白质标准品 , 除牛
血清 白蛋白为上海长阳制药厂产品外 , 其
余为 P h ar m ac ia 产品 ; 化学试 剂 皆为国
产品 , 分析纯 。
1
.
2 仪 器 体外血往形成 仪 ( S D Z -
A 皿型 , 江苏无锡 电子仪器二厂产品 , 血
小板聚集仪 ( T 6 26 D S , 日本 ) , 液 相
层析仪和等电点聚焦 电泳仪 ( P h ar m ac ia
公司 ) 。
1
.
3 动物 体重 20 0~ 26 0 9 古性W i s -
t a r大鼠 。
2 方法
2
.
1 冬菇蛋 白质分离纯化 新鲜的人
工培养冬菇菌丝体 2 5 0 9 , 加磷酸 缓 冲 液
( 0
.
1 5m o l / L
, p H 7
.
4 ) l 0 0 0 m l 匀 浆 ,
4 ℃放置过夜 , 次 日离心 , 13 0 0 x g’
1 0二 i n , 上清液约 1 0 0 0 m l , 加 醋 酸 锌
( o
.
s m o l / L ) 1 0 0m l
, 同上离心 , 上 清
液加固体硫酸钱 , 使其饱和度达 60 肠 , 放
置 16 h后离心收集沉淀 , 用 水 约 60 m l 溶
解 , 对水透析 , 1 0 0 m l 又 3 , 截留 液 冷
冻干燥 , 得 0 . 3 6 9 ( 0 . 1 4 肠 ) 。
取冷干物 0 . 1 9 , 溶于碳酸氢 钱 ( 0 . 05
m o l / L ) 2 m l 中 , 上 C M C e l l u l o s e
C M
一 5 2柱 ( 2 . o x 4 o e m ) , 预先 以 上 述
溶液平衡 , 再以相 同的溶液洗 脱 , 流 速
o
.
4 m l/ m in
, 收集第一峰 , 冷冻 干 燥 ,
得 1 0m g ( 1 0肠 ) , 继 用 S e p h a d e x G -
10 0 柱 (1. 5 0 汉3 3 e m )预先 用 Tr is 一H C I
缓冲液 (0. 05 mo l/ L , p H 7 . 5 , 含 0 . 2
m ol / L K C I )平衡 , 相同缓冲液 洗 脱 ,
流速 0 . 4 m l/ m in , 得一单峰 , 对水透 析 ,
5 0 m l 火 3 , 截留液冷冻干燥 , 得 冬 菇蛋
白质 s m g , 以菌丝体为起始物 计 算 , 总
得率为 0 . 0 0 1 2肠。
2
.
2 冬菇 蛋 白质分子量测 定 用凝胶
过滤法测定 t 4 〕 , 取冬菇蛋白质和蛋 白 质
标准品 ( 细胞色素 C 、 胰蛋白酶抑制剂 、
卵清蛋白及牛血清 白蛋 白 ) 各 2 二 g , 分
别溶于 T ir s 一 H C I缓冲 液 ( 同 上 ) , 用
S e p h a d e x G 一 1 0 0层 析 , 流 速 0 . 4 m l /
m i n
, 用标准蛋白质洗脱体积对其分子量
对数作图 ,得一曲线 ,根据冬菇蛋 白质洗脱
体积查 出其分子量 。
2
.
3 冬菇蛋 白质等 电 .毅测 定 以等 电
聚焦电泳法测定冬菇蛋 白质的等 电点 , 凝
胶浓度 10 肠 , 蛋白质浓度 1 9 / L加样 2 0司 ,
电泳条件 : 功率 I J s/ · c m 一 ’ , 聚焦 Z h,
。 . 2肠考马斯亮蓝 R一 2 50 染色 , 由冬 菇 蛋
白质显示的区带与标准蛋白质区带及胶板
上的 p H分布比较 , 可知冬菇蛋白质 的 等
电点 。
2
.
4 冬菇蛋 白质氛基酸含量测 定 冬
菇蛋 白质 以H C I ( 6 m o l / L ) 于 1 2 0℃ 水
解 2 4 h , 用 日本 L 8 5 0 0氨基 酸分析仪 进 行
氨基酸定量 。
2
.
5 冬菇蛋白质杭凝血作用 用白陶
土部分凝血活酶时间法 “ 〕观察冬菇 蛋 白
质抗凝血作用 , 冬菇蛋 白质浓度为 10 、 ’ ~
1犷 ` m ol / L ,以白陶土颗粒聚集时间长 短
作为指示其作用强弱的指标 。
2
.
6 冬菇蛋 白质杭血小板聚集试验
按文献 〔 。 ’ 方法进行 , 聚集诱导剂为胶原 ,
由大鼠腹部皮肤制备 , 浓度为 5 肠 。 体外试
验时冬菇蛋 白质浓度 1 0 一 “ 一 1 0一 ` m ol / L ,
体内试验由静脉注射 , 剂量 1 x l o “ “ 和
i , 2 5 x 1 0一 ` m o l / k g
, 借助血小板聚集 仪
观察并描记透光率的变化 , 判定血小板聚
集的程度 。
2
.
7 冬菇蛋 白质对杭体外血检形成作
用 将大鼠分为 5 组 , 每组 4 ~ 5 只 , 一
组为对照组 , iv 生理盐水 , 其它 4 组分别
iv 不同浓度的冬菇蛋白质 , 15 o in 后 由腹
主动脉取血 3 m l , 立即向环形管 内灌 注
Z m l
, 将管的两端接合 , 置 37 ℃ 恒 温 的
血栓形成仪的旋转台上旋转 , 7 o r / m i n ,
10 m in
, 转毕 , 取出环形管 , 倒出血液 ,
测量生成的血栓长度及湿重 , 再置血栓于
60 ℃恒温箱中加热 Z Om 至n , 烤干 , 称重 。
结果与讨论
1 冬菇蛋白质的生化性质
图 1和图 2 表 明 用 C M C e l l u l o s e
C M 一 5 2和 S e p h a d e x G 一 1 0 0从冬菇 菌 丝
体中获得一种蛋 白质 。 凝胶过滤法测得分
子量为 1 . 75 又 1 0 ` ( 作者曾用 S D S一 聚 丙
烯酞胺凝胶 电泳测得相似的结果 ) , 等 电
聚焦电泳表明为单一带 , p 4I . 3 , 分子 内
含 14 种氨基酸 , 特别富含 谷 氨 酸 ( 17 . 2
% )
、 天冬氨酸 ( 1 6 . 1肠 )和苏氨酸 ( 1 0 . 2
% )
。
冬菇班白及
洗脱时 a(1 《 h)
图 1 二一 冬菇蛋白质的阳离子交换纤维素 C M 一 5 2
层析图谱
根据冬菇蛋白质提取条 件 、 纯 化 分
部 、 物化性质 、 生物学作用及初 步 毒二性
( 未表明 ) 等的比较性分析 , 提示冬菇蛋
白质与 已报道 的活性成分 , 如 多 搪 、 搪
妥 6 0
, m 0 1/ L
洗脱体积 ( m .
.U二峨
à份.橄
2
.
5 5
.
0 10
图 2 冬菇蛋白质的 S e p五a d e x G一 1 0 0层析图谱
ǎ次à.共获
肤 、 凝集素 、 构菌毒素 〔 7 二 及 构 菌 蛋 白
原 〔 6 〕等不同 , 是一种具有新药理活 性 的
成分。
2 冬菇蛋 白质的生物学活性
2
.
1 杭凝血 活性 当冬菇蛋 白质浓度
为 3 x 1 -0 “ m ol / L 时能完全抑制 兔 白 陶
土部分凝血活酶活性 , 放置 24 h也 未发生
凝集 , 提示冬菇蛋白质 可影响内源性凝血
系统中的凝血因子 。
2
.
2 抗血小板聚集作用 冬菇蛋白质
浓度在 1 0 -一 s x z o一 “ 二 0 1/ L 范 围 内 ,
可抑制体外由胶原引起的血小板 聚 集 作
用 , 7 . 5 x l o ~ ’ m ol / L 时 , 则完全抑 制 ,
其 IC 。 。为 4 x z o 一 “ m o l / L ( 图 3 ) , 体
内 i v l . 2 5 x l o 一 “ m o l / k g时 , 对血小板聚集
抑制率达 60 % , 但 10 “ ” m ol / k g时 的抑 制
率仅 10 肠 , 提示冬菇蛋白质抗血小板聚集
有效剂量范围较窄 。
2
.
3 抗体外血检形成作用 大鼠 iv 冬
冬菇蛋自质浓度 ( 火 1 -0 “二 o1 / L )
图 3 冬菇蛋白质对大鼠由胶原致血小板聚集
的抑制作用 ( n 二 4 )
菇蛋白质 7 . 5 x l 。 ~ ’ m ol / k g , 可明显减轻
血栓形成的重量 、 缩短血栓形成 的 长 度
( 见 表 ) , 1。’ 6 m ol / k g完全抑制血 栓 的
形成 , I C 。 。为 4 . 4 火 2 0一 ’ 。 0 1八 g ( 见 图
4 )
。
2
.
5 5
.
0 ! 乃
.
J
冬菇蛋白质剂量 ( 火 10“ 7m ol k/ g )
图 4 冬菇蛋白质对大鼠体外血栓形成的抑制
作用 ( n 二 4 )
附表
剂 量
冬 菇蛋白质对大鼠体外血栓形成的影响
血 栓 形 成
重
g口
干(
( 1 0
一 7 m o l /k g )
2
. 弓
长 度
(
e m )
5
.
0
7
.
5
1 0
.
0
对 照
3
.
4 0士 1 . 42
2
.
4 0士 1 . 6 0
0
.
2 0士 0 . 20 .
O
.
4
,
14 士 1 . 08
4 9
.
6 7土 3 3 . 5 0
2 7
.
40士 1 9 . 14
4
.
9弓土 5 . 7 6 .
O
.
弓1 . 0 2土2 1 . 68
八J月峪峥1é眨」
与对照组比 , ’ P < 0 . 0 0 1
,2 3
·
专
综上结果可见 , 冬菇蛋白质具有较强
的抗体外血栓形成作用 , 无论是体外或体
内都观察到抗血小板聚集作用 , 在低于 5
X 10
“ `
m o l / L 时未见溶血现象 , 这 表 明
冬菇蛋 白质抗血栓形成作用并非因破坏红
细胞膜所致 。 冬菇蛋白质对血小板功能抑
制作用机理将进一步探讨 。
( 徐理纳教授对药理部分给予指 占、 ,
王建平同志 给予技 术帮助 , 肖 月霞同志完
成氛基酸 定量分析 , 谨致谢意 。 )
参考文献
1
.
Y
u k o Y
,
T o m o k o S
,
T e t s u r o 1
.
C h
e m P h
a r m B
u
l l
,
19 7 3; 2 1 ( 8 )
: 1 7 2 2
2
.
o t
a g i r i K
,
T e t s u o o
,
T e t s u r o 1 e t
a 1
.
J P h a r m D y
n , 1 9邪 ; 6 : 9 6
3
.
M a s a o T S U D A
.
J B i o e h
e
m
,
1 9 7 9 ;
86
: 14 6 3
4
.
A n d r e w s P
.
B i o e h e m 丁, 1 9 64 ; 9 1:
2 2 2
5
. 徐叔云 , 卞如流 , 陈 修主编 . 药 理 实
昨方法学 . 北京 : 人 民卫生出版社社 , 1 982 : 8 36
6
. 阮长耿主编 . 血小板一基础 与临床 . 上
海 : 上海科技出版社 , 19 87 : 2 39
7
.
A l
a n
W B
,
J
o e
! D O
.
T o x i e o n
,
19 8 7 ; 2弓( 11 ) : 1 1 4 5
8
.
T
e t s u r o l
,
H i r o f
u rn i 入笙, T e t s u j i M
e t a l
. 工p n 丁 C a n e e r R e s ( G a n n ) , 19 9弓;
7 6 : 1 4 2
1 9 91久 2 月 1 1巨收稿 , 同年 9月 2弓日第 2次修回 )
呀
.
.
.
! S O L A T ! O N A N D P H A R从 A C O LO G ! C A L A C T I V ! T ! 〔 5 O F
A N A N T ! T日 RO 从 B U S P RO T E IN 厂R O 爪
F L A 从从 U L! N A V〔 L U T I P E S
C h e n g G u i f a n g
,
Y a n g Y o n g e h u n
,
L i u D a p e i e t a l
( I
n s t i t u t e o f 入l a t e r i a M e d i e a , C h i n e s e A c a d e m y o f M e d i c a l
S
。 i e n e e s , B e i j i n g 10 D0弓0 )
A b s t r a c t
A P r o t e i n d e s i g n a t e d a s F l a m tn u l i n a V e l u t i p e s ( F V ) P
r o t e i n w a s
1 5 o l a t e d f r o m t h e e u l t u r e d m y e e l i u m o f F V a n d p u r i f i e d t o h o m o g e -
n e i t y b y C M e e l l u l o s e C M 5 2 a n d g e l f i l t r a t i o n e h r o rn a t o g r a p h y
.
T h e m o l e e u l a r w e i g h t o f F V p r o t e i n w e r e f o u n d t o b e 1
.
7 5火 1 0 4 u
w i t h p l 4
.
3
.
A m i n o a e i d a n a l y s i s o f F V p r o t e i n i n d i e a t e d t h e p r e -
5 e n e e o f 一4 k i n d s o f a m i n o a e i d s , e s p e e i a l l y r i e h i n G l u , A s p a n d
T h r
.
P o t e n t i n h i b i t
o r y e f f e e t o f F V p r o t e i n o n t h r o m b u s f o r m a t i o n
i n t h e b l o o d w a s o b s e r v e d i n v i 士r o w h e 且 r a t s w e r e g i v e n i n t r a v e n o -
u 5 1了 . T h e l e n g t h o f t h r o m b t s w a s s h o r t e n e d a n d t h e d r y w e i g h t o f
t h e t il r o m b u s d e e r e a s e d s i g n i f i e a n t l y a t t h e d o s e o f 7
.
s x z o 一 7 m o l / k g
.
T h r o m b u s f o r m a t i o n w a s e o m p l e t e l y i n h i b i t e d a t t h e d o s e o f 1 0
一 “
m o l / k g
.
T h e I C 。 。 w a s f o u n d t o b e 4
.
4 x i 0
一 7
m o l / k g
.
F V p r o t e i n
w a s s h o w n t o i n h i b i t e o l l e g e n i n d u e e d a g g r e g a t i o n o f r a t P l a t e l e t s
b o t h i n v i t r o a n d i n v i v o
.
I t s e o n e e n t r a t i o n f o r e o m p l e t e i n h i b i t i o n
i n v i t r o w a s 7
.
5 x i 0一 5 m o l / L
.
T h e I C
。 。 二 a s f o u n d t o b e 4 x l o 一 “ m o l /
L
.
H o w e v e r
,
F V p r o t e i n d o s e o f 1
.
2 5 x 1 0一 ” m o l / k g w
a s : e q u i r e d
f o r 6 0% i n h i b i t i o n i n v i v o
.
K e y w o r d s
:
F l a m m u l i n a V e l u t i P e s
;
A l t i t h r o m b u s f o r m a t i o n
;
p l a t e l e t a g g r e g a t i o 仓