全 文 ： 菌物学报
jwxt@im.ac.cn 15 September 2013, 32(5): 838-845
Http://journals.im.ac.cn Mycosystema ISSN1672-6472 CN11-5180/Q © 2013 IMCAS, all rights reserved.







基金项目：科技部科技支撑项目（No. 2012BAK11B02）；国家质检总局课题（No. 2008IK236和 No. 2012IK286）；天津出入境检验检疫局课
题（No. TK028-2009）
*Corresponding author. E-mail: Huanggm@tjciq.gov.cn
收稿日期: 2012-12-12, 接受日期: 2013-06-05

同步分子检测两种腥黑粉菌近似种 Tilletia bromi和 T. fusca
廖芳 罗加凤 刘跃庭 刘鹏 黄国明*
天津出入境检验检疫局 天津 300461



摘 要：早熟禾是优良的牧草和草坪草，近年来，从进境早熟禾上多次截获一种腥黑粉菌，但一直被鉴定为禾草腥
黑粉菌 Tilletia fusca。通过比较研究，作者已将该菌种名改为雀麦腥黑粉菌 T. bromi。依据 T. bromi和 T. fusca的序列
差异位点设计了 6对引物，成功建立了适合菌丝检测的 T. bromi和 T. fusca的双重 PCR方法和适合冬孢子检测的套
式双重 PCR方法，检测灵敏度达到 10pg/μL，为早熟禾腥黑粉菌鉴定提供了快速、可靠的检测方法。
关键词：早熟禾，雀麦腥黑粉菌，禾草腥黑粉菌，双重检测，套式 PCR

Simultaneous molecular detection of two allied smut species —
Tilletia bromi and T. fusca
LIAO Fang LUO Jia-Feng LIU Yue-Ting LIU Peng HUANG Guo-Ming*
Tianjin Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Tianjin 300461, China
Abstract: Species of Poa are commercially important herbages and turfgrasses in China. In recent years, many samples of
bluegrass imported from abroad were found to contain large amount of Tilletia teliospores. The pathogen was often identified
as T. fusca. The authors previously considered the species should be T. bromi based on series of comparative morphological
investigation. In accordance with to the nucleotide difference of T. bromi and T. fusca, six pairs of primers were designed for
double PCR and double nested-PCR amplification. The results showed that T. bromi and T. fusca could be detected and
differentiated between each other by applying their mycelial genomic DNA and teliospore genomic DNA. Its sensitivity could
reach to 10pg DNA from mycelia or a few teliospores. The methods developed in this study are helpful for quick detection in
bluegrass quarantine.
Key words: bluegrass, Tilletia bromi, Tilletia fusca, double detection, nested-PCR

DOI:10.13346/j.mycosystema.2013.05.009
廖芳 等 /同步分子检测两种腥黑粉菌近似种 Tilletia bromi 和 T. fusca
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早熟禾 Poa spp.是优质的牧草和草坪草，
是我国进境最多的禾本科草种之一（每年约
2,000 吨左右）。大量进口早熟禾虽然满足了国
内畜牧业及城市园林绿化的需要，但同时也增
加了外来危险性有害生物传入的风险。腥黑粉
菌 Tilletia spp.是引起早熟禾腥黑穗病的重要病
原真菌，是进境早熟禾检疫中常见的病原真菌。
龚贤弟和江霞玲（1991）、李鸣和罗加凤（1992）
相继报道，分别从进境草地早熟禾 P. pratensis
Linn.（品种为六月禾）中发现一种腥黑粉菌的
冬孢子，其形态与雀麦上的雀麦腥黑粉菌 T.
bromi (Brockm.) Brockm.、乌尔波草 Vulpia spp.
上的禾草腥黑粉菌 T. fusca Ellis & Everh.、早熟
禾上的T. sterilis Ule和T. togwateei Guill.非常相
似。近几年来，天津出入境检验检疫局上百次
从 草 地 早 熟 禾 P. pratensis （ Kentucky
bluegrass）、加拿大早熟禾 P. compressa L.
（Canada bluegrass）和早熟禾 P. annua L.
（annual bluegrass）中截获此菌，且带菌量大，
国家质检总局曾就此向全国口岸发布了风险预
警通报。早熟禾上腥黑粉菌的检疫鉴定已成为
该草种真菌检疫的重要工作之一。
长期以来，在早熟禾上发现的腥黑粉菌一
直被鉴定为禾草腥黑粉菌 T. fusca（龚贤弟和江
霞玲 1991；周国梁等 1995；王园 1997）。Durán
& Fischer（1961）认为 T. fusca是一个较为复杂
的复合种，其寄主范围广，包括早熟禾属 Poa
spp.、羊茅属 Festuca spp.、雀麦属 Bromus spp.
等。Vánky（1985，1994）认为 T. fusca 和 T. bromi
是同物异名，其寄主包括 Bromus、Festuca、
Nardurus、Vetenata、Vulpia 等属植物，但不包
括早熟禾属 Poa。Guillemette（1988）通过萌发
生理和细胞学特性研究，将侵染反曲早熟禾
P. reflexa Vasey & Scribn.的腥黑粉菌从复合种
T. fusca 中独立出来，并定为新种 T. togwateei
Guill.。Boyd & Carries（1997；1998）从寄主专
化性、分子生物学及细胞学等 3 方面阐述侵染
Vulpia和 Bromus植物的腥黑粉菌专化型不同，
将复合种分为两个独立的种，即 T. fusca 和 T.
bromi，并认为 T. fusca 寄主仅限于 Vulpia，而
将侵染雀麦的腥黑粉菌归为 T. bromi。迄今，复
合种 T. fusca已被分为 3个独立的种，即寄生于
Vulpia spp.的 T. fusca、寄生于 Bromus spp.的 T.
bromi 和寄生于 P. reflexa Vasey & Scribn.的 T.
togwateei。罗加凤等（2011）研究发现 T. bromi
与 T. fusca在菌瘿色泽、冬孢子网脊高度、一直
径网目数、冬孢子萌发担子数等方面略有差异。
作者从早熟禾上截获的腥黑粉菌在上述特征方
面与 T. bromi 更为接近，从而将从早熟禾上截
获的腥黑粉菌定名为 T. bromi。
腥黑粉菌属鉴定的主要依据包括冬孢子的
形态学特征、萌发生理、细胞学特性以及寄主
专化性。由于冬孢子萌发耗时费力，而且冬孢
子萌发能否成功都受冬孢子新鲜程度、培养条
件等因素的影响。随着草坪草种子引种进境日
益频繁，T. bromi和 T. fusca通过口岸传入我国
的风险不断增大。由于 T. bromi与 T. fusca冬孢
子形态及萌发生理特性非常相似，有必要对其
开展分子鉴定研究，为我国各口岸快速和准确
鉴定早熟禾上的腥黑粉菌提供可靠方法。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 腥黑粉菌来源：供试腥黑粉菌为天津出入
境检验检疫局动植物与食品检测中心植检实验
室多年收集和保藏的样品（表 1），其中编号为
Zao1、Zao2、ZaoL、Poa5、Poa6的腥黑粉菌系
本实验室从美国进境的 3 种早熟禾种子上截获
保存的材料；编号为 LMC307和 LMC312的腥
黑粉菌系与美国华盛顿州立大学交流提供。所
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表 1 供试菌株的来源和寄主
Table 1 List of Tilletia species used in this study
菌株
Strain
种名
Species
寄主
Host
年份
Year
来源
Origin
LMC307 Tilletia fusca Vulpia microstachys 1995 USA
LMC312 Tilletia fusca Vulpia octoflora 1995 USA
Zao1 Tilletia bromi Poa pratensis 2003 USA
Zao2 Tilletia bromi Poa protensis 2003 USA
ZaoL Tilletia bromi Poa protensis 2004 USA
Poa5 Tilletia bromi Poa compressa 2002 USA
Poa6 Tilletia bromi Poa annua 2002 USA

有菌株均由冬孢子培养出菌丝体。
1.1.2 试剂：自行配制席尔氏液和 0.25%的次氯
酸钠溶液（彭金火等 2000），PCR扩增试剂 PCR
Buffer、dNTPs和 Taq酶购自宝生物（大连）工
程公司，菌株基因组 DNA 提取试剂盒（编号
SK1252）购自上海生物工程有限公司。
1.2 方法
1.2.1 引物的设计：根据高强等（2005）、梁宏
等（2006）的方法，设计外套通用引物 IGSUF2
（GAG CGA TAC CTT GGT TAA CTT C）/
IGSUR2（CAC CTT CCC TCC TAA TGC AC），
根据扩增测序和序列分析结果在上述引物内
侧，设计 T. fusca 特异引物 PFSF（CAA GAC
GCG TCG CGT A）和 PFSR（GAC GCG TTC
AAG GGA AAG），扩增片段约为 140bp。根据
O’Donnell & Cigelnik（1997）设计的引物 T1/T2，
在低严谨条件下扩增得到约 800bp 和 600bp 两
条较明显的条带，切取 800bp 大带回收，进行
克隆测序。再在 T1和 T2引物内侧设计引物对
tubF（GAA GAC GTA TGC GTT GAG GA）/tubR
（AGG AGG ATG CCG AGC GAG A）。根据测
序结果设计内套特异引物 PNSF（CTC AAC
CCT TCC CTC TAT TCC）和 PNSR（CGA TAC
GGA TTC TGC ATT CC），扩增片段约为 420bp。
使用自行设计的 IGS1 序列 Tilletia 属外套通用
引物 IGSUF1（GGA TGC ATT CTG GGG ACG
T）/IGSUR1（GTA GCC TTG TTG CTA CGA
TCT G）和内套通用引物 NIGSUF1（CAC CGC
CCA AGC ACG TAC）/NIGSUR1（GAC CTT
TTG GGG TCA AAC TTC TC）作为扩增过程质
量监测， IGSUF1/IGSUR1 的扩增片段约为
900bp。NIGSUF1/NIGSUR1用于冬孢子的套式
扩增，扩增片段约为 700bp，相关引物序列见
专利（申请号：201110145617.9）。引物由上海
英骏生物技术有限公司合成，PCR 扩增相关试
剂均购自宝生物（大连）工程公司。
1.2.2 冬孢子培养及菌丝体基因组 DNA 的提
取：在 500μL 的离心管中加入适量 0.25%的次
氯酸钠溶液，在盖玻片上破碎菌瘿，加入菌瘿
碎粒少许，经涡旋振荡混和50s后，经3,000r/min
离心 1min，立即用微量加样器去除上清液。加
无菌水离心清洗两次，将冬孢子沉淀物转至 3%
水琼脂平板上 10℃培养，连续光照。待冬孢子
萌发后继续培养 20d 后获得菌落，用无菌水将
菌丝体冲洗至马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）
上，10℃光照下继续培养 30–45d后，将菌落挑
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出，称取约 50mg 菌丝体，采用上海生工基因
组 DNA纯化试剂盒（编号 SK1252）提取菌丝
体基因组 DNA，并溶于 70μL TE缓冲液中。其
余菌丝置于–70℃保存备用。
1.2.3 冬孢子破碎：在载玻片上放置 1mm 见方
的洁净盖玻片，然后在其上滴约 0.5μL 10× PCR
缓冲液。用解剖针刺破腥黑粉菌瘿，挑取 3–10
个左右冬孢子置于缓冲液中，盖上近似大小的洁
净盖玻片。用洁净镊子轻轻摩擦盖玻片，在光学
显微镜下确认孢子破裂后将叠合的两片盖玻片
一起放入含4.5μL 10×PCR缓冲液的PCR管底部
（在操作过程中需捣碎盖玻片），盖上管盖，以
不添加冬孢子仅含 PCR缓冲液作为阴性对照。
1.2.4 菌丝体基因组 DNA 双重 PCR 检测：对
Zao1、Zao2、ZaoL、Poa5、Poa6、LMC307、
LMC312等 7个菌株的菌丝体基因组DNA进行
属通用引物 IGSUF1/IGSUR1（T. bromi 和 T.
fusca的特异引物）扩增，反应体系均为 20μL。
通用引物扩增体系包含 10×Buffer 2.0μL（其中
含有终浓度为 1.5mmol/L的 MgCl2）、浓度各为
2.5mmol/L 的 4 种 dNTPs 共 0.5μL、浓度为
20mmol/L的引物各 0.2μL、0.2μL Taq DNA 聚
合酶（5U/μL）、0.5μL模板 DNA（约为 40ng），
加双蒸无菌水至 20μL。将 ZaoL 的 IGSUF1/
IGSUR1 的扩增片段克隆，摇菌培养提取出的
质粒作为阳性对照，以添加双蒸无菌水为模板
作为阴性对照。PCR 反应条件：94℃预变性
5min；然后 94℃变性 30s，63℃复性 30s，72℃
延伸 1min，35个循环；最后 72℃延伸 7min。
双重 PCR扩增体系同通用引物的扩增体系，引
物换成 4条引物（PNSF/PNSR和 PFSF/PFSR）
各为 0.2μL，不设置阳性对照。循环参数变为
94℃预变性 5min；然后 94℃变性 30s，60℃复
性 30s，72℃延伸 30s，35 个循环；最后 72℃
延伸 7min。只设置阴性对照。1.5%琼脂糖凝胶
电泳，EB染色并观察特定大小条带的有无。
1.2.5 双重 PCR 检测灵敏度测试：将提取的
Zao1 和 LMC307 菌丝体基因组 DNA 用紫外分
光光度计进行核酸浓度测定，将定量为 10ng/μL
作为初始浓度，再进行 10 倍梯度稀释，共设置
8个浓度梯度，扩增体系及循环参数设置同双重
PCR 扩增体系，设置阴性对照。1.5%琼脂糖凝
胶电泳，EB染色并观察特定目的大小带的有无。
1.2.6 冬孢子套式双重 PCR检测：挑取 Zao1、
Zao2、ZaoL、Poa5、Poa6、LMC307、LMC312
等 7 个菌株数个经破碎冬孢子进行套式扩增。
第一轮采用 IGSUF1/IGSUR1、IGSUF2/IGSUR2
和 TubF/TubR双引物进行扩增。第一轮反应体
系为 50μL：浓度各为 2.5mmol/L的 4种 dNTPs
共 0.5μL、浓度为 20μmol/L 的引物（IGSUF1/
IGSUR1、IGSUF2/IGSUR2和 TubF/R）每条各
为 0.5μL、0.5μL Taq DNA 聚合酶（5U/μL）、模
板和 PCR Buffer 计为 5μL，加双蒸无菌水至
50μL，采用阳性质粒作为阳性对照，添加 PCR
Buffer作为阴性对照。热循环程序：94℃预变性
5min；94℃变性 30s，55℃复性 30s，72℃延伸
1min，25个循环；72℃延伸 7min。第二轮反应
体系为 20μL：NIGSUF1/NIGSUR1 扩增的反应
体系同 1.2.4，引物换为 NIGSUF1/NIGSUR1，
模板为 1μL第一轮扩增产物，设置阳性对照和
阴性对照。热循环程序：94℃预变性 5min；94℃
变性 15s，60℃复性 15s，72℃延伸 1min，35
个循环；72℃延伸 7min；特异引物双重扩增的
反应体系同 1.2.4，引物换为 PNSF/PNSR 和
PFSF/PFSR，模板为第一轮扩增产物 1μL，不设
置阳性对照，设置阴性对照。热循环程序：94℃
预变性 5min；94℃变性 15s，60℃复性 15s，72℃
延伸 30s，35个循环；72℃延伸 7min。使用 1.5%
琼脂糖凝胶电泳，EB染色并成像观察目的片段
的有无。
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2 结果与分析
2.1 菌丝体基因组 DNA 双重 PCR 扩增产物检测
对 Zao1、Zao2、ZaoL、Poa5、Poa6、LMC307、
LMC312等 7个菌丝体基因组DNA样本进行通
用引物和 2 对特异引物的双重扩增，以阳性质
粒作为阳性对照，添加双蒸无菌水为阴性对照，
扩增产物经电泳、染色均能观察到特定目的条
带，外套通用引物扩增的片段约为 900bp，阳
性质粒和所有菌丝基因组 DNA 均能得到特定
大小的目的片段，阴性对照无相应产物（图 1）。

图 1 采用引物 IGSUF1/IGSUR1 对腥黑粉菌菌丝基因组
DNA 通用引物扩增的电泳图谱 1–8：阳性质粒、Zao1、
Zao2、ZaoL、Poa5、Poa6、LMC307、LMC312；9：阴性对照；
M：2,000bp DNA 分子标记物.
Fig. 1 Electrophoresis pattern of PCR amplification for mycelial
genomic DNA using universal primers IGSUF1/IGSUR1. 1–8:
Positive cloning plasmid, strains Zao1, Zao2, ZaoL, Poa5, Poa6,
LMC307 and LMC312; 9: Negative control; M: 2,000bp DNA
ladder marker.
由 T. bromi 特异引物扩增的片段约为
420bp，所有 T. bromi菌株均显示特定大小目的
条带（图 2中 1–5泳道）。由 T. fusca特异引物
扩增的片段约为 140bp，但只有菌株 LMC307
和 LMC312显示特定大小目的条带（图 2中泳
道 6、7），阴性对照无相应产物（图 2中泳道 8）。


图 2 采用引物 PNSF/PNSR 和 PFSF/PFSR 对腥黑粉菌菌
丝基因组 DNA 特异引物扩增的电泳谱带 1–7：Zao1、
Zao2、ZaoL、Poa5、Poa6、LMC307、LMC312；8：阴性对照；
M：2,000bp DNA ladder marker.
Fig. 2 Electrophoresis pattern of PCR amplification for mycelial
genomic DNA using specific primers PNSF/PNSR and PFSF/
PFSR. 1–7: Strains Zao1, Zao2, ZaoL, Poa5, Poa6, LMC307 and
LMC312; 8: Negative control; M: 2,000bp DNA ladder marker.
2.2 双重 PCR 灵敏度测试
8个浓度梯度的 DNA样品经 35个循环的
双重 PCR扩增，Zao1和 LMC307菌丝基因组
DNA均能扩增出 10-3稀释倍数的样品（图 3），
即扩增低限浓度为 10pg/μL（泳道 1、2、3、4），
其中 T. bromi特异引物扩增片段为 420bp，T.
fusca特异引物扩增的片段为 140bp，而以添
加无菌水为阴性对照则无相应目的片段（泳
道 9）。
2.3 冬孢子 DNA 双重套式 PCR 检测
供试7个菌株的冬孢子DNA经两轮套式扩
增，内套通用引物扩增的片段约为 700bp，阳
性对照和所有菌株冬孢子DNA经 2轮套式扩增
均能得到特定大小的目的片段，而阴性对照无
相应产物（图 4）。T. bromi 特异引物扩增片段
为 420bp，只有 T. bromi的菌株显示目的大小条
带（图 5中泳道 1–5）；T. fusca特异引物扩增的
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图 3 对菌株 Zao1 和 LMC307 双重 PCR 扩增产物的灵敏
度检测电泳图谱 1–8：10、1、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、
10-6ng/μL；9：阴性对照；M：2,000bp DNA ladder marker.
Fig. 3 Electrophoresis pattern of sensitivity detection of double
PCR products of strains Zao1 and LMC307. 1–8: 10, 1, 10-1, 10-2,
10-3, 10-4, 10-5, 10-6ng/μL respectively; 9: Negative control; M:
2,000bp DNA ladder marker.

图 4 冬孢子 DNA 通用引物套式 PCR 扩增电泳图谱
1–8：阳性质粒、Zao1、Zao2、ZaoL、Poa5、Poa6、LMC307、LMC312；
9：阴性对照；M：2,000bp DNA ladder marker.
Fig. 4 Electrophoresis pattern of nested-PCR amplification for
teliospore DNA by using universal primers NIGSUF1/NIGSUR1.
1–8: Positive cloning plasmid, strains Zao1, Zao2, ZaoL, Poa5,
Poa6, LMC307 and LMC312; 9: Negative control; M: 2,000bp
DNA ladder marker.
片段约为 140bp，只有 LMC307、LMC312显示
特定大小的目的条带（图 5 中泳道 6、7），阴
性对照无相应产物（图 5中泳道 8）。

图 5 冬孢子 DNA 特异引物双重套式 PCR 扩增电泳图谱
1–7：Zao1、Zao2、ZaoL、Poa5、Poa6、LMC307、LMC312；8：
阴性对照；M：2,000bp DNA ladder marker.
Fig. 5 Electrophoresis pattern of nested-PCR amplification for
teliospore DNA using specific primers PNSF/PNSR and PFSF/
PFSR. 1–7: Strains Zao1, Zao2, ZaoL, Poa5, Poa6, LMC307 and
LMC312; 8: Negative control; M: 2,000bp DNA ladder marker.
3 讨论
早熟禾是我国禾本科草种中进口量最大的
种类，也是腥黑粉菌检疫截获次数和携带量最
多的样品。我国学者一直将从早熟禾草种检疫
中截获的腥黑粉菌鉴定为 T. fusca（龚贤弟和江
霞玲 1991；周国梁等 1995；王园 1997）。通
过对该菌的菌瘿、冬孢子形态和萌发特性等的
比较研究，作者将从进境早熟禾草种中截获的
腥黑粉菌鉴定为 T. bromi（罗加凤等 2011），解
决了长期困惑我国植物检疫中关于早熟禾腥黑
粉菌种类鉴定的难题。本研究建立起了两种近
似腥黑粉菌的分子检测方法，为正确鉴别区分
两种腥黑粉菌提供了便捷和可靠的检测方法。
目前，已成功实现了对Tilletia属中T. indica
Mitra和 T. walkeri Castl.的冬孢子分子检测，而
且实现了单孢检测（易建平等 2003；章桂明和
章正 2005）。这两种腥黑粉菌的冬孢子直径比
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本研究涉及的具网状冬孢子的腥黑粉菌大
10μm。尽管如此，在体视显微镜下挑取和破碎
这些腥黑粉菌的冬孢子仍比较困难。黄国明等
（2008）、廖芳等（2009a，2009b）都成功地解
决了具网状冬孢子的腥黑粉菌的冬孢子破碎和
DNA 提取难题。由于腥黑粉菌冬孢子个体微
小，或由于保藏时间较久或保藏方法不当可能
致冬孢子死亡，所以，多挑些冬孢子（如 3–10
个）容易获得成功。廖芳等（2009b）对冬孢子
直径 20μm 左右的腥黑粉菌进行冬孢子单孢
DNA检测试验，但是成功率较低（20%–30%）。
本研究开展的腥黑粉菌冬孢子 DNA 检测成功
率与此近似。采用分子生物学方法对腥黑粉菌
进行快速检测鉴定，虽然能做到 1 个或几个冬
孢子的分子检测鉴定水平，但可操作性不强。
在对外开据检疫证明或对外谈判时，应以发现
菌瘿和结合冬孢子形态、萌发及分子检测鉴定
结果为依据则更有说服力。为保证检测鉴定结
果的准确性，应采用多个孢子进行分子检测。
本研究建立的检测方法灵敏度较高，已达到单
孢水平。
本研究根据 T. bromi和 T. fusca在 IGS2和
Tub 基因序列上的差异，首次建立了同步区分
二者的菌丝 DNA双重特异 PCR检测方法和冬
孢子 DNA的双重套式 PCR检测方法。该方法
不仅能够检测出腥黑粉菌菌丝体基因组 DNA，
检测灵敏度达到 10pg/μL，而且可以利用冬孢子
DNA 套式扩增实现对这两个近似种的快速检
测。该方法特异性强，灵敏度高，节约了时间
和检测成本。在进口草种中常混杂其他草种籽
粒，但禾本科草种是重要的腥黑粉菌寄主，而
且一种草种上常寄生多种腥黑粉菌。本检测方
法仅针对 T. bromi和 T. fusca进行了分子检测，
因此，在口岸检测实际应用中应先参照罗加凤
等（2011）从早熟禾种子中挑取 T. bromi 疑似
菌瘿，然后进行冬孢子分子检测，从而排除混
杂草种携带的腥黑粉菌的干扰。
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