全 文 ：植 物 学 报 19 9 2 , 3 4 ( 9 ) : 6 5 5一 6 6 -
A e t o B o t Q . i e a S i n i e 。
蜜环菌诱导子对延胡索培养物
生物碱积累的影响
张荫麟 朱 敏 赵保华
(中国医学科学院药用植物资源开发研究所 , 北京 1. 0 0 9幻
摘 要
延胡索 〔co , y da ils y 。 , h 。 , 二 。 )涪养物的生长和生物碱的积累动态表明 : 生物碱的积累大
体上随着培养物的增殖而逐渐增加 ;某些生物碱如延胡索乙素等 ,在培养物生长进入静止期后
仍然继续积累 。 蜜环菌 ( rA o il 盯 ia 。 , “ , 。 ) 液作为诱导子能促进某些生物碱的积累 , 如原鸦
片碱的含量通过蜜环菌液的诱导可达到干重的 。 . 1 14 % , 而对照组中只有痕迹量 。
关钮词 积累动态 ;生物碱 ;诱导子
T H E E F F E C T O F A R M I L L A R I A 俐 rE L L E A E L IC I T O R O N
A L K A L O I D P R O D U C T I O N IN T I S S U E C U L T U R E S O F
C O R Y D A L I S Y A N H U S U O
Z h a n g Y i n
一
li n
,
( I o t i t二 t e ol 材。d i c i二 I PI 。。 多 cD 二10户二 ` , t ,
Z h u M i n a n d
C h `配 s口 A c a d e仍 y o j
Z h a o B a o玉u a
M e d i c a l s c i。 , 。 , B e i ji n g 10 0的 4)
A b s t r a c t
It h a s s h o w n t h a t a l k a l o i d a e e u m u l a t i o n i n t i s s u e e u l tu r es Of C o r y d a l is y a 移 h附“ 0 o r e h e s之r a t ed
t o s o m e e
x r e n t th e g r o w t h i n e u lut r e s
.
S o m 。 、 Ik a l o i d s , s u e h a o t改 r a h y d r o P a l m a t i n e e o n t i n u e d
t o i n e r e a s e i n t h e s上a t i e p h a s e o f c u l tu r e g r o叭h . T h e e u l t u r e s o l u t i o n of A ,仍 i l l o r i a m e l l e a a s a zl
e l i e i: or w a s a b l e t o P r o m o t
e a lk a l o i d s a e e u m u l a t ion i
n e u l t u r e s
, a s , f o r e
x a m P l e
,
P r o t o Pi n e w a s
in c r e a s e d u p : 0 0
.
114% D W
. 饰 t h e e l i e i t i n g b u t r e m a i n e d a t t r a e e l e v e l i n c u l t u r e s w it h out e l i e i -
t o r
K e y w o r d s T im e e o u r
s e ; A l k a l o i d s ; E l i c i t o r
利用植物细胞大量培养生产有经济价值的药物及其它活性物质 , 一直是活跃的生物
技术研究领域之一。 这些有用的活性成分大多属于植物细胞的次级代谢产物 。 产物不稳
本文于 1 9 , 。 年 9 月收到 , 1 9 , l 年 l 月收到修改稿 。
, 期 张荫麟等 : 蜜环菌诱导子对延胡索培养物生物碱积累的影响
定 ,甚至测不出原植物特有的成分 , 似乎已是植物细胞培养中较普遍存在的问题 。 常规措
施如调节培养基成分 (包括各种植物激素 )及 p H 值 、 光照 、温度通气条件等培养条件 , 调
控植物细胞次级代谢物的合成和积累难以获得满意的结果 , 因此必须探索有效的方法 。
近年来发现 , 用微生物作诱导子 ( e h o i t o r ) 协迫植物细胞培养物合成和 积累次级代
谢物 , 为植物细胞次级代谢的调控提供了新手段 .3[ 4J 。作为诱导子的有真菌菌丝体认 幻 、 酵母
提取物闭和重金属盐切等 。 密环菌 ( A ; m il l ar ia m o l o a) 是药用植物天麻的共生菌 , 也是
森林中寄主范围广泛的寄生真菌。 因此我们探讨了用蜜环菌液作诱 导 子 , 促 进 延胡索
( c 口
r
, J 。 z : s , a赫。 , , o ) 培养物积累生物碱的作用 。
材 料 和 方 法
延胡索培养物是继代培养 2年 以 上 的 愈 伤 组 织 。 它 在 M S + N A A .O , m g厂L+
胶 T l m g / L 培养基中一直保持旺盛的生长状态 , 在培 养过程中分化出大量的小球茎和根
状 物。 选用上述培养基 ,在 1 0 0印 m 摇床上作液体悬浮培养。 将培养物接种到 50 o m l 烧
瓶中 , 每瓶含液体培养基 1 0 m l , 平均接种量为每瓶 60 6m g 。 以后每周至少取 10 瓶培
养物称取鲜重和干重 , 同时留作分析样品 , 测定其生物碱含量。
蜜 环菌诱导子的制备 将蜜环菌菌丝体接种到含有麦戴 5馆 、 葡萄糖 2 09 、 K H ZP q
1
.独 、 v B , 10 m g , 蒸馏水 I L 的液体培养基中 ,在摇床上振荡培养约 玛 天 , 待菌丝体充分
生长后收获 ,用双层纱布过滤 , 将菌丝体充分粉碎 ,然后与滤液合并 ,在 l . Z k g / c时 下蒸
汽灭菌 20 分钟后保存备用。
生物碱的提取和分析 收获培养物 , 以自来水冲洗除去表面 的糖分 , 在 60 一 70 ℃ 下
干燥 ,粉碎 , 过 40 目筛即得样品 。 精密称取样品粉末 0 . 59 , 置沙氏提取器中用甲醇回流
提取 ,直至检查回流液无生物碱反应后 、将提取液浓缩定容于 Zm l 容量瓶中 。取溶液 l川 ,
点样于 10 x 1 0c m 硅胶高效薄层板上 , 同板有标准品随行 。 展开剂为乙醚 : 环己烷 : 甲
醇 ( 5 : 3 :0 . s v / v ) 。 展开后将板吹干 , 用碘蒸汽熏 l 分钟 , 再将碘挥尽 , 用薄层扫描仪在
2 8 o n m 下扫描 〔` , , 测定四氢黄连碱 ( T H C ) 、
。勺ù一李扮Oǎ巴阔价
ǎ切àù3`级台à阁猫
紫茧碱 ( C D L ) 、 延胡索乙素 ( T H P ) 、 海
婴粟碱 ( G L C ) 和原鸦片碱 ( P T P ) 的含
量。 扫描测定后的薄层板再用乙 酸 乙醋 : 氯
仿 : 甲醇 : 二乙胺 ( 8 : 2 : 1 : 0 . , v /V ) 作第二次
展开 , 测定黄连碱 ( C T s) 的含量 。 用各生
物碱标准品作外标 , 按所测斑点的积分面积
值计算各生物碱的百分含量 (干重多 ) 。
结 果 和 讨 论
延胡索培养物的生长和生物碱积累动态
延胡索培养物的 生 长动 态 曲 线 (图 l)
表明 ,培养物在接种 3 周后进人对数生长期 ,
一直到第 5 周是培养物增殖最快的时期 , 于
图 l
F 19
.
1 T i m e
延胡索培养物的生长动态
C O U t 吕e
C o r y d a l i s
o f e u l t u r e g r o w t五 of
y a 称 h . ` “ o
` 60植 物 学 报 3礴 卷
第 6周达到顶峰 , 以后即下降 。 5 种生物碱 的积累动态 (图 2 ) 表明 : 生物碱的积累大体上
随着培养物的生 一长而逐步增加 ; 当培养物停止生长进人静止期后 ( 6 周以后 ) ,某些生物碱
如 c D L 、 T H c 的积累不再增加 , 表现出与培养物的生长相平行的关系 , 而另一些生物
碱如 T H F 、 G L C 等仍在继续增加 。
/ T H P
/ /
7 玛 几 28培养时间 (天 ) C u l t u r e
35 4 2
弓杏沙|州.1J we月s!L”.0.0-
o C T S
o 丁 H C
,
C D L
óō !lwe川翎.曰qJ门0甲沐20侣61令公l.0压.0仇ǎù沐亡Pà次!01.召工yǎ阁卜)欲瞥鼻明
结养时 I’q ( 天 ) C u lr 以r o t im e ( d )
图 2 几种延胡索生物碱的积累动态 T H P 、 T H C 、 C D L 、 C T S 、 G L C 见表 1
t i :
1 : 。 ( Q
附注
食莽扮pà次心佗ó叮召工V乃洲件勺督娜
e o u r s o o f a c e u m u l
a t i o n o f
e u l t u r e s o f C o r y d a l i s y a
T H C , C D L C T S , G L C s e e
s e v e r a l a l k a l o i d s i n e e l l
n 人“ s “ o
n o t e s o f t a b l e l
蜜环菌诱导 子对延胡索培养物生物破含量的影响
叫甘1T理F 19 . 2
T a b l e 1 E f f e c t o f 汉 r 叨 ; l l a r , a m e l l 巴 a e l i c i t o r o n a l k a l o i d e o n t e n t o f e u l t u r e s
o f C o r y d a l i s 夕 a , h u s “ o
处 理 诱导时间 (小时 )
T i m e o f e l ic i t a
_
生物碱含量 (% 干重 )
A l k a l o i d e o n t e n t ( % D W )
T r e a t m e n r t i o n ( h ) P T P G L C T H P C D L T H C C T S
11,一d门矛U`,j几jó1ō. .`二古二,且
.…nùù几UO
E l i
.
C K
E l i
-
C K
E l i
.
C K
E 11
.
C K
E 11
.
C K
E 11
.
C K
E 1 1
C K
0
。
0 6 9
十
0
。
09 4
+
0
。
0 9 5
+
0
。
10 1
+
O
。
10 9
+
0
.
11 4
+
0
.
11 0
0
。
1 8 5
0
。
0 6 6
0
。
17 2
0
。
0 7 0
0
。
1 8 3
0
。
0 尹8
0
。
18斗
0
。
0 8 0
0
。
18 5
0
。
0 8 1
0
。
19 0
0
。
0 9 4
0
。
19 6
0
。
10 8
0
。
0 3 7
0
.
0 2 7
0
。
0 3 5
0
。
0 3 0
0
。
0 3 1
0
。
0 3 5
0
。
0 3 0
0
。
0 3 9
0
。
0 2 9
0
。
0 4 1
0
.
0 3 7
0
。
0 6 1
0
.
0 2 7
0
。
0 5 7
0
。
0 6 3
0
。
0 8 2
0
。
0 5 6
0
.
0 8 5
0
.
0 5 5
0
.
0 8 8
0
。
0 5 3
0
.
0 9 3
0
。
0 5 2
0
。
0 9 7
0
。
0 5 5
0
。
10 0
0
.
0 4 8
0
.
10 5
0
.
0 3 2
0
,
0 3 7
0
。
0 3 2
0
.
0 4 0
0
。
0 3 9
0
。
0 4 3
0
.
0 2 0
0
.
0 2 8
0
.
0 3 6
0
.
0 3 6
0
。
0 3 9
0
。
0 4 3
0
。
0 3 6
0
。
0 3 7
0
。
0 1 7
0
。
0 , 3
0
.
1 3 2
0
。
0 5 8
0
。
1 1 0
0
。
0 8 0
0
.
1 2 1
0
.
1 09
0
。
1 1 7
0
。
0 80
ùjZJōOǎ人U声之内jQ一,巴JI` .二
,`,ù,“ē、ZJ乙`d.
P T P
. 原鸦片碱 G L C . 海婴粟碱 T H P . 延胡索乙素 C D L . 紫董碱 T H C . 四氢黄连碱 C T s . 黄连碱
IE .1
. 诱导子 + . 痕迹量
P T p
.
P r o t o p i n o G L C D 一 g l a u e i n e T H p
.
D I一 t e t r a h y d r o p a l m a t i n e C D L
.
C o r y d a l i n e T H C
.
L -
r e t r a l i y d r o e o p t i s i n e C T S
.
C o P t i s i n e E l i
.
E l i e i t o r +
.
T r a e e
9 期 张荫麟等: 蜜环菌诱导子对延胡索培养物生物碱积累的影响
蜜环菌诱导子的作用
根据培养物的生长和生物碱积累的特点 , 延胡索培养物在摇床上悬浮培养 30 天后 ,
即在培养物生长最快的对数生长期 中将蜜环菌液加到培养基中 (每 10 m l 培养基加 5 m l
菌液 ) , 同时设对照 (不加菌液 )。 加人诱导子后继续培养 , 一定时间取样 ,每次取处理和对
照的各 10 瓶 , 用水漂洗 , 干燥后 留作分析样品 。 实验结果见表 1。
表 1 显示 : 蜜环菌诱导子提高了培养物次级代谢物 (特别是具有抗菌 、 消炎等活性的
生物碱 C T S 、 G L C 和 P T P ) 的合成能力 ,尤其对 P T P 的生成有显著的促进作用 。 P T P
在培养物中只有痕迹量 , 经蜜环菌诱导子处理 35 小时后 , 含量可达干重的 0 . 1 14 多。
在自然界中 , 当植物体遭受微生物的侵袭时 ,作为一种防卫手段 , 植物细胞趋向于合
成有抗菌活性的次级代谢产物 。 用微生物作诱导子促进了培养物次级代谢物的合成 , 表
明上述现象也存在于离体培养中 。 在大规模培养时 , 可先使培养物充分增殖 ,然后用适当
的诱导子促进其次级代 谢物的合成和积累。 在细胞培养中产生原植物具有的次级代谢物
的不稳定现象 , 并不意味着培养细胞已丧失了合成这些代谢物的能力 , 而是没有适当的条
件充分表达这种能力。 诱导子诱导次级代谢的机理还不十分清楚 , 已知它能 “ 开启 ” 次级
代谢中某些关键侮的活性 〔习。 可以预见 , 诱导技术的研究将会给生物技术提供一个新手
段 , 在有用的次级代谢物的商品生产上发挥巨大的潜力 。
参 ` 华 文 献
[ l 」
[ 2 ]
朱敏 , 1 , 8 , : 元胡类生物碱的高效薄 层层析定量研究 。 药物分析杂志 , :5 13 ,一 1 4 2。
Ch
a p p e l l , J , R
.
N a b l e
,
P
.
F l e m i n g
, R
.
A
.
A n d e
r s e n a n d H R
.
B u r t o n , 19 8 7 : A e e u m u l a t i o n o f e a P s id i o l
i n t o b
a e e o e e l l e u l t u r e s t r e a t e d w i t h f u n g a l e l i
e
i t o
r
.
P h y谬 o c人e仍 15 才r夕, 2 6 : 2 2 5 9一 2 2 6 0 .
D i c o
s
m o
,
P
.
a n d 5
.
G
.
T a l卜e io , 19 8 5 : P l a n r ` e l l e u l r u r e s a n d m i e r o b i a l i n 吕 u l r i n t e r a e r i o n s w i rh bj o t e c b n 卜
Io g i c
a l p o t e n t i a l
.
T r
。 , d : B i o多ec k o o l· , 3 ( 5 ) : 1 10一 1 1 1 .
气
D i e o s m
o , F
.
a n d M
.
M i s a w a
,
1 9 8 5
二 E l i e i t i n g s e e o n d a r y m e t a b o l i s m i n P l a n t c e l l c u l t u r e s
.
T r 亡” d s B i-o
韶 c h 路 0 1 , 3 : 3 1 8一3 2 2 .
H o ld e n
,
M
.
A
. ,
P
.
R
.
H o ld e n a n d M
.
M
.
Y e o m a n
, 19 8 8
: E l i
c
i t a t i o n o f e e l l e u l t u
r e s
.
I n : “ M 4 n i P u l a t i n g
S e c o n d a r y M e t a obl i
s m i n uC l
t u r e , , (R i e h a r d
.
J
.
R o b i n s e t a l
.
e d s
.
)
.
aC m b
r i d g e U n i v e r s i t y P r e s s
, p P
.
5 7一6 5 .
M
o n i
r ,
H
.
a n d P
.
P r o k s
e
h
,
19 8 9 : Y
e a s t e x t r a c t i n d u e e d a e c u m
u
l
a t i o n o f b e n
z o f u r a n s i n c
e
l l s u s P e n s i叻
e u l t u r e s o f 才 g 亡 r a t i称 a a d ` 介。 夕人o ar
.
P五y t o c 人e仍 i ` t r y, 2 8 : 2 9 9 9一 3 0 0 2 .
T a l l e
v i
,
5
.
G
.
a n d F
.
D i e o s m o
,
19 8 8
: s t im 立l a t i o n o f i n d o l e a l k a l o id e o n t e n t i n v a n a d i u m 一 t r e a t e d c a : 人a -r
a 称 zh u ` r o s e u s s u 3 P e n s i o n e u l t u r e s . p l a ” 多a M ` d i c a , 5 4 : 1 4 9一 15 2 .
yT
ze r , R
.
T ” U
.
E il e
r t
,
c
.
0
.
M
.
R i jn d e
r s
,
1
.
A
.
R oe w
e r a n d w
.
G
.
w
.
K u r z
,
1 9 5 5 : S
e
m i
一 c o n t in
uosp r o d u e t i o n o f s a n g u i n a r i n e a n d d i h y d r os a n卯i n a r i n e b y p a户a 。 己 r 了。 仍 。 i j` r “ 形 L . ` e l l s u s p e n s i o n e u i r u r e s t r o -a
t相 w i t h f u n g a l h o m o g e n a te . P I口 . 不 C七11 R e户, 7 : 4 1 0一 4 13 .
, .J飞esJ魂j通.r.L户.`
5e[]
ō .J,J介了n几r. L.1`