全 文 ：　第 21 卷第 5 期
2002年 9月 　 　 　　　　 　
无 锡 轻 工 大 学 学 报
Journal of Wuxi University of Light Industry
　 　 　　　　Vol.21　No.5
Sep.　2002
　文章编号:1009-038X(2002)05-0519-06
　　收稿日期:2001-12-25;　修订日期:2002-03-20.
作者简介:宋俊梅(1964-), 女 ,山东临邑人 , 工学博士 ,副教授.
萝摩科植物 C21甾甙含量的测定方法
宋俊梅1 , 2 , 　刘红蕾3 , 　丁霄霖1
(1.江南大学 食品学院 ,江苏 无锡 214036;2.山东轻工业学院 食品与生物工程学院 , 山东 济南
250000;3.山东大学 生命科学学院 ,山东 济南 250100)
摘　要:在确定了 C21甾甙提取方法定量测定官能团反应方法的基础上 ,建立了 C21甾甙含量的测
定方法 ,主要包括标准物的选择 、方法的建立及对方法的检验和评价.结果表明 ,该方法符合分析
要求 ,可用于萝摩科植物 C21甾甙含量的定量测定.
关键词:萝摩科;C21甾甙;定量测定方法
中图分类号:Q 946.83 文献标识码:A
A Method for Quantitative Determination of C21
Steroidal Glycosides from Asclepiadeceae Plants
SONG Jun-mei1 , 2 , 　LIU Hong-lei3 , 　DING Xiao-lin1
(1.School of Food Science and Technology , Southern Yangtze University , Wuxi 214036 , China;2.Shool of Food and
Bioengineering , Shandong Institute of Light Inductry , Jinan 250000 , China;3.College of Life Science , Shandong Uni-
versity , Jinan 250100 , China)
Abstract:In order to determine the content of C21 steroidal gly cosides in Asclepiadaceae plants and ho-
mologous health food , a method fo r quant itative determinat ion w as established based on their ext rac-
tion technique and the functional g roup reactions.The choice of standard , the establishment of the
method , and the evaluation of the method were studied.The results showed that this method acco rded
wi th the demands of analysis , and could be used to determine the content of C21 steroidal glycosides
quanti tatively .
Key words:Asclepiadaceae;C21 steroidal gly cosides;quantitat ive determination method
　　C21甾甙是萝摩科植物中普遍存在的化学成分.
在体外实验中 , C21甾甙具有清除超氧阴离子自由
基[ 1]和羟自由基[ 2] 的能力;在动物实验中 ,它能够
调节免疫功能[ 3] 、抵抗内源性自由基对机体的氧化
损伤[ 4] .因此 ,C21甾甙受到广泛的重视.但由于 C21
甾甙相互之间在结构上有较大的差异性 ,缺乏统一
的定量方法.鉴于 C21甾甙具有明显的药理活性 ,急
需建立一种常规的 C21甾甙含量测定方法.这一方
法的建立 ,有助于广泛地测定萝摩科植物中 C21甾
甙的含量 ,通过比较和筛选 ,寻找含有 C21甾甙的新
药源;同时还可用于以 C21甾甙为主要成分的药品
和保健食品中 C21甾甙的定量测定 ,从而对其进行
质量监控.有关这方面的研究目前尚未见报道.作
者在研究了C21甾甙的提取方法和磺基醋酸汞试剂
法定量测定 C21甾甙的基础上 ,建立了 C21甾甙含量
的测定方法.
1　分光光度法特点与标准物的选择
1.1　分光光度法特点
C21甾甙从结构上属于 3-羟基甾族化合物 ,而定
量测定此类化合物的最成熟可靠的方法就是磺基
醋酸汞试剂法.磺基醋酸汞试剂与 C21甾甙元的
C3 —OH 反应呈色 ,可用分光光度法定量测定 C3 —
OH来直接测定 C21甾甙元 ,从而间接测定C21甾甙.
分光光度法是建立在各种官能团的特征化学
反应基础上的 ,因此 ,所给的反应可用于具有相同
基团的不同分子 ,但显出的颜色和反应的产率会随
测试的化合物而异 ,因为这些因素主要取决于整个
分子结构.所以 ,通常官能团分光光度法分析如同
容量分析法一样 ,不能作绝对测定[ 5] .由未知物所
得的结果 ,必须在相同条件下 ,与已知量的纯化合
物所制得的标准曲线相比较才能得到准确结果.因
此 ,首先要进行标准物的选择.
1.2　标准物的选择
由于 C21甾甙是一类化合物 ,各种甾甙间既有
糖基的区别 ,又有甙元的差异 ,进行统一的定量非
常困难 ,只有通过其共同具有的 C21甾甙元的 C3 —
OH的定量来间接定量 C21甾甙.各种 C21甾甙元之
间的差异比各种 C21甾甙间的差异小得多 ,甙元的
C21甾体母核相同 ,均有 C3 —OH 和 C12位酯基 ,各甙
元之间的区别主要是母核上 2 ～ 3 个取代羟基的数
目或位置不同 ,以及 C12位的酯基不同.由于 C21甾
甙具有共同的 C21甾体母核和 C3 —OH ,用定量 3-羟
基甾族化合物的磺基醋酸汞试剂法对其进行统一
的近似定量是可能的.
对单一化合物的定量 ,其标准物的选择也就是
选择纯品的待测物本身;而作为一类化合物的定
量 ,标准物的选择却是最困难但又是最关键的因
素.对于 C21甾甙定量测定的标准物的选择 ,应基于
它既能代表所有各种 C21甾甙元最典型的基本结
构 ,又有标准品可得的原则.在对大量类似化合物
进行筛选后 ,决定使用 Sigma 公司产品孕甾烯醇酮
(pregnenolone).孕甾烯醇酮具有与 C21甾甙元共同
的 C21甾体母核和 C3 —OH ,从结构上分析适合作为
C21甾甙元的标准物 ,而且也曾从天然植物中分离到
以孕甾烯醇酮为甙元 、C3 —OH 与糖基结合的 C21甾
甙.也就是说 , 孕甾烯醇酮本身也是一种 C21甾甙
元[ 6] .孕甾烯醇酮和白首乌 C21甾甙元的结构比较
可见图 1.
尽管理论上孕甾烯醇酮作为 C21甾甙元的标准
物是很好的选择 ,然而实际情况仍需实验验证.关
于用孕甾烯醇酮作为 C21甾甙元标准物的可靠性 ,
从孕甾烯醇酮和白首乌 C21甾甙元两者与磺基醋酸
汞试剂反应的吸收曲线的近似性和反应曲线的近
似性得到进一步验证.
图 1　几种 C21甾甙元和孕甾烯醇酮的结构示意图
Fig.1　Sketch map of the structure of some kinds of C21 steroidal glycosides and pregnenolone
2　孕甾烯醇酮与磺基醋酸汞试剂
反应的吸收曲线和反应曲线
2.1　孕甾烯醇酮与磺基醋酸汞试剂反应的吸收
曲线
取 0.06 mg/mL 的孕甾烯醇酮冰乙酸溶液
1 mL ,加磺基醋酸汞试剂 5 mL ,混匀 ,25 ℃静置 40
min ,反应液呈红棕色 ,与 C21甾甙元和磺基醋酸汞
试剂的颜色相同.以 1 mL冰乙酸代替标准液 ,同样
处理作为对照 ,于紫外可见分光光度计(753BI 微机
型 ,上海光学仪器厂制造)上进行可见光区的吸光
度测定 ,结果如图 2 、图 3所示.
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图 2　孕甾烯醇酮的吸收曲线
Fig.2　Absorbing curve of pregnenolone
图 3　C21甾甙的吸收曲线
Fig.3　Absorbing curve of C21 steroidal glycosides
　　将图 2中的孕甾烯醇酮的吸收曲线与图3中的
C21甾甙的吸收曲线[ 6]比较可见 ,两条吸收曲线的峰
形非常接近 ,最大吸收波长均为 510 nm ,说明孕甾
烯醇酮和 C21甾甙元两者与磺基醋酸汞试剂反应的
产物呈色性质类似 ,即孕甾烯醇酮在与磺基醋酸汞
试剂的反应方面可以代表 C21甾甙元的性质.因此
可以说 ,用孕甾烯醇酮作为 C21甾甙元的标准物是
可行的.
2.2　孕甾烯醇酮与磺基醋酸汞试剂反应的曲线
取 0.06 mg/mL 的孕甾烯醇酮冰乙酸溶液 1
mL ,加磺基醋酸汞试剂 5 mL ,混匀 , 25 ℃静置 ,于
510 nm 处每隔 10 min测定 1次吸光值 ,得孕甾烯
醇酮的反应曲线(见图 4).由图 4与图 5比较可见 ,
孕甾烯醇酮的反应曲线与 C21甾甙元的反应曲线也
极相似 ,均在反应 30 min时达到峰值 ,能稳定 1 h
以上.这说明 ,孕甾烯醇酮和 C21甾甙元两者与磺基
醋酸汞试剂反应的速度以及呈色产物的稳定性也
是一致的.结果进一步表明 ,用孕甾烯醇酮作为 C21
甾甙元的标准物是可行的 , 孕甾烯醇酮能够代表
C21甾甙元的基本结构和性质.
图 4　孕甾烯醇酮的反应曲线
Fig.4　Reaction curve of pregnenolone
图 5　C21甾甙的反应曲线
Fig.5　React ion curve of C21 steroidal glycosides
3　C21甾甙测定方法的确定
3.1　测定条件的确定
综合孕甾烯醇酮及白首乌 C21甾甙与磺基醋酸
汞试剂反应的吸收曲线和反应曲线 ,发现最大吸收
波长均为 510 nm ,反应开始后 30 min吸光度值达
到峰值 ,30 ～ 90 min内呈色稳定.因此 ,磺基醋酸汞
试剂法测定C21甾甙含量的反应条件和测定条件设
定为:含样品的冰乙酸溶液 1 mL ,加磺基醋酸汞试
剂 5 mL ,混匀 ,室温静置 40 min ,于 510 nm 处测定
吸光度值.
3.2　标准曲线的制备
精确吸取 0.15 mg/mL的孕甾烯醇酮冰乙酸溶
液1 ,2 ,3 ,4 ,5 ,6 ,7 ,8 ,9 mL ,用冰乙酸溶液分别定容
于 10 mL 的容量瓶中 ,混匀;然后分别精确吸取上
述各溶液 1 mL 于具塞试管中 ,各准确注入磺基醋
酸汞试剂 5 mL ,混匀 ,室温静置 40 min ,在 510 nm
下测定其吸光度值.以吸光度值对标样的质量浓度
作图 ,经线性回归即得标准曲线 ,如图 6所示.回归
方程为 Y =0.008 491+5.953X(方程中 X 的单位
为 mg/mL),线性相关系数为 0.999 7.
521第 5期 宋俊梅等:萝摩科植物 C21甾甙含量的测定方法
图 6　孕甾烯醇酮与磺基醋酸汞试剂反应的标准曲线
Fig.6 　Standard curve of the reaction of pregnenolone
and reagent
3.3　萝摩科植物中 C21甾甙测定方法的最后确立
综合 C21甾甙的提取方法和作者的测定方法 ,
萝摩科植物中的 C21甾甙含量测定方法确立为:2 g
粉碎度为 40目的样品 ,用 95%的乙醇 50 mL 进行
索氏抽提 4 h;用冰乙酸冲洗抽提瓶 ,并定容至 100
mL ,混匀 ,再准确吸取 5 mL ,用冰乙酸定容至 100
mL.精确吸取 1 mL 样品液于具塞试管中 ,准确加
入磺基醋酸汞试剂 5 mL ,混匀 ,室温静置 40 min ,
于510 nm 波长处测定其吸光度值.以此吸光度值
作为孕甾烯醇酮标准曲线回归方程中的 Y ,求出方
程中 X ,然后按下式计算原料中的 C21甾甙含量.也
可以从标准曲线上直接求出原料中 C21甾甙的含
量.然而需要指出的是 ,由于通过C3 —OH 的定量实
际上是分子定量 ,而孕甾烯醇酮的相对分子质量比
一般的 C21甾甙元的相对分子质量小 ,比 C21甾甙的
相对分子质量小得多 ,用此方法所得结果比实际含
量偏低.因此 ,测定结果上必须注明“按孕甾烯醇酮
计”的字样.
4　方法评价
一个好的分析方法应具有良好的检测能力 、可
靠的测定结果及广泛的适用性[ 9] .检测能力通常用
检出限来表征.测定结果的可靠性 ,取决于测定过
程中的随机误差和系统误差.随机误差决定了结果
的精密度 ,而系统误差决定了测定结果的准确度.
分析方法的适用性是指它所适用的被测组分的含
量(质量浓度)范围 ,也指对不同组分试样的适用
性.对被测组分的含量(质量浓度)范围的适用性 ,
通常用工作曲线的线性范围来衡量;对不同组分试
样的适用性 , 通常用分析方法的抗干扰能力来说
明 ,或者直接用不同组成试样检验.因此 ,为了全面
地评价一个分析方法 ,应该给出评价分析方法的基
本参数:检出限 、精密度 、准确度 、工作曲线的线性
范围 、抗干扰能力或者对不同组分试样的分析结
果.
4.1　检出限的测定
检出限是指能产生一个确证在试样中存在被
测组分的分析信号所需要的该组分的最小含量或
最小质量浓度.以孕甾烯醇酮为标样 ,按测得吸光
度OD值为 0.01为准进行测定试验 ,本方法的最低
检出质量浓度为 0.23 mg/dL.但有研究者指出[ 10] ,
具有足够精密度的被测化合物的最小量取决于所
用仪器的精密度 ,因而认为 OD值为 0.3即相当于
透射比为 50%时的样品质量浓度更为科学 ,因为在
任何分光光度计上 ,在这个 OD值附近作精确的读
数是有可能的.本方法用孕甾烯醇酮的标准曲线计
算得 OD值为 0.3时 ,孕甾烯醇酮的质量浓度为4.9
mg/dL 时就可进行准确定量.从以上结果得知 ,无
论按检测限 ,还是 OD值为 0.3的样品质量浓度 ,两
者的数值都较低.因此可以说 ,本方法的检出灵敏
度是可靠的.
4.2　精密度 、准确度和基体干扰情况的测定
为获得本方法测定 C21甾甙含量的准确度和精
密度等用于评价方法可靠性的指标 ,作者选用和测
定了 4种萝摩科植物原料 ,进行了重复性测定和加
标回收试验.这 4 种植物原料分别为:(1)白首乌
(Cynanchum auriculatum Royle ex Wight ,去皮块
根);(2)徐长卿(C .paniculatum Kitag ,根);(3)大
理白前(C .forestii Schltr ,根);(4)白薇(C .atra-
tum Bunge ,根).其中(1)由江苏滨海首乌制品厂提
供;(2)、(3)、(4)购于江苏省无锡市荣康药店.
4.2.1　不同样品重复测定试验———精密度和适用
性的测定1 选取不同含量 C21甾甙的上述 4种原料 ,
按前述操作方法各重复 5 次 ,进行提取 、反应和测
定 ,计算测定结果的平均值 、标准偏差和相对标准
偏差 ,结果如表 1所示.5次重复测定的相对标准偏
差均小于 5%,说明方法的精密度较高 ,具有广泛的
适用性.
4.2.2　加标回收试验 ———准确度的测定1 准确吸
取一定体积已知 C21甾甙质量浓度的样品液 ,准确
添加等体积的已知质量浓度的孕甾烯醇酮标准液 ,
混匀 ,用本实验方法测定混合液的 C21甾甙终质量
浓度.以混合液中 C21甾甙终质量浓度减去混合液
中样品液所提供的 C21甾甙的终质量浓度 ,除以混
合液中标样终质量浓度 ,计算出标样回收率.选择
以上 4种样品 ,每种重复测定 5次.由表 2 结果可
见 , 4 种样品加标测定的平均回收率在(99.2 ±
522　　　　　　　　　　　　　　　无　锡　轻　工　大　学　学　报　　　　　　　　　　　第 21卷
2.7)%～ (99.4±1.8)%之间 , 总平均回收率为
(99.3±2.1)%,说明方法的准确度较高.
表 1　用本法重复测定样品的重现性
Tab.1 　Recurrence performance of the results determining
samples with this method
测定序号 C21甾甙质量浓度/(g/ dL)白首乌 徐长卿 白前 白薇
1 1.10 2.09 1.43 4.39
2 1.05 2.12 1.51 4.32
3 1.04 2.13 1.39 4.47
4 1.11 2.20 1.45 4.26
5 1.05 2.16 1.47 4.51
平均值 1.07 2.14 1.45 4.39
标准偏差 3.2 4.2 4.5 10.3
相对标准
偏差 3.0 2.0 3.1 2.3
4.2.3　标准曲线法与标准加入法对比试验 ———基
体干扰情况的测定1 有些杂质干扰 ,虽可在扣除本
底时予以扣除 ,但在测定反应过程中可能有一部分
与 C21甾甙反应产生基体效应.因此 ,为进一步验证
方法的可靠性 ,作者还进行了标准曲线法和标准加
入法对比试验[ 11] .具体作法是:2 g 白首乌用体积分
数为 95%的乙醇 50 mL 进行索氏抽提 4 h ,用冰乙
酸冲洗抽提瓶 ,定容至 100 mL;再取 25 mL 定容至
50 mL ,称此溶液为样液 A.质量浓度为 0.15 mg/
mL 的孕甾烯醇酮冰乙酸溶液 ,称为标液 B.A 液和
B液按表 3混合配制 ,用冰乙酸定容后 ,精确吸取 1
mL ,加 5 mL 磺基醋酸汞试剂 ,混匀 ,室温静置 40
min ,于 510 nm 波长处 , 测定其各自的吸光度 ,为
OD510nm(总值).不加标液的测定值为 OD510nm(样液
值).以 OD510nm(总值)减去 OD510nm(样液值),作为
OD510nm(标准加入值).具体配制方法和测定结果见
表3.表 2　加标回收试验结果
Tab.2　Results of recovery experiments by adding
样品名称
混合液中样品液所
提供的 C21甾甙的
终质量浓度/(mg/mL)
混合液中加标量
终质量浓度/(mg/ mL)
混合液中测得的 C21
甾甙终质量浓度/(mg/ mL) 回收率/ %
平均
回收率/ %
白首乌 0.0213
0.0200 0.0419 101.5
0.0200 0.0420 101.7
0.0200 0.0399 96.6
0.0200 0.0415 100.0
0.0200 0.0397 96.1
99.2±2.7
徐长卿 0.0428
0.0400 0.0842 101.7
0.0400 0.0809 97.7
0.0400 0.0815 98.4
0.0400 0.0814 98.3
0.0400 0.0835 101.2
99.4±1.8
白前 0.0296
0.0300 0.0582 97.7
0.0300 0.0581 97.4
0.0300 0.0591 99.2
0.0300 0.0599 100.5
0.0300 0.0607 101.8
99.3±1.9
白薇 0.0872
0.0800 0.1638 98.0
0.0800 0.1604 95.9
0.0800 0.1711 102.3
0.0800 0.1653 98.9
0.0800 0.1695 101.4
99.3±2.6
总平均回收率 99.3±2.1
523第 5期 宋俊梅等:萝摩科植物 C21甾甙含量的测定方法
表 3　标准加入法溶液配制方法和测定结果
Tab.3 　Solution preparation and test results of standard
adding
管号 混合液配制方法 OD510nm(总值)
OD510nm(标液加入值)
A液 B液　混合液　
1 1 mL+0 mL※10 m L 0.077 0
2 1 mL+1 mL※10 m L 0.178 0.101
3 1 mL+2 mL※10 m L 0.258 0.181
4 1 mL+3 mL※10 m L 0.360 0.283
5 1 mL+4 mL※10 m L 0.436 0.359
6 1 mL+5 mL※10 m L 0.528 0.451
7 1 mL+6 mL※10 m L 0.613 0.536
8 1 mL+7 mL※10 m L 0.716 0.639
　　标准曲线法和标准加入法的对比试验结果如
表 4和图 4所示.
表 4　标准曲线法和标准加入法对比试验结果
Tab.4　Comparison between the test results of standard curve
and standard adding
C21甾甙标液质量
浓度/(mg/m L)
C21甾甙质量浓度/(mg/mL)
标准曲线法 标准加入法
0 0 0
0.015 0.102 0.101
0.030 0.199 0.181
0.045 0.275 0.283
0.060 0.367 0.359
0.075 0.451 0.451
0.090 0.539 0.536
0.105 0.632 0.639
直线回归方程 Y =0.00849+
5.95 X Y =0.00480+5.98 X
相关系数 0.999 7 0.999 2
　　由表 4可见 ,标准加入法曲线的斜率和截距与
标准曲线均很接近 ,线性关系也较好 ,相关系数为
0.999 2.从图 7可看出 ,两条曲线非常接近 ,而两条
回归曲线则几乎重叠.用以上两条标准曲线分别计
算样液 A 中的 C21甾甙质量浓度 , 结果分别为
0.011 51 mg/mL和 0.012 07 mg/mL ,两数据相对
标准偏差为 4.75%,小于 5%.因此可认为 ,本法已
经扣除本底 ,不存在基体干扰 ,可以直接使用标准
曲线法 ,测定结果可靠.
图 7　标准曲线与标准加入法曲线的比较
Fig.7 　Comparison between the standard curves and
standard adding
5　结　语
从 C21甾甙元的结构特点出发 ,选择了用孕甾
烯醇酮作为标准品 ,用磺基醋酸汞试剂法作为定量
反应的分光光度法 ,通过孕甾烯醇酮与磺基醋酸汞
试剂反应的吸收曲线及反应曲线和白首乌 C21甾甙
元的同类曲线比较 ,验证了孕甾烯醇酮作为 C21甾
甙元标准品的可行性 ,然后制备了标准曲线.选择 4
种萝摩科植物原料进行样品的重复测定试验 、加标
回收试验 ,以及标准曲线法与标准加入法的对比试
验 ,从而对该方法的准确度和精密度等进行了分
析.结果表明 ,重复测定 4 种植物原料的相对标准
偏差小于 5%,加标测定的总平均回收率为(99.3±
2.1)%,并且不存在基体干扰 ,可以直接使用标准
曲线法.
参考文献:
[ 1] 宋俊梅 , 丁霄霖.白首乌对超氧阴离子自由基清除作用的研究[ J] .食品科学 , 1997 , 18(9):61-64.
[ 2] 宋俊梅 , 丁霄霖.白首乌中 C21甾甙及甾甙元清除羟自由基的功能[ J] .无锡轻工大学学报 , 1998 , 17(2):43-46.
[ 3] 宋俊梅 , 王增兰 ,丁霄霖.白首乌总甙对小鼠免疫功能的影响[ J] .无锡轻工大学学报 , 2001 , 20(6):588-593 .
[ 4] 宋俊梅 , 王元秀 ,丁霄霖.白首乌 C21甾甙抗氧化作用的研究[ J] .食品科学 , 2001 , 22(12):22-25.
[ 5] M·佩塞兹.有机化合物及药物的比色法和荧光测定法[ M] .夏锦尧编译.北京:中国人民公安大学出版社 , 1989.7.
[ 6] 林启寿.中草药成分化学[ M] .北京:科学出版社 , 1977.
[ 7] 邓勃.分析测试数据的统计处理方法[ M] .北京:清华大学出版社 , 1995.
[ 8] M·佩塞兹.有机化合物及药物的比色法和荧光测定法[ M] .夏锦尧编译.北京:中国人民公安大学出版社 , 1989.446.
[ 9] 元晓梅 , 刘贵贤 ,胡正芝.比色法测定柑桔饮料及桔皮制剂中总黄酮含量[ J] .食品与发酵工业 , 1996 , (3):13-21.
(责任编辑:朱 明)
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