全 文 ：收稿日期：2009-09-22
基金资助：国家自然科学基金（30729001 和 U0832001），广州市科技
计划项目（2007J1-C0251）
作者简介 ： 夏承来 （1981-）， 男 ， 药理学博士研究生 ， 电话 ：
020-61648537
通讯作者：刘叔文（1972-），男，博士，教授，博士生导师。 研究方向：抗
病 毒 药 物 药 理 学 ， 电 话 ：020-61648538，020-61648655，E-mail:
liusw@smu.edu.cn
日本蛇菰中咖啡酰基葡萄糖类化合物抑制 HIV-1进入的机制
夏承来 1，毛芹超 1，李润明 1，陈之朋 1，姜世勃 1,2，姜志宏 1,3，刘叔文 1（1 南方医科大学药学院 ，广东 广州
510515；2纽约血液中心 LFK研究所，纽约 10065 美国；3香港浸会大学中医药学院，九龙塘 香港）
摘要：目的 研究从日本蛇菰中分离的咖啡酰基葡萄糖类化合物抑制 HIV-1 进入的作用机制。 方法 利用 HIV-1 假病毒
体系，并结合针对 gp41 包膜蛋白的 ELISA 以及分子对接方法，对日本蛇菰分离的咖啡酰基葡萄糖类化合物抑制 HIV-1
进入机制进行研究。结果 我们首先用 HIV-1 Env假病毒来检测六个咖啡酰基葡萄糖类化合物（终浓度：25 μg·ml-1）的抑
制活性，发现 1,2,6- 三 -O- 咖啡酰基 -β-D- 吡喃葡萄糖（TCGP）和 1,3- 双 -O- 咖啡酰基 -4-O- 没食子酰 -β-D- 吡喃葡萄
糖（DCGGP）具有较好的抑制病毒进入靶细胞的作用。进一步量效关系研究表明，两个化合物的病毒抑制活性呈剂量依
赖性，它们的 IC50值分别是（5.5 ± 0.2）和（5.3±0.1） μg·ml-1。这两个化合物的抑制活性与其抑制 gp41 六螺旋束结构形成
的机制有关。 分子对接表明，它们均能靶向 gp41 上 N-螺旋三聚体的靶穴位置。 结论 1,2,6- 三 -O- 咖啡酰基 -β-D- 吡
喃葡萄糖（TCGP）和 1,3- 双 -O- 咖啡酰基 -4-O- 没食子酰 -β-D- 吡喃葡萄糖（DCGGP）可以较好的抑制 HIV-1 Env 假病
毒感染靶细胞，可作为先导化合物来研发抗 HIV-1 新药。
关键词：HIV-1 gp41；咖啡酰基葡萄糖类化合物；假病毒；HIV-1 进入抑制剂
中图分类号：R965.1, R966 文献标识码：A 文章编号：1673-4254(2010)04-0720-04
Study of the mechanism of caffeoyl glucopyranoses in inhibiting HIV-1 entry using
pseudotyped virus system
XIA Cheng-lai1, MAO Qin-chao1, LI Run-ming1, CHEN Zhi-peng1, JIANG Shi-bo1,2, JIANG Zhi-hong1,3, LIU Shu-wen1
1School of Pharmaceutical Sciences, Southern Medical University, Guangzhou, 510515, China; 2Lindsley F. Kimball Research Institute,
New York Blood Center, New York, USA; 3School of Chinese Medicine, Hong Kong Baptist University, Hong Kong, China
Abstract: Objective To investigate the inhibitory activities of caffeoyl glucopyranoses purified from Balanophora japonica
Makino on HIV entry and their mechanism. Methods HIV-1 Env pseudovirus was used to evaluate the anti-HIV-1 activity of
those compounds. ELISA and molecular docking were used to study the mechanism of the actions of the active compounds.
Results We used the HIV-1 Env pseudovirus to test the anti-HIV-1 activity of the six phenolic compounds (final concentration
25 μg/ml), and found that only 1,2,6-Tri-O-caffeoyl-β-D-glucopyranose (TCGP) and 1,3-Di-O-caffeoyl-4-O-galloyl-β-D-
glucopyranose (DCGGP) could effectively inhibit the entry of HIV-1 Env pseudovirus into the target cells in a dose-dependent
manner, with IC50 values of 5.5±0.2 and 5.3±0.1 μg/ml, respectively. These two compounds could also blocked the gp41
six-helix bundle formation. Molecular docking analysis suggested that they might bind to the hydrophobic cavity of the gp41
N-trimeric coiled-coil. Conclusion TCGP and DCGGP are potent HIV-1 entry inhibitors targeting gp41 and can serve as lead
compounds for developing novel anti-HIV-1 microbicides for prevention of sexual HIV-1 transmission.
Key words: HIV-1 gp41; caffeoyl glucopyranoses; pseudovirus; HIV entry inhibitors
获得性免疫缺陷综合征（AIDS）是由人类免疫缺
陷病毒（HIV）感染引起的一种严重威胁人类生命健
康的疾病， 超过 80%的感染者是用于性接触而传染
的［1］。 过去的经验证明，只有疫苗才能最终地消灭一
种传染性疾病。然而，艾滋病的疫苗尽管历经 25年的
研究，依然进展缓慢。 2002年和 2007年，两项艾滋病
疫苗的大规模临床试验， 包括激活针对 HIV 的体液
免疫和细胞免疫， 均不能有效保护志愿者免受 HIV
感染，而宣告失败。因此，有效的疫苗离最终上市还有
很长的一段时间。 鉴于 HIV治疗药物，尤其是高效抗
逆转录治疗（HAART）的成功，人们寄希望于使用具
有抗 HIV作用的药物， 特别是 HIV进入抑制剂和逆
转录酶抑制剂， 来预防 HIV 的感染， 尤其是作用在
HIV整合到人体基因组之前的药物，包括逆转录酶抑
制剂和 HIV进入抑制剂。 使用的方法包括暴露前预
防 药 物 （Prep） 和 阴 道 用 的 杀 微 生 物 剂
（Microbicides）。 HIV进入抑制剂由于其在 HIV感染
的最初阶段进行阻断，而最受关注。然而，目前两种批
准上市的 HIV进入抑制剂仅有两种，且价格高昂，尤
其是多肽药物恩夫韦肽( Enfuvirtide)，不适合作为艾
滋病的预防药物使用。 因此，筛选和发现廉价、高效、
低毒的 HIV进入抑制剂作为艾滋病预防药物具有十
分重要的意义。许多天然来源的小分子化合物具有抑
南方医科大学学报(J South Med Univ) 2010;30(4)720· ·
制 HIV进入靶细胞的活性，如儿茶素类化合物(-)- 表
没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）和茶黄素衍生物
等。 这些化合物由于是茶叶中的主要成分，具有良好
的安全性，是潜在的艾滋病预防药物。
葡萄糖类化合物是另外一类自然界中含量极为
丰富的化合物，有报道此类化合物也能够抑制逆转录
病毒吸附到靶细胞表面［2］，可能在 HIV进入靶细胞的
阶段发挥阻断作用。我们此前也报道了一个来源于蛇
菰科植物日本蛇菰的单体化合物 1,2,6- 三 -O- 没食
子 酰 -β-D- 吡 喃 葡 萄 糖 （1,2,6-Tri-O-galloyl-β-D-
glucopyranose, TGGP）能通过抑制 HIV gp41 六螺旋
束结构的形成，阻断 HIV与靶细胞的融合过程［3］。 在
本实验中，我们对从蛇菰科植物日本蛇菰地下和地上
部分提取的另外六个咖啡酰基葡萄糖类化合物 ［4-5］，
利用假病毒体系 ， 并结合针对 gp41 包膜蛋白的
ELISA 以及分子对接方法对其抑制病毒进入的作用
机制进行研究。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 细胞与质粒 U87.CD4.CXCR4 细胞由美国
NIH AIDS Research and Reference Reagent Program
提供，用含 10%胎牛血清（美国 Gibco公司）、1 μg·ml-1
嘌呤酶素 、300 μg·ml-1 G418、2 mmol·L-1 L- 谷氨酰
胺 、青霉素 （100 U·ml-1) 和链霉素 （100 μg·ml-1）的
DMEM培养基培养。 HEK293T细胞（人胚肾细胞）为
本研究室保存，生长于含 10%胎牛血清、2 mmol·L-1 L-
谷氨酰胺、青霉素（100 U·ml-1)和链霉素（100 μg·ml-1）
的 DMEM培养基中。 感受态细胞 DH5α为本实验室
自 制 。 质 粒 pHXB2，pVSV-G 和 含 荧 光 素 酶
（luciferase） 报告基因的 HIV-1 缺陷型质粒 pNL4-3.
Luc.R-E- 均由美国 NIH AIDS Research and Reference
Reagent Program 提供。
1.1.2 试剂 荧光素酶报告基因检测试剂盒购自美国
Promega 公司，转染试剂由香港 D-gen 公司周辰博士
提供，p24定量试剂盒购自法国 BIOMERIEUX公司。
多 肽 N36、C34、T-20 由 美 国 纽 约 血 液 中 心
Microchemistry 实验室按照标准的 FMOC 方法固相
合成。 NB-64 由军事医学科学院六所谢蓝研究员提
供。 抗 gp41六螺旋束结构的兔多抗及单克隆鼠抗体
NC-1 由纽约血液中心制备； 生物素标记的羊抗鼠
IgG（Boehringer Mannheim, USA）；链亲合素标记的辣
根过氧化酶 （SA-HRP）(Zymed, USA)；3,3,5,5- 四甲
基联苯胺（TMB）(Sigma, USA)。其余试剂为国产分析
纯。
1.1.3 样品 松柏苷（Coniferin）、1-O-香豆酰基 -β-D-
吡喃葡萄糖（1-O-coumaroyl-β-D-glucopyranose,CGP）、
1,2- 双 -O- 咖啡酰基 -β-D- 吡喃葡萄糖 （1,2-Di-O-
caffeoyl-β-D-glucopyranose, DCGP）、1,2,6- 三 -O- 咖
啡酰基 -β-D- 吡喃葡萄糖（1,2,6-Tri-O-caffeoyl-β-D-
glucopyranose, TCGP）、1,3- 双 -O- 咖啡酰基 -β-D- 吡
喃 葡 萄 糖 （1，3-Di-O-caffeoyl-β-D-glucopyranose,
DCGP）、1,3- 双 -O- 咖啡酰基 -4-O- 没食子酰 -β-D-
吡 喃 葡 萄 糖 （1,3-Di-O-caffeoyl-4- O-galloyl-β-D-
glucopyranose,DCGGP），均从蛇菰科植物日本蛇菰地
下和地上部分提取分离得到［3-4］。
1.2 方法
1.2.1 HIV-1 Env 假病毒的包装以及收获 根据文献
介绍的方法 ［6］，在 6 孔板内接种 HEK 293T 细胞，次
日细胞达 90%汇合时，每孔加入 3 μg pHXB2 质粒和
1 μg pNL4-3.luc.R-E- 质粒共共转染 HEK 293T 细
胞。 转染 6 h后更换新鲜培养基，于 48 h后分别收集
细胞培养上清，过滤,分装置于-80 ℃备用。 用同样的
方法获得 VSV-G型假病毒。
1.2.2 化合物抗假病毒感染活性的检测 按荧光素酶
报告基因检测试剂盒说明书操作。 于 96孔细胞培养
板中，每孔接种 100 μl (1×105/ml) U87.CD4.CXCR4
细胞。 次日将 50 μl 梯度稀释的化合物和与 50 μl
HIV-1 Env假病毒混合，37℃预孵育 30 min， 然后将
此混合液加入细胞中，感染过夜，次日更换新鲜培养
液。 48 h后，用荧光素酶报告基因检测试剂盒检测化
学发光。方法为首先吸干培养液，PBS洗涤一次，再次
吸干后加入 50 μl 细胞裂解液裂解细胞，30 min 后将
40 μl 裂解后的溶液转至白色微孔板中， 加入 50 μl
检测试剂，混合均匀，立即用酶标仪（Tecan）检测化学
发光值。
1.2.3 抑制 gp41六螺旋束结构形成活性的 ELISA法
根据我们以前报道的方法 ［7］，将 2 μmol·L-1衍生
于 gp41 NHR 区的多肽 N36 先与梯度稀释的待测化
合物在 37℃孵育 30 min， 然后再加入 2 μmol·L-1衍
生于 gp41 CHR 区的多肽 C34，继续孵育 30 min。 将
孵育好的混合液加入到包被好兔抗 N36/C34 的多抗
（2 μg·ml-1， 用 pH 8.8的 0.1 mol·L-1 Tris-HCl 缓冲液
稀释） 的 96 孔酶标板中， 孵育 1 h。 然后依次加入
gp41 六螺旋束特异的鼠单抗 NC-1、生物素标记羊抗
鼠 IgG、SA-HRP 和 TMB， 检测 450 nm 处的吸光度
值，判断化合物抑制 gp41六螺旋束结构形成的活性。
采用 Compusyn软件计算半数抑制浓度（IC50）。
1.2.4 化合物与 gp41 的分子对接 （Docking） 采用
SYBYL7.3 软件的 Docking 模块， 将化合物分别与
gp41蛋白结构中的沟槽进行对接， 并以 NB-64 作为
阳性对照化合物。 在 Protein Data Bank 获取 gp41 的
夏承来, 等.日本蛇菰中咖啡酰基葡萄糖类化合物抑制 HIV-1 进入的机制研究第 4 期 721· ·
图 1 咖啡酰基葡萄糖类化合物对 HIV-1 Env假病毒以
及 VSV-G型假病毒的抑制作用
Fig.1 Inhibitory activities of caffeoyl glucopyranoses
compounds on the infection by HIV-1 Env and
VSV-G pseudotyped viruses
A: TCGP; B: DCGGP
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
HIV-1 Env pseudovirus
VSV-G pseudovirus
25 12.5 6.25 3.13 1.57 0
Concentration of TCGP(μg/ml)
%
In
hi
bi
tio
n
of
ps
eu
do
vi
ru
si
nf
ec
tio
n
25 12.5 6.25 3.13 1.57 0
Concentration of DCGGP(μg/ml)
100
80
60
40
20
0
%
In
hi
bi
tio
n
of
ps
eu
do
vi
ru
si
nf
ec
tio
n
HIV-1 Env pseudovirus
VSV-G pseudovirus
A
B
25 12.5 6.25 3.13 1.57 0.79 0.39
Concentration of compounds(μg/ml)
TCGP
DCGGP
NB-64
AZT
%
In
hi
bi
tio
n
of
6-
H
B
fro
m
at
io
n
100
80
60
40
20
0
图 2 TCGP和 DCGGP对 HIV-1 gp41 六螺旋束结构形
成的抑制作用，分别以 NB-64 和 AZT 作为阳性和阴性
对照化合物
Fig.2 Inhibitory activity of TCGP and DCGGP on
gp41 six-helix bundle (6-HB) formation NB-64 and
AZT were used as positive and negative control
compounds, respectively
表 1 日本蛇菇来源的咖啡酰基葡糖糖类化合物抑制
HIV包膜蛋白假病毒的活性筛选
Tab.1 Inhibitory activities of caffeoyl glucopyranoses
compounds from Balanophora japonica Makino on
HIV envelope pseudovirus
Compound Inhibition rate（%, Mean ± SD）
Coniferin -5.69±4.36
CGP -12.88±0.18
DCGP 22.33±2.08
TCGP 70.60±1.45
DCGP 6.78±2.27
DCGGP 64.12±1.27
NB-64 73.10±3.41
X射线衍射数据（PDB 编号：1aik）。 用 Merge 算法连
接 1aik中的三个 N-C肽二聚体， 形成六螺旋聚体结
构。 移去六螺旋聚体中的 C 肽， 剩下 3 条 N肽形成
N-螺旋三聚体，以此为对接靶点。 在 Surflex-dock 中
选择 automatic 模式生成 protomol。 按 Surflex-dock
的操作说明进行分子对接。
2 实验结果
2.1 日本蛇菇来源的咖啡酰基葡萄糖类化合物抑制
HIV假病毒活性的筛选
采用 HIV 假病毒检测体系， 以 25 μg·ml-1的终
浓度，我们检测了从日本蛇菰分离的六个咖啡酰基葡
萄糖类化合物抑制 HIV假病毒感染的活性。 六个化
合物中， 仅 TCGP 和 DCGGP 有抑制 HIV 假病毒感
染的活性，结果见表 1。
2.2 TCGP和 DCGGP 能特异性地抑制 HIV-1 Env假
病毒，且具有剂量依赖性
随后， 我们检测了 TCGP 和 DCGGP 抑制 HIV
假病毒感染的量效关系，结果见图 1。 两个化合物抑
制 HIV-1 Env假病毒感染的 IC50分别为 （5.5±0.2）和
（5.3±0.1） μg·ml-1。 为判断这两个化合物是否特异性
地作用于 HIV包膜蛋白，我们随后采用 VSV-G 假病
毒来验证。 结果表明，这两个化合物没有抑制 VSV-G
假病毒感染的作用。由于这两个假病毒仅在包膜蛋白
上具有差异，表明这两个化合物能够特异性地作用于
HIV-1的包膜蛋白，抑制 HIV-1进入靶细胞。
2.3 TCGP和 DCGGP能抑制 gp41六螺旋束的形成
采用夹心 ELISA 方法和 N36、C34 多肽，在体外
可以检测 HIV-1 gp41 六螺旋束结构的形成。 使用这
一方法，我们证明阴性对照化合物 - AZT (HIV 逆转
录酶抑制剂)不能抑制六螺旋束的形成，而阳性对照
化合物 NB-64 和待测化合物 TCGP 和 DCGGP 均能
非常有效地抑制 gp41六螺旋束的形成（图 2）。 TCGP
和 DCGGP 的 IC50 分别为 （3.67±0.34） μg·ml-1 和
（2.87±0.33） μg·ml-1。
2.4 TCGP和 TCGGP能靶向 gp41 上 N- 螺旋三聚体
的沟槽
采用 SYBYL7.3软件，将化合物与 gp41上 N- 螺
旋三聚体的沟槽进行对接，我们发现 TCGP、DCGGP
和靶向 gp41 的阳性对照药物 NB-64 的对接分数
（Score）分别为 6.70、4.24、3.11。 对接的分值与化合物
南方医科大学学报(J South Med Univ) 第 30 卷722· ·
图 3 咖啡酰基葡萄糖类化合物与 gp41 上 N-螺旋三聚
体沟槽的分子对接模拟图
Fig.3 Molecular docking showing the interaction of
caffeoyl glucopyranoses with the cavity of gp41
N-trimer coiled-coil structure
A: TCGP; B: DCGGP
A B
抑制 gp41六螺旋束结构的活性呈正相关。 分子对接
的结果见图 4。 结果表明，这两个化合物中的酚羟基
可能与 NHR 功能基团上的 K574 残基所带的正电荷
相互作用，阻止了 N- 螺旋三聚体中的 K574 与 C- 螺
旋中带负电荷的 D632 之间形成盐桥，从而抑制了六
螺旋束的形成（图 3）。
3 讨论
目前从中草药中分离得到的作用于 gp41 的 HIV
抑制成分主要为多酚类鞣质， 但该类化合物种类较
多，较难纯化，而单体化合物又容易被氧化，且口服生
物利用度低， 被开发成为口服的抗 HIV 药物受到限
制， 但作为阴道外用杀微生物剂来预防 HIV 的性传
播，具有良好的临床应用前景。
来 源 于 蛇 菰 科 植 物 日 本 蛇 菰 （Balanophora
japonica Makino）的六个咖啡酰基葡萄糖类单体化合
物都以葡萄糖为结构核心，具有多个酚羟基。 我们前
期的研究证实，来源于该系列的另一个没食子酰基葡
萄糖类单体化合物 TGGP 可以靶向 HIV gp41 抑制
六螺旋束结构的形成， 并且能够抑制 HIV 与靶细胞
的融合［2］。 为了判断日本蛇菇中分离的其他相关化合
物是否具有抗 HIV的活性， 我们采用假病毒体系进
行了筛选， 发现仅 TCGP和 DCGGP具有抑制活性，
且特异性地作用于 HIV 的包膜蛋白。 从结构式看，
TCGP 和 DCGGP 的化学结构极为相似，吡喃葡萄糖
的羟基被咖啡酰基团所修饰，分子较大，与 gp41 靶穴
的结合面积增大，亲合力增强，我们将这两个化合物
与 gp41的分子对接证明了这一点， 这两个化合物的
对接分值均比阳性化合物 NB-64 高。 这两个化合物
都是由两种基本结构单元，即吡喃葡萄糖和咖啡酰基
团（caffeoyl）构成。 我们此前的研究表明单独的吡喃
葡萄糖、 咖啡酸和没食子酸均不能抑制 gp41 六螺旋
束结构的形成和 HIV包膜蛋白诱导的细胞融合作用
［8-9］，其原因可能与其分子量太小，不能与 gp41 靶穴
发生紧密的结合有关。 当这些基团组成 TCGP 和
DCGGP 时，分子的大小与靶穴的大小相当，而且通
过咖啡酸基团的苯环与靶穴中保守的疏水残基结合，
而分子中多个酚羟基所带的弱酸性，可能与靶穴中保
守的正电荷残基 K574 或者 R579 发生相互作用，从
而抑制 gp41六螺旋束结构的形成。值得指出的是，日
本蛇菇来源的具有抑制 HIV 进入靶细胞的葡萄糖类
TCGP 和 DCGGP，与我们以前发现的具有抑制 gp41
六螺旋束结构的形成茶黄素衍生物，具有类似的结构
特征。 相比之下，这两个化合物的颜色较茶黄素衍生
物浅，而水溶性则更好，因而在作为阴道外用杀微生
物剂使用来预防 HIV的性传播， 可能具有更大的优
势。 总之，本研究发现从蛇菰科植物日本蛇菰提取纯
化的两个咖啡酰葡萄糖类单体化合物 ，TCGP 和
DCGGP，能够抑制 HIV-1 Env假病毒，并且靶向 gp41
的靶穴区，抑制 gp41六螺旋束核心结构的形成。这两
个化合物因其丰富的来源、优越的化学性质、较高的
抗 HIV活性， 作为预防 HIV性传播的阴道外用杀微
生物剂，具有良好的应用前景。
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