全 文 ：菌　物　系　统　17(2):167 ～ 173 , 1998
Mycosystema
　　江苏省科学基金资助项目。
　　在 1996年全国植物生理学年会上宣读过。
1997-04-07收到原稿 , 1997-06-18收到修改稿
佛州侧耳子实体锰型 SOD的纯化及性质研究
吴国荣　程光宇　陶明煊　陆长梅　马长艳　魏锦城
(南京师范大学生物系　南京 210097)
摘要　佛州侧耳(Pleurotus floridanus Singer)子实体 SOD 同工酶只有一条较宽的谱带 , 确认
为 Mn-SOD , 有其资源和学术研究上的意义。 以简化的方法提纯其 Mn-SOD , 活性回收率
显著提高。该酶分子为二聚体。荧光光谱在 355.1nm 处有最大发射峰。氯仿-乙醇混合液
(2∶3/ v∶v)对该酶的抑制属于非竞争性抑制。它的碱性氨基酸和酸性氨基酸的比值与酵母的
相近。其他理化性质与文献报道的不同来源的 Mn-SOD大致相同。
关键词　佛州侧耳子实体 ,锰型超氧物歧化酶 , 纯化 ,性质
中图分类号　Q939.56
　　超氧物歧化酶(Supero xide Dismutase , EC 1.15.1.1 ,简称 SOD)是生物体内普遍存在的一类金属酶 ,
该酶催化超氧自由基(O-2·)歧化为 H2O 2和 O2 。自 1969 年 McCord 和 Fridovich 首先从牛血红细胞中分
离到CuZn-SOD以来 ,相继发现了含Fe 和含Mn 的 SOD。近年的研究表明 ,机体的衰老和许多疾病 ,特
别是肿瘤的形成 、发展与自由基密切相关(方允中 、李文杰 1989), SOD能及时有效地清除机体内的超氧
自由基 ,而 Mn-SOD由于其特有性质 , 更为人们所关注(方允中等 , 1993;李性天 , 1988)。
迄今已从大肠杆菌(Keel 等 , 1970)等原核生物 、动物肝脏(方允中 、李文杰 1989)、酵母
(Ravindranath1975)及高等植物豌豆(Sevilla等 , 1980)、菠菜(Hayakawa 等 , 1985)等中分离出 Mn-SOD。
我们曾报道多种食用 、药用真菌 SOD 主活性带均为 Mn-SOD , 一般占 SOD的总活性 60%以上(邹玉珍
等 , 1991), 并从猴头菌子实体 Hericium erinaceus(Bull.)Pers.中提纯了 Mn-SOD(吴国荣等 , 1996), 本
文进一步简化了纯化流程 ,在佛州侧耳(Pleurotus f loridamus Singer)子实体中 ,分离出 Mn-SOD , 提高
了产率 ,并就其有关性质及酶的抑制行为进行了研究。
1材料与方法
1.1 材料与药品
　　佛州侧耳子实体采自南京人防挹江门食用真菌养殖场 , 经表面清洗 , 消毒处理后 , 贮存在-25℃下
备用。
标准蛋白试剂盒 、SDS 和牛血清白蛋白为 Sigma 产品 , DEAE-纤维素(DE52)为 Whatman 产品 ,
Sephadex G-100 和两性电解质载体均为 Pharmarcia产品 , NBT 为上海前进试剂厂产品 ,其他试剂为分
析纯或生化试剂。
1.2 粗酶液的制备
　　将已预处理的佛州侧耳子实体撕碎 ,按每克材料加入 1ml预冷的 50mmol/ L 磷酸缓冲液(pH7.8 , 含
1mmol/ L EDTA)高速捣碎(10000～ 12000r/ min), 经四层纱布过滤 , 滤液用 JY88-Ⅱ型超声波细胞破碎
机处理 30min(冰浴冷却 , 150W , 其间工作 30S ,间隙 30S),然后于 4℃、12000×g离心 20min , 弃沉淀 , 上
清液即为粗酶液。
DOI :10.13346/j.mycosystema.1998.02.014
1.3 酶的分离 、纯化
　　在粗酶液中加硫酸铵至 40%饱和度 , 冰浴冷却 , 搅拌 2h 后 , 4℃、15000×g 离心 30min ,弃沉淀。在
上清液中再加硫酸铵至 85%饱和度 , 冰浴冷却 ,搅拌 2h , 4℃静置过夜 , 20000×g 离心 30min。收集沉淀
物 ,用少量 5mmo l/ L磷酸缓冲液(pH8.0 , 内含 0.1mmol/ L EDTA)溶解 , 用同样的缓冲液 , 4℃对样品动
态透析 36h , 共换透析液 8 次。将透析后的样品上 DEAE 纤维素柱(DE52)(2.5×25cm),充分淋洗 , 再行
20～ 200mmol/ L 磷酸缓冲液(pH8.0 , 内含 0.1mmol/ L EDTA)线性梯度洗脱 , 流速控制为 16ml/ h , 每管
4ml作部分收集。测定 SOD活性和蛋白质 ,洗脱曲线见图 1。合并收集 SOD 活性峰 ,对水透析后冷冻干
燥 ,得浅褐色 SOD 粉末。
1.4Mn-SOD活性测定
　　按 Stewer t和 Bewley 的方法(1980)在 2mmol/ LH2O 2存在下进行。
1.5 酶的凝胶电泳活性染色和等电聚焦电泳
　　前者参照罗广华 、王爱国的方法(1983), 蛋白质染色用考马斯亮兰 R-250。
　　后者按袁玉荪等(1980)的方法进行。
1.6 蛋白浓度测定
　　按 Bradford 方法(1976)进行 , 以牛血清白蛋白作标准蛋白。
1.7 SOD 类型鉴定
　　参照 Steffen等(1994)和罗广华等(1996)的方法。实验以不同抑制条件下凝胶电泳 SOD 活性染色
定位鉴定为主 ,同时也测定加入不同抑制剂后的 SOD残存活性。
1.8 分子量和亚基分子量的测定
　　分子量测定采用 Sephadex G-100 凝胶过滤法 ,亚基分子量用 SDS-PAGE法。
1.9 氨基酸组成和金属元素分析
　　按 Pico·Tag TM氨基酸分析系统进行。色氨酸含量按蔡武城和袁积厚(1982)荧光法 , 在岛津 RF-
540 荧光分光光度计上进行。
　　金属元素分析在 PE-Plasma 400 型电感耦合等离子体光谱仪上进行。
2结果与分析
2.1 酶的分离纯化
　　证实佛州侧耳子实体 SOD类型只有 Mn-SOD一种且呈单一条带 , 根据其性质 , 分离时舍弃了热变
性沉淀杂蛋白和在偏酸(pH5.5)条件下 CM-纤维素(CM 52)柱层析的步骤 ,在分部盐析后直接采用偏碱
(pH8.0)条件下 DE52 的浓度梯度柱层析 ,各步纯化结果见表 1。 900g 材料纯化后得2.86mg Mn-SOD ,
酶比活性为 2968u/ mg 蛋白 , 纯化 57.2 倍。酶的比活性与酵母(Ravindranath 1975)和猴头子实体 Mn-
SOD(吴国荣等 , 1996)基本一致。活性回收率为 29.4%。
2.2 酶类型和纯度的鉴定
　　粗酶液和纯化后的酶经聚丙烯酰胺凝胶电泳后活性染色(图 2 A1 、2), 两者均呈现一条活性带 , 且完
全对应 ,其 Rf值与 Steffen 等(1994)发表的 Mn-SOD相一致。该酶对氯仿-乙醇混合液(2∶3/v∶v)敏
感, 酶液∶氯仿-乙醇混合液为 4∶1(v/ v)时酶活性带即大为减弱(图 2 A4), 2∶1时酶活性带消失(图 2 A5);
表 1　佛州侧耳子实体 Mn-SOD的纯化
Table 1 Purifica tion of Mn-SOD from pleurotus f luridanus
纯化步骤 总体积 总蛋白 总活性 比活性 纯化倍数 回收率
Purifi cat ion Total volume Total protein Total activity S pecific activity Purification Yield
step (ml) (mg) (unit s) (unit s/mg pro.) (fold) (%)
粗酶液(Crude ext ract) 954 556.8 28898 51.9 1 100
40%～ 85%(NH4)2SO 4 113 71.9 17079 238.3 4.6 59.1
DEAE-纤维素(DE52) 37 2.86 8496 2968 57.2 29.4
168　　 菌　　物　　系　　统 17 卷
图 1　佛州侧耳子实体 Mn-SOD的 DE52线性浓度柱梯度层析图谱
———SOD活性。 —·-蛋白质浓度;----磷酸钾浓度
Fig.1 Linear gradient ch romatography of M n-SOD From Pleurotus f loridanus on DE52
———SOD Act ivi ty;-·-Protein ----K-Phosphate
图 2　佛州侧耳子实体粗酶液(A1)及纯化
M n-SOD(A2～ 5 、B2 、C)凝胶电泳图谱
(A1～ 5)为酶活性染色 , 6为蛋白质染色 ,
B为 SDS-PAGE , C为等电聚焦电泳)
Fig.2　Polyacr ylamidegel elect rophoresis of
crude ext ract(A1)and purif ied Mn-SOD(A
2～ 5 、B2 、C)f rom P leuroi tus F lor idan us(A1～ 5
w ere activity stained , 6 w as protein stained ,
B w as SDS-PAGE , C was isoelectric focusing
elect rophoretogram)
对 CN 不敏感 , KCN 浓度达 3mmol/ L 时酶活性带仍不
受影响(图 2 A3 , )这一结果与酶活性的氯仿-乙醇混合
液(图 5)和 CN 抑制试管试验一致 , 可以确认属于 Mn-
SOD。
　　纯化的 Mn-SOD 经 PAGE电泳后的蛋白质染色带
(图 2 A6)和酶活性染色(图 2 A2)相互对应 , 在 SDS-
PAGE(图 2 B2 ,其中 B1 为标准蛋白)和等电聚焦电泳图
谱(图 2 C)上也只显示一条带 ,表明已纯化达均一程度。
2.3 酶的光谱特性
　　用岛津 UV-250 紫外可见分光光度计测定酶的吸
收光谱 , 该酶在紫外区有二个吸收峰 , 分别位于 278.
4nm 和 218.6nm(图 3 A)。在 278.4nm 处的摩尔吸收系
数为 1.40×105/mol·cm , 与不同来源的 Mn-SOD 特性
相似(赵厚安 、方允中 1988 , Steffen 等 1994), 一般认为
这与氨基酸组分中相当数量的酪氨酸和色氨酸有关。
　　在岛津 RF-540 型荧光分光光度计上测定荧光发
射光谱 ,在 355.1nm 和 550.7nm 处有两个大荧光峰 , 在
652nm 和 800nm 处尚有两个较小的荧光峰(图 3B)。迄
今仅见东方弧菌 Fe-SOD荧光光谱的报道(朱文杰等 ,
1995),佛州侧耳 Mn-SOD 的荧光光谱与前者很相似。
是否表明 Mn-SOD 和 Fe-SOD 在氨基酸序列组成及
其高级结构上具有明显的相似性 ,尚待深入研究。
2.4 酶的分子量和亚基分子量
　　用葡聚糖凝胶过滤法测酶的分子量 ,从牛血清白蛋
白 、卵清蛋白 、胰蛋白酶和细胞色素 C 作的标准曲线上
查得酶分子量约 45 0000D。用 SDS-PAGE 凝胶电泳测定亚基分子量 , 其电泳区带 Rf 值为 0.61(图 2
B2),从标准曲线上查得分子量约 22 600D。不同来源的 Mn-SOD有 2 ～ 4 个亚基 , 其分子量一般约 23
1692 期 吴国荣等:佛州侧耳子实体锰型 SOD的纯化及性质研究 　
图 3　佛州侧耳子实体 Mn-SOD的紫外吸收光谱(A)和荧光发射光谱(B)(酶液 0.56mg/ ml , 光径 1cm)
Fig.3 Ult raviolet absorption spect rum(A)and f luorescent spect rum(B)of Mn-SOD from Pleurotus f loridanus
(With a prot in concent ration of 0.56mg/ml and a light path of 1 cm)
000D(陈淮扬等 , 1996)。佛州侧耳 Mn-SOD是由两个相同亚基构成的二聚体。
2.5 金属辅基的确定
　　等离子体光谱测定表明该酶每个亚基含有 0.92 个锰原子(整数为 1), 锌原子和铁原子含量低于检
测下限。锰含量与大肠杆菌(Keel等 , 1970)、酵母(Ravindranath , 1975)的 Mn-SOD相一致。
2.6 酶的等电点及氨基酸组成
　　该酶在等电聚焦电泳后 ,呈现单一蛋白区带(图 2 C), 相应的 pH 值为 6.90。 未见多条同族异形体
的现象(Steffen 等 , 1994)。
　　由氨基酸组成分析(表 2)可见 , 该酶富含天冬氨酸 、谷氨酸 、丙氨酸。与大肠杆菌(Keel等 , 1970)、酵
母(Ravindranath , 1975)和猴头菌子实体 Mn-SOD 相近 , 且碱性氨基酸(Arg、Lys 、His)和酸性氨基酸
(Glu 、Asp)比值为 1∶1.58 ,与猴头菌子实体 Mn-SOD(吴国荣等 , 1996)尤为接近。
表 2　佛州侧耳子实体与其他材料 Mn-SOD 氨基酸组成比较
Table 2 A comparison of amino acid composition of Mn-SOD from P leurotus f loridan us wi th those f rom other materials
Mn-SOD(残基数/亚基 residues/ subunit)
佛州侧耳 猴头 啤酒酵母 大肠杆菌 佛州侧耳 猴头 啤酒酵母 大肠杆菌
　Pleu rotus Hericiuma Saccharomycesb　　E.colf Pleruotus Hericiuma Saccharomycesb E.col f
f loridanus　 erinaceus ceravisiae f loridanus erinaceus ceravisiae
Lys 13 16 19 15 Ala 24 29 21 24
His 7 7 7 6 1/ 2Cys 0 0 3 0
Arg 4 4 4 5 Val 11 10 14 100
Asp 20 24 28 21 Met 2 1 2 2
Thr 10 9 11 9 Ile 10 11 12 7
Ser 12 12 8 11 Leu 18 16 20 19
Glu 20 20 28 18 Tyr 7 5 9 6
Pro 11 11 10 8 Phe 7 7 6 9
Gly 18 21 19 13 Trp 7 7 11 0
Reference:a WU Guo-Rong 等 , 1996;b Ravindranath和 Fridovich , 1975;c Keel等 , 1970
170　　 菌　　物　　系　　统 17 卷
2.7 酶的稳定性
　　同一酶液(25g/ ml)在不同温度下保温 20min 后 ,迅速冷却至 4℃, 测定酶活性(图 4 A),该酶在 50℃
以下是稳定的 ,高于 60℃后迅速失活。
　　将酶分别溶于不同 pH 值的 30mmol/ L 柠檬酸-磷酸二氢钾-硼酸-巴比妥缓冲液中(25μg/ml)
25℃保温 10min , 测定酶活性(图 4B),该酶在 pH6～ 11之间稳定 , 在酸性条件下几乎呈线性衰减。
图 4　温度(A)、pH(B)、脲(C)和胰蛋白酶(D)对佛州侧耳子实体 Mn-SOD活体的影响
Fig.4 Ef fects of temperature(A), pH(B), urea(C)and t rypsin(D)on Mn-SOD act ivity f rom Pleurotus f loridanus
　　在不同浓度的脲溶液中 ,加入等量的酶(25μg/ml), 25℃保温 10min ,测定酶活性(图 4 C), 在4mol/ L
脲浓度下该酶基本稳定。脲是常见的蛋白变性剂 , 它使酶蛋白肽链伸展 , 并显露出内部疏水键 ,该酶表
现出对脲的相对稳定性。
将胰蛋白酶与纯化的酶以 5∶1 的比例相混和 , 加入 50mmol/ LpH7.8 的磷酸缓冲液(内含 20mmol/
LCaCl2), 37℃保温 30min , 酶活性基本稳定(图 4 D), 其抗胰酶的特性与前人的有关研究相一致。机理
尚待进一步探讨。
2.8 抑制剂对该酶的影响
　　将酶液(25g/ ml)与不同比例(v/ v)的氯仿-乙醇混合液混合 , 25℃保温一定时间后 , 迅速测定残存
活力。该酶的抑制程度随氯仿-乙醇混合液比例的增大而加大。当酶液∶氯仿-乙醇混合液为 1∶2 时 ,
半衰期减小为 4.0min;同一比例时对酶活性抑制程度随处理时间的延长而加大(图 5 A)。可见该酶对
氯仿-乙醇混合液较敏感。在两个固定底物浓度下 ,酶相对活性的倒数对酶液∶氯仿-乙醇混合液的比
例作 Dixon图(图 5 B), 两条直线相交于横轴上 , 表明属于非竞争性抑制范畴。
图 5　氯仿-乙醇混合液对佛州侧耳子实体 Mn-SOD活性的抑制(A)和 Dixon 图(B)
Fig.5 Inhibit ion of the M n-SOD activity From P leurotus f lorida nus by dif ferent concent rations of
chloroform-ethanol(A)and Dixon plot(B)
1712 期 吴国荣等:佛州侧耳子实体锰型 SOD的纯化及性质研究 　
3讨论
　　文献报道从各种生物材料中提取 Mn-SOD 的活性回收率都较低 , 一般在 7%～ 16%之间 ,其原因
可能与 Mn-SOD 的结构 、性质与纯化时采用的方法和参数有关(方允中 、李文杰 , 1989;Steffen 等 ,
1994)。我们注意到该酶不耐热 ,且辅基 Mn 离子在偏酸条件下易解离 ,纯化猴头 Mn-SOD时舍弃了热
变性沉淀杂蛋白的步骤 ,同时确认猴头 Mn-SOD在 pH7.8 时能为 DE52柱吸附(吴国荣等 1996)。在佛
州侧耳 Mn-SOD纯化过程中又适当提高洗脱液的pH 值(pH8.0),使该酶能更好地吸附于 DE52柱 ,经充
分淋洗除去不吸附的杂蛋白 ,再用线性浓度梯度洗脱 , 部分收集 , 整个分离过程继分部沉淀仅进行了一
次柱层析就达均一程度 ,从而有效地减少了提纯过程中酶活性的损失。这一结果是否与佛州侧耳子实
体 SOD类型单一及材料蛋白质的构成有关 , 作者正进一步在液体培养的菌丝体中分离 Mn-SOD。
　　生物体在长期演化过程中形成抗活性氧伤害的内部保护机制 , 真菌细胞内产生活性氧的部位主要
是线粒体 ,其呼吸链上 NADH-黄素蛋白和辅酶 Q-细胞色素 b 两个位点产生 O-2 。就清除 O -2 的系统
而言 , SOD是关键酶 , 细胞的其它组分如 Cy tf 、GSH 、质体醌 、抗坏血酸等也可进行 ,但它们的清除能力比
SOD 低一个数量级。真菌的 SOD以线粒体内的 Mn-SOD为主(邹玉珍等 , 1991 , 陈淮扬等 , 1996), 一般
认为 , Fe、Mn-SOD是原核生物酶 , 而 Cu·Zn-SOD是真核生物酶 , 由此引出 SOD进化方面的研究。然
而真核生物体内往往存在不同类型的 SOD , 如与佛州侧耳同属的美味侧耳 Pelurotus sapidus(Schulzer a-
pud Kalchbrenner)Saccardo虽以 Mn-SOD为主 , 但还有其他类型的 SOD(邹玉珍等 , 1991)。有文献指
出 ,生物体在不同的环境条件和机体生长 、代谢等情况下 , 三种 SOD 的反应速率不同 , 机体内三种 SOD
并存 ,可以确保 O-2 在各种条件下均能有效清除(陈淮扬等 , 1996), 据此可知 SOD 对生命的存在至关重
要。但为什么发现于印度的佛州侧耳只含 Mn-SOD , 且为单一同工酶区带 , 类似的情况还有睡莲只有
Fe-SOD(Marivin等 , 1982), 白芨只有 Cu·Zn-SOD(吴国荣等 , 1994)。 是基因物质从原核生物至真核
生物独立转移 ,然后集中进化 , 还是存在沉默基因或假基因 , 由于环境条件影响导致植物基因的选择性
表达 ,这些理论问题都有待探讨。
　　有实验支持 Mn-SOD与 O-2 水平控制着细胞的分化 、分裂和衰老;外源 Mn-SOD可使癌细胞的分
裂受到抑制 ,故这一类型的 SOD 在医药和临床上日益受到重视(方允中 , 1993;李性天 , 1988)。富含 M n
-SOD 的食用 、 药用真菌 ,是可贵的保健植物资源 , 其中酶类型单一的佛州侧耳 、猴头还可以取代目前
通常采用的动物肝脏 ,纯化医药用 Mn-SOD , 使人们看到它们在传统的食用 、药用的基础上有深入开发
利用的前景。
参　　考　　文　　献
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THE PURIFICATION AND PROPERTIESOF MANGANESE-
CONTAINING SUPEROXIDE DISMUTASE FROM
PLEUROTUS FLORIDANUS
Wu Guo rong　Cheng Guangyu　Tao Mingxuan
Lu Changmei　Ma Changyan　Wei Jincheng
(Depar tment of Biology , Nanj ing Norma l U niversyty , Nanjing 210097)
ABSTRACT　The isozyme of SOD in Pleurotus f loridanus w ith only a single band is identi-
f ied as Mn-SOD and is of signigicance for exploitation of resources and scientif ic study.Pu-
rifying the M n-SOD by Simplif ied Method , the yield of the enzyme activity is increased no-
tably .This enzyme molecular is a dimer.The fluorescent spect rum of the enzyme showed an
emission peak at 355.1nm.The inhibition of the mixture of chlo roform-enthanol(2∶3v/v)
on this enzyme is noncompetitive.The content ratio of basic and acidic amino -acid in the
enzyme is similar to that of yeast.The other phy siochemical properties of the enzyme are
roughly the same wi th the various kinds of Mn-SOD from different sources reported by lit-
eratures.
KEYWORDS　Pleurotus f loridanus , Mn -Superoxide Dismutase(Mn-SOD), Purifica-
tion , Property .
1732 期 吴国荣等:佛州侧耳子实体锰型 SOD的纯化及性质研究