全 文 ：植 物 学 报
通 e t a B o t口 n ie口
1 9 9 2
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: 4 0 ,一 4 0 9
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天麻大型细胞消化蜜环菌过程中
溶酶体小泡的作用
王 贺 许京秋 徐锦堂
(中国医学科学院药用植物资源开发研究所 , 北京 1 00 。 , 4 )
摘 要
蜜环菌 ( A r川 滚l l a r i a m e l l , a F r . ) 菌丝由天麻 ( G a s t r o d ` a o l a t a B I · ) 皮层细胞经纹孔侵
人大型细胞 。 初期大型细胞的原生质膜凹陷 , 同时细胞 壁产生乳突状加厚阻止菌丝侵人 。 当菌
丝侵入大型细胞以后 , 凹陷的质膜将菌丝紧密包围 ,大量由单位膜围成的小泡聚集在其周围 。
随后这些小泡的膜与质膜融合并将其内含物释放到菌丝周围的空间中 , 凹陷质膜逐渐膨大成
为一个包围菌丝的消化饱 。 小泡和消化泡中均具酸性磷酸酶活性反应产物 , 证实其分别相当
于植物溶酶体系统中的初级和次级溶酶体 。 菌丝在消化抱中被彻底消化 。
关键词 天麻 ;蜜环菌 ;溶酶体小泡
R O L E O F L Y S O S O M A L V E S IC L E S I N T H E D IG E S T IV E P R O 一
C E S S O F A R 几叮L L A R I A 俐吸乙L E A B Y T H E L A R G E
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·
本文于 1 9 9。 年 7 月收到 , 同年 9 月收到修改稿。
植 物 学 报 3峪 卷
K e y w o
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天麻 (G a了 t r o d i a e l a r a B I. ) 依靠消化侵人其细胞内的蜜环菌 (A rm f l l a r i a 。 , l l e a
罗 r , ) 获取异源营养的奇特营养方式已有不少研究报道 。 一些学者认 为蜜环菌丝环能侵
人中柱细胞是由于中柱外围一层特化的大型细胞能将菌丝彻底消化 〔, .6, , .l3 , ;也有学者认为
大型细胞只有部分消化功能 , 其与若干皮层细胞相互协作才能彻底消化蜜环菌 L` ,l0 ’ ; 还有
学者报道大型细胞中无生活菌丝侵人 , 其主要功能是吸收和合成 1[, 刀。 究竟大型细胞有何
种功能 ,它以什么方式消化真菌 , 迄今尚未得到充分阐明 。 本文用细胞内酶的化学定位与
细胞形态学相结合的方法 , 研究了大型细胞消化真菌的过程 。
材 料 和 方 法
本实验选用人工室内培养的接菌良好的新鲜天麻为材料 , 横切其皮层部位获 得 0 . 3
二 m 厚的组织片 , 立即将其投人到 50 m m o l / L 二甲肿酸钠缓冲液配制的 4多甲醛和 2 . ,多
戊二醛混合液中 ( p H 7 . 2 ) , 室温下 固定 乙 5 小时 , 再经 2多饿酸后固定 , 用通常方法脱水
包埋于 E p on 8 12 树脂中。 超薄切片经醋酸铀和柠檬酸铅染色 , 用电镜观察 。 l 那m 厚的
薄切片经 P A S 反应一甲苯胺蓝染色或固绿单一染色 , 显微镜观察 。 酸性磷酸酶的显微
细胞化学定位采用 G o m or i 的方法『3 ,。 对照设两个 : ( l) 反应液中加入 D. 0 1m ol / L 氟化
钠 ; ( 2 )反应液中不加底物 户甘油磷酸钠 。 酶反应处理完毕 ,材料经系列正丁醇脱水包埋
于 G M A 树脂中「8] , 制成 l 产 m 厚的薄切片 , 一般不经染色直接观察。 少量石蜡切片材料
为 F A A 固定液固定 , 番红一固绿双重染色。
观 察 结 果
接种上蜜环菌的天麻从横切面观察 , 可见侵人的菌丝主要位于大型细胞 叨 和数层皮
层细胞内 。 这些染菌的细胞从外至内可明显地分为三类 (图版 I , 1 ) : 靠外面的 1一 3 层细
胞为多角形 , 其内菌丝较粗并缠绕成结 , 称为菌丝结细胞 ;中间一层细胞的径向壁多被菌
丝冲毁 , 其内菌丝较细并多呈束状排列 ,称为菌丝流细胞 〔气 最内一层细胞明显比外面两
类细胞的形态大 ,排列整齐 , 原生质浓厚 , 具膨大的畸形核 , 特称之为大型细胞 〔1] , 其内菌
丝由靠近菌丝流细胞一侧的细胞壁侵人 , 菌丝轮廓开始较细 , 后来逐渐变粗 , 最后成为不
规则一团消失在大型细胞中 , 蜜环菌不能进一步向内侵人中柱区 。 大型细胞与蜜环菌相
互作用的过程可分为以下两个阶段 。
(一 ) 阻滞阶段
大型细胞在菌丝即将侵人之前 ,体积开始增大 , 原生质变浓 , 贮藏淀粉粒变小并逐渐
消失 , 细胞核膨大最后形成多个基部相连的更新核 〔l] 。 当菌丝流细胞中的菌丝通过纹孔
进人大型细胞壁的内侧以后 ,大型细胞原生质膜凹陷 , 其内侧的细胞壁产生乳头状突起 ,
形成一很厚的鞘层将菌丝先端包围阻止其侵人 (图版 I , 3 ) 。 由图版 I 图 3 中位于细胞内
部的菌丝形态可以看出 ,随着菌丝的逐渐侵人其直径看起来愈来愈细 , 这可能是围绕菌丝
的鞘层愈来愈薄所致 。 对图版 I 图 3 中菌丝的侵人点的电镜观察发现 , 此时进人细胞的
王 贺等 : 天麻大型细胞消化蜜环菌过程中溶酶体小泡的作用
菌丝被大型细胞凹陷的原生质膜紧密包围 , 此膜内侧与菌丝细胞壁之间围绕着由很多片
层状物质组成的鞘层 (图版 I , 4 ) ,这一鞘层与大型细胞的壁相连 。 这种质膜包围侵人的菌
丝的结构与兰科其它内生菌根的研究结果相同叫 , 而围绕菌丝的鞘层结构与有的学者在
天麻皮层细胞中观察到的包 围菌丝的囊状体相似【10J 。 完全进人大型细胞内的菌丝从横切
面观察仍为一层完整的质膜所包围 (图版 H , 1 2 ) ,对照图版 I 图 4 不难判定其为大型细胞
质膜进一步凹人所形成 。 此时菌丝仍具很强的活力 , 内部具浓厚的原生质 。 因此尽管它
受到凹 陷质膜及鞘层的束缚仍能继续向内侵人 。
(二 ) 消化阶段
随着菌丝的侵人 , 与其接触的大型细胞的质膜不断凹陷并将刺激传给内部的原生质 ,
原生质变得十分浓厚 ,其中产生很多小颗粒将菌丝先端包围 ,菌丝轮廓明显增粗呈试管刷
状 (图版 I , 2 ) 。 这预示大型细胞主动消化蜜环菌的阶段开始 。 用显微镜观察这些围绕菌丝
的颗粒直径为 。 . 2一 0 . 4 那 m , 电镜观察发现这些颗粒为单位膜包围的小泡 (图版 H , 13 、 1 4 ) ,
这与动物白细胞中初级溶酶体的结构相似「, 91 。 通过对溶酶体的标志酶酸性磷酸酶的定位
观察发现 , 小泡内具十分浓密的酶反应沉淀 (图版 H , 9 、 1 1 ) 。 因而从结构特征和细胞化
学定位两个方面可以判定 : 这种颗粒为植物溶酶体系统中的初级溶酶体叫 。 值得注意的
是 ,在菌丝结细胞 、 菌丝流细胞和未被侵染的皮层细胞中均未观察到如此致密的溶酶体颗
粒 , 这种情况为正处于消化阶段的大型细胞所特有 。 依据显微镜下菌丝外围溶酶体形态
的大小变化 , 可将菌丝被消化的过程分为 3个连续时期 : 1 . 颗粒时期 : 消化初期聚集在
菌丝外围的溶酶体形态较小 , 直径约 0 . 2 拜 m , 用显微镜观察为颗粒状 , 从菌丝纵切面观
察 , 可见致密的颗粒在其两侧各形成宽约 4 拜 m 的颗粒区 (图版 I , 2 、 5 、 6) 。 酸性磷酸酶
定位显示 , 致密的酶反应棕黑色沉淀主要位于大型细胞中菌丝两侧的颗粒区 , 没有颗粒包
围的菌丝及其外围无酶反应沉淀 (图版 H , 8 ) , 仔细观察可见酶反应沉淀只限于颗粒的内
部 (图版 1 , 8 、 9 、 1 1 ) 。 用固绿单一染色发现最初菌丝表面光滑其外围聚集很多黑颗粒 , 后
来一些颗粒附着到菌丝表面使其轮廓呈细锯齿状 (图版 I , 7 ) 。 电镜照片显示菌丝周围密
集的颗粒为很多单层膜包被的小泡 ,它们聚集在菌丝外围 (图版 1 , 1 3 ) , 进一步放大可见
很多小泡的被膜与质膜融合 , 以胞吐的方式将其 内含物释放到凹陷质膜所围成的胞外空
间中 (图版 1 , 14 ) , 由于水解酶的作用菌丝结构已变得模糊不清 , 由饱满的圆形变为扁
形 。 小泡与质膜融合释放内容物的现象在菌丝结细胞中不明显 , 也未见到大型细胞中其
他部位的质膜像包围菌丝的质膜那样 与众多小泡发生 紧密的联系 。 2 . 小泡时期 : 随着溶
酶体颗粒不断与凹陷的质膜融合以及颗粒之间相互合并 ,原来菌丝外的致密颗粒减少 , 而
颗粒直径由 .0 2 那 m 增大到 1 . 6一 2 . 4声 m , 用显微镜观察其为清晰的泡状结构 ,呈 l一 2 层
聚集在菌丝外围 (图版 I , , 、 6 )。 酸性磷酸酶定位证明此时小泡中包含浓密的酶反应沉淀 ,
其与包围菌丝的质膜融合使菌丝周围也具酶反应沉淀 , 并且菌丝轮廓由细锯齿状变为粗
锯齿状 (图版 H , 1 1 ) ,这表明菌丝周围的酸性磷酸酶来自大型细胞的溶酶体小泡。 3 . 消化
抱时期 :从图版 I 图 5 和图 6 两个连续切片可以发现 , 随着菌丝被众多小泡包围以后再向
前侵人 , 菌丝先端即为一个液泡包围 。 推测这是由于众多较大的小泡与凹陷的质膜融合
导致质膜表面积增大 , 最终形成一包围菌丝的液抱 ,特称之为消化 泡 (图版 I , , 、 6 ) 。 酸性
磷酸酶定位显示消化泡 内具致密的酶反应沉淀 , 并有小泡继续与消化泡膜融合向其中释
植 物 学 报 3 4 卷
放水解酶 (图版 1 , 9) 。 从结构特征和酶的分布可 以看 出消化泡相当于溶酶体系统中的次
级溶酶体 。 菌丝在消化泡中被彻底消化并为大型细 ha 吸收利用 。
以上观察表明 , 溶酶体小泡在大型细胞主动消化蜜环菌过程中起了重要作用 。 当质
膜凹陷包围侵人的菌丝以后 , 大量初级溶酶体小泡与之融合将水解酶释放到菌丝所处的
胞外空间中。 这样既消化了菌丝以获取异源营养 ,又保持了细胞膜的完整性 , 防止水解酶
接近和损害自身的细胞质 。 因而大型细胞具有不断消化蜜环菌的能力。
讨 论
自从植物溶酶体的概念提出以来 ,随着研究的深人 ,人们对溶酶体在植物细胞中的作
用认识不断加深 。 已经证明植物溶酶体在细胞内自身物质的分解转化 (即自体吞噬 ) 、 种
子萌发过程中贮藏物质的利用以及细胞 自溶过程中起重要作用 t “ , .1, 15, 17 ,18 。 溶酶体最早从
动物细胞中发现 , 其主要功能之一是消化吞入细胞内的病原物即异体吞噬作用 〔川。 高等
植物细胞的溶酶体系统是否具有类似作用 , 文献报道尚不多见 。 本文所报道的天麻大型
细胞中溶酶体与凹陷质膜融合 , 释放水解酶消化蜜环菌的过程与动物多形核白细胞中溶
酶体消化吞人细胞内细菌的过程相似 〔` ” 。 T r u 。 h e t 和 C o u l o m d ( 1 9 7 3 ) 曾报道豆科根瘤
细胞中类菌体的分解与寄主细胞中溶酶体释放水解酶有关 【` 5〕 , 但只有衰老的根瘤细胞中
才发生这种现象 ,并且根瘤细胞也随后 自溶 。 这可能是细胞衰老所致 ,与天麻大型细胞中
的情况不同 。 有的学者曾报道天麻皮层细胞由于菌丝的侵人导致小液泡破裂 , 释放水解
酶将细胞 自身和菌丝一同水解 , 并由此得出结论 : 皮层细胞以过敏性坏死的方式消化蜜
环菌 ;大型细胞以吸收和合成作用为主比刀 。 我们在天麻大型细胞中未发现过敏性坏死现
象 , 大型细胞通过溶酶体小饱主动消化蜜环菌的同时仍保持自身的活力 ,正由于大型细胞
具有这种特性 , 才能使蜜环菌的侵染只限于中柱外围。 因此我们认为大型细胞在抵御和
消化蜜环菌过程中起重要作用 。
曾有学者报道 , 只有通过皮层细胞与大型细胞的相互协作才能完成对菌丝消化的全
过程 , 即若干皮层细胞首先将菌丝细胞壁消化掉 , 然后大型细胞对裸露的菌丝原生质碎段
进行彻底消化 4[, 1。」。 通过对本文图版 I图 2 和图 3 中菌丝的显微图象以及图版 I图 4 和
图版 n 图 12 中菌丝的内部结构进行分析 ,不难看出完整的 、生活的菌丝能够直接由菌丝
流细胞进人大型细胞 , 并在其中被彻底消化 ,在此之前菌丝未被预先脱去细胞壁 。 徐锦堂
等 ( 1 9 9 0 )曾报道菌丝流细胞中的菌丝可以通过纹孔侵人大型细胞 〔9] 。
参 考 文 献
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图 版 说 明
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. 细胞壁 D V . 消化泡 G . 颗粒 H . 菌丝 H C , 菌丝结细胞 H F . 菌丝 流细胞 H C W . 菌丝细胞壁
L .c 大型细胞 P L . 原生质膜 5 . 鞘层 V . 小泡 v M . 小泡膜
1
. 染菌块茎的部分横切面 ,示 3 类不同的染菌细胞层 。 x 156 2 .大型细胞局部 , 示入侵的菌丝开始被密集 的颗
拉包围 。 又 17 , 0 3 、 .4 大型细胞局部 ,示 入浸的菌丝被凹陷质漠及鞘层包围 。 3 . x 17 5o 4 . 只 6 0。。。 5 、 6 ·两个连续
切片显示菌丝被溶酶体消化的全过程 , 即颗粒期 、小泡期和消化泡期 。 义 1 7 , 。 .7 固绿染色显示颗粒由菌丝外围附着
到菌丝表面 。 X 1 7亏O
.8 酶定位制片 , 示大型细胞中酸性磷酸酶活性的分布 (箭头 ) 。 火 17 5 。 , . 酶定位制片稀固绿衬染 ,示菌丝周围和
消化泡中酸性磷酸酶活性的分布 (箭头 ) 。 x 17 ,。 l。 、 1卜酶定位制片 ,示菌丝被消化的颗粒期 (图 l帅和小泡期 (图
渔1 )酸性磷酸酶活性的分布 (箭头 ) 。 只 1 75 0 12 .阻滞阶段大型细胞中菌丝的横切面 , 示包围菌丝的质膜和梢层 。 火
3 5 0 0 0 13
·消化初期菌丝外聚集 很多由单位膜包被的小 泡。 火 1。。。 。 l 峪. 很多小泡与包围菌丝的质膜融合将其内含
物释放到菌丝周围空间中 。 只 30 0。。
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r五e p l a s功 a l em m a a n d s h e a r h s u r o u n d i n g a h y p h a . x 35 0 0 O F 立9 . 13 . M a n y v e s i e l e s l im i丈e d b y a u n i r m e m l ) r a n e g a ,
r址 r i咭 a r o u n d a h v p h a d u r i n g e a r ly d i g e s t i o n 引 。 Z e . X 10 0 0 0 F i g . 14 . A n u m b e r o r v e s i e l e s f u s e w i t h t h e i r
加 e m b r a n e s t o t五e p l a s m a l e m m a e n e i r c l i n g t h e h y p h a a n d d i s e h a r g e t五e i r e o n t e n t s i n r o t h e s P a e e a r o u n d t h e h y P h a .
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