全 文 ：·综 述·
基金项目:国家自然科学基金资助项目(31201666)
作者简介:刘蒙蒙，男，博士 研究方向:药用真菌学 * 通讯作者:郭顺星，男，博士，教授，博士生导师 研究方向:药用植物菌根生物
学 Tel /Fax:(010)62829619 E-mail:sxguo1986@ 163. com
药用真菌猪苓分子生物学研究进展
刘蒙蒙，邢咏梅，郭顺星* (中国医学科学院北京协和医学院药用植物研究所，北京 100193)
摘要:目的 综述猪苓分子生物学研究进展。方法 以近些年来研究猪苓的文献为基础，对猪苓分子生物学的研究内容
进行归纳和总结。结果 将猪苓分子生物学的研究进行归类，其主要研究内容包括 3 个方面:现代分子标记技术在猪
苓分子鉴定中的应用;现代分子标记技术在猪苓遗传多样性以及种群结构研究中的应用;猪苓功能基因克隆及其发育
过成中差异表达基因的研究。结论 猪苓的分子生物学研究仍处于起步阶段，需要进行更加深入的探索，促进其研究
发展。
关键词:猪苓;种群结构;遗传多样性;基因克隆
doi:10. 11669 /cpj. 2014. 21. 001 中图分类号:Ｒ284 文献标志码:A 文章编号:1001 － 2494(2014)21 － 1873 － 04
Progress in Molecular Biology Ｒesearch of Polyporus umbellatus
LIU Meng-meng，XING Yong-mei，GUO Shun-xing* (Institute of Medicinal Plant Development，Chinese Academy of Medical
Sciences Peking Union Medical College，Beijing 100193，China)
ABSTＲACT:OBJECTIVE To review the progress in the field of molecular biology research of Polyporus umbellatus. METHODS
Base on the literatures in recent years，relevant researches were reviewed. ＲESULTS The molecular biology research of Polyporus
umbellatus were summarized and classified into three fields:application of molecular marker technique in the identification of Polyporus
umbellatus，application of molecular marker technique in the reseaches of genetic diversity and population structure of Polyporus umbel-
latus，and researches of functional gene clone and differential expression genes in development of Polyporus umbellatus. CONCLU-
SION The molecular biology research of Polyporus umbellatus is still at the beginning stage and need to be explored further to get
great achievements.
KEY WOＲDS:Polyporus umbellatus;population structure;genetic diversity;gene clone
猪苓在分类学上隶属于真菌门 Eumycophyta、担子菌纲
Basidiomycetes、多孔菌目 Polyporales、多孔菌科 Polyporaceae，
学名为 Polyporus umbellatus(Pers. )Fries。猪苓主要产于我
国陕西、云南、甘肃、山西、四川、河北、河南、安徽、吉林、黑龙
江等省区，其药用部位为干燥的菌核。具有利尿、消肿之功
效，中医临床上常用于治疗急性肾炎、全身浮肿、小便不畅、
尿急尿频、尿道疼痛以及急性胃炎等疾病［1］。目前，对猪苓
的研究已在中药化学［2-3］、药理学［3-5］、解剖生物学［6-8］及生理
生化［9］等方面取得了很多的进展。近年来国内外学者利用
现代分子生物学技术手段对猪苓进行了遗传多样性、种群结
构、功能基因克隆分析等多方面的研究，为深入研究该珍稀
药用真菌的生长发育、代谢调控以及优质种质资源的开发、
利用与保护提供了分子生物学的基础。笔者在此对近年来
猪苓分子生物学方面的最新研究进展进行总结概括，以期为
猪苓菌的深入研究提供参考。
1 猪苓的分子鉴定
1. 1 基于酯酶(EST )及过氧化物酶 (POD )同工酶的分子
鉴定
酶是基因的表达产物，同工酶谱的差异性能很好地衡量
物种间的亲缘关系。如同其他的形态标记，同工酶可作为生
化遗传标记已广泛应用于发育遗传学、群体遗传学、分类学
等多个领域。
EST 同工酶是水解酯酶中的一类，其受环境因素影响
小，性质稳定，其经聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳(PAGE)后特
异性染色，条带显示清晰，重复性良好。研究表明，EST 同工
酶谱的分析在物种的分类鉴定、种系发生和遗传进化等方面
的研究中都具有重要的应用意义。因此，可以用 EST 同工酶
作为遗传标记物反映种群的基因结构变化以及种内、种间的
亲缘关系。
POD在真菌中广泛而大量存在，具有明显的种属和发育
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阶段特异性，在一定程度上反映真菌的系统发生。因此，
POD同工酶在物种鉴定、起源、进化和分类等方面研究上发
挥着重要作用［10］。
陈文强等［11］对陕西留坝 3 种不同形态猪苓菌核(猪屎
苓，鸡屎苓和铁蛋屎苓)分离的营养菌丝的 EST 和 POD 进
行了电泳分析。结果显示，3 种猪苓营养菌丝的 EST 同工酶
和 POD同工酶的生物活性相近。通过利用过氧化物同工酶
UPGAMA进行聚类分析，进一步证明 3 种不同菌核形态的猪
苓系同种。但是，同工酶作为遗传标记主要有 2 大缺点:一
是图谱易受环境和发育阶段的影响;二是图谱多态性不够，
一定程度上不能满足物种鉴定的要求，因此需要建立多态性
更高的标记。
1. 2 基于 PCＲ 技术的分子标记法
随着分子生物学的不断发展，以 PCＲ 技术为基础的分子标
记方法成功应用于猪苓的分子鉴定研究中，主要是内转录间隔
区(internal transcribed spacer，ITS)分子标记的应用［12］。
ITS是中药材中应用最广的一种分子标记方法，已成功
应用于猪苓的亲缘关系的研究。邢晓科等［13］基于序列比对
方法，利用 ITS 序列阐明了猪苓与其伴生菌之间的亲缘关
系。其通过对猪苓菌丝、野生猪苓子实体、野生猪苓菌核和
其伴生菌的 5. 8S rDNA及其序列两侧的 ITS1 区和 ITS2 区进
行序列比对分析，发现猪苓与其伴生菌的 ITS 序列同源性高
达 99. 36%，这表明猪苓与其伴生菌之间有很近的分子亲缘
关系。刘开辉等［14］通过利用 PCＲ技术对 3 种形态的猪苓菌
核，包括猪屎苓、铁蛋猪屎苓以及鸡屎苓的 rDNA基因(ITS1-
5. 8S rDNA-ITS2)和 β-tub1 基因片段进行扩增，并对扩增所
得的产物片段进行序列分析表明，3 种不同形态的猪苓菌核
菌丝体 rDNA(ITS1 -5. 8SrDNA-ITS2)的扩增片段大小均为
537 bp，扩增 18S rDNA所得的片段长度均为 882 bp，同时，3
种形态的猪苓菌核菌丝体的 β-tub1 片段扩增长度大小相同，
均为 480 bp。序列比对结果揭示，这 3 种猪苓菌核菌丝体的
rDNA和 β-tub1 片段的同源性高达 100%。作者进一步利用
Clusta-X软件对 3 种形态菌核猪苓菌丝的 ITS1 和 ITS2 序列
进行校正，并依据 GenBank 数据库中上传的序列信息，按照
N-J算法聚类，运行自举法检验(1 000 次重复)后得到了系
统发育树。将不同形态菌核猪苓菌丝体的 ITS 序列和 Gen-
Bank数据库中猪苓的 ITS序列进行比对分析，结果显示其同
源性高达 100%，且与已知的猪苓(P. umbellate)菌株类聚于
同一进化分支。这充分表明尽管猪苓菌核形态差异较大，但
为进化地位上的同一物种。
2 遗传多样性及种群结构研究
DNA 分子标记技术不仅在猪苓分子鉴定中发挥重要的
作用，而且在猪苓遗传多样性、亲缘关系、种群结构、生物资
源学以及保护生物学等研究方面也具有广阔的应用
前景［15-16］。
2. 1 基于相关序列扩增多态性(SＲAP)的遗传多样性研究
SＲAP (sequence-related amplified polymorphism)标记是
以 PCＲ方法为基础，通过设计独特的引物以达到对特定基
因的开放阅读框区域进行扩增的技术。目前，SＲAP 在食
(药)用真菌中的应用还比较局限［17］。秦亚丽等［18］利用 49
对适合猪苓的 SＲAP引物对不同产地(陕西省、河南省、吉林
省、四川省、云南省、河北省、湖北省)的猪苓进行遗传多样性
分析。PCＲ扩增后，扩增产物经聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳
(PAGE)后进行银染，结果显示，有 1 219 个位点被扩增出
来，平均每对引物扩增出 24. 88 个位点，多态性条带共有 1
023 条。这些统计结果表明，猪苓材料种质间存在着丰富的
遗传多样性。进一步利用所得到的扩增结果计算不同产地
猪苓间亲缘关系［Jaccards 遗传相似系数(GS)］，结果显示，
吉林省和四川省的猪苓种之间的亲缘关系较近(GS 最大为
0. 78);而河南省与河北省的猪苓种间的亲缘关系较远(GS
最小为 0. 15)。经聚类分析以及主成分分析结果表明，不同
地区的供试材料聚集为一类，说明供试材料与地理位置并没
有必然联系［18］(图 1)。
2. 2 基于多分子标记联合遗传多样性研究
大量的研究工作采用多种分子标记研究猪苓居群的遗
传多样性和遗传结构，为种质资源保护策略的制定提供理论
指导。单链构象多态性(single-stranded conformational poly-
morphism，SSCP)标记技术操作简单，将 PCＲ产物进行热处理
或者化学处理变性后可直接用来电泳分析，所得谱图既可以
用来分析 DNA序列的多态性，也可用于检测 DNA 片段的突
变，且之后进行测序分析可以得到具体的突变位点信息［19］。
目前，SSCP分子标记技术在真菌遗传多样性方面的应用还
很少［12］。邢晓科等［20］采集全国范围内 12 个省 42 个地区的
猪苓菌核，对 nrDNA ITS和 28S rＲNA(LSU)序列进行比对分
析。结果显示，采自不同地区的猪苓其 ITS和 LSU序列都存
在显著性差异;进而用 ITS、LSU 以及 ITS + LSU 3 种序列分
别建立分子进化树进行分析发现全国范围内的猪苓可以分
为 4 个大的类群。研究结合 SSCP 标记技术对 ITS 以及 LSU
序列进行异质性分析，其结果显示，在 9 个样品中(陕西、河
南、甘肃、山西、吉林和黑龙江)发现了 ITS 或者 LSU 的异质
性，只有在河南和甘肃的样品中同时具有 ITS 和 LSU的异质
性。这些结果都暗示河南、甘肃、陕西 3 省可能是猪苓的起
源中心，为猪苓物种资源保护提供了坚实的理论基础。
图 1 不同产地猪苓的相关序列扩增多态性结果的聚类树
状图［18］
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3 猪苓的功能基因及差异表达基因研究
猪苓功能基因组学研究相对滞后，目前仅限于功能基因
克隆分析及差异基因这 2 个方面的研究。猪苓多糖是猪苓
中发现较早的关键药效成分之一，具有抗肿瘤、增强机体免
疫力等多种重要药理作用［21-22］。国内外对猪苓多糖的研究
大部分集中在中药药理学、发酵工艺、提取分离工艺及结构
鉴定等研究工作上。围绕着多糖的代谢与合成，仅有关于多
糖合成的基因克隆的报道。秦亚丽等［18］从猪苓中克隆了调
控多糖合成的 UDP-葡萄糖焦磷酸化酶(UDP-glucose pyro-
phosphorylase，UGPase)基因，测序后经序列比对发现，该基因
与大肠杆菌 UDP-葡萄糖焦磷酸化酶的核苷酸序列同源性达
97%，而与索氏志贺菌的核苷酸序列同源性达 96%以上，但
对于该基因序列功能还需要进一步验证。焦磷酸化酶在糖
代谢合成中为多糖的合成提供糖基供体，可以通过基因克隆
增加 UGPase表达量，形成更多的多糖前体，从而提高多糖的
产量。该研究成功克隆了猪苓的 UGPase 基因，为利用生物
工程手段提高猪苓多糖产量提供了良好的理论基础。宋超
等［23］利用 3-ＲACE-PCＲ方法从猪苓中首次克隆得到与其生
长发育相关的溶血素基因。其克隆结果显示，药用真菌猪苓
溶血素基因与杨树菇溶血素基因的同源性为 60%，推论其与
杨树菇溶血素类家族蛋白具有相同的三维结构。作者进一
步利用 qPCＲ技术证明猪苓溶血素基因在菌核形成初期的
表达量显著高于菌丝中的转录水平，阐明了该基因在猪苓菌
核形成过程中具有一定作用。邢咏梅等［24］利用 qＲT-PCＲ对
猪苓菌核及菌丝中的 Nox基因表达量进行了检测，其结果发
现在菌核不同生长时期 Nox 基因表达量都高于在菌丝中的
表达量，说明该基因参与了猪苓菌核的形成过程。
邢晓科等［25］尝试从分子水平上解释伴生菌在猪苓菌核
形成过程中所起到的作用。通过 mＲNA 差异显示技术研究
了伴生菌对猪苓菌丝基因表达的影响，经过实验分析获得了
2 个具有差异性基因，通过 Genebank 数据进行对比分析，未
发现与其同源的序列。因此，这 2 个基因的功能尚不能阐
明。但是，本研究为猪苓功能基因的研究奠定了一定的
基础。
4 展 望
猪苓是我国珍贵的中药资源，利用现代分子标记技术不
仅快速地对猪苓进行鉴定，揭示物种资源濒危状况，还可以
为资源保护和可持续利用提供重要的理论参考。目前，猪苓
的研究主要集中于资源以及栽培方面［26-27］，对其遗传多样性
研究很少。而且研究主要集中在猪苓主产区，这与猪苓菌核
样品采集难度大、保存比较困难有很大关系。此外，猪苓的
遗传多样性评价还没有统一的标准，研究方法和评价标准比
较单一，很难精确全面地评价其遗传多样性。未来研究中需
要继续加强分子标记研究，将分子标记广泛地应用在种系发
生、地理起源推断、物种进化及环境适应性的研究中，更加精
确的评估猪苓遗传多样性，运用于猪苓资源的保护中。
猪苓功能基因的研究起步较晚，目前研究只是在克隆分
析及差异基因分析 2 方面有所进展，目前尚缺乏对其进行系
统的基因组和转录组研究。功能基因的研究目前只限于基
因的克隆和比对分析，对基因功能验证方面的研究报道几乎
为零。因此，应用第二代测序技术(Next Generation Sequen-
cing，NGS)以及生物信息学对猪苓基因组和转录组信息进
行深度挖掘，以期获得大量的基因资源，用以解释猪苓生长
发育、次生代谢调控等巨大意义的生物学现象。此外，建立
成功的遗传转化体系，为进一步建立过表达转基因或者基因
沉默等技术提供坚实的实验基础，以期能筛选大量的候选基
因并开展候选基因功能分析，获得数量可观的能够提高猪苓
活性成分含量、或者调控猪苓生长周期等的关键调控基因，
为将来利用基因工程手段为猪苓的育种及资源保护提供
服务。
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(收稿日期:2014-03-26)
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doi:10. 11669 /cpj. 2014. 21. 002
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