全 文 :第 10 卷第 2期
2010年 6月
温 州 职 业 技 术 学 院 学 报
Journa l of Wenzhou Vocational & Technica l College
Vol.10 No.2
Jun.2010
2009-12-26
国家自然科学基金(20675073)
李双妹(1971—),女,河南濮阳人,濮阳职业技术学院石油化工与环境工程系讲师,硕士研究生.
[收稿日期]
[基金项目]
[作者简介]
李双妹
(濮阳职业技术学院 石油化工与环境工程系,河南 濮阳 457001)
[摘 要] 为了开发青荚叶资源,采用苯酚-硫酸法测定多糖的含量,测得多糖的含量为274.3μg/g。苯酚-
硫酸法测定多糖的方法简便、灵敏、准确。青荚叶中含有较丰富的多糖,具有广阔的开发应用前景。
[关键词] 多糖;苯酚-硫酸法;青荚叶
[中图分类号] R284.2 [文献标识码] A [文章编号] 1671-4326(2010)02-0049-04
青荚叶多糖的提取及含量测定
Extraction and Determination of Helwingia Japonica
Polysaccharides
LI Shuangmei
(Petrochemical Engineering and the Environment Engineering Environment, Puyang Vocational
and Technical College, Puyang, 457001, China)
Abstract: To develop Helwingia japonica resources, the phenol - sulfuric acid method is applied to determine the
content of polysaccharide and the result is 274.3μg/g. This method is simple, rapid and accurate. Helwingia japonica
contains a wealth of polysaccharide, and will have a prosperous future.
Key words: Polysaccharide; Phenol- sulfuric acid method; Helwingia japonica
0 引 言
青荚叶(Helwingia japonica)为茱萸科青荚叶
属,又称叶上珠、叶上花,甘南州群众俗称叶里开花,
又名大部参、阴证药、叶长花,因花着生于叶上面的
中脉(近于基部)而得名。苗族药名枪墙叶,多生于林
下阴处,分布于贵州中西部各苗乡。根茎叶入药,具
有舒筋活络、调经、清热除湿、解毒消肿、凉血止血、
清肺止咳等功效,并具有清热利尿、下乳等功能。苗
族民间常以叶上花、无花果、月季花搭配治疗月经不
调,以叶上花、矮陀陀、土三七搭配治疗劳伤,单用
叶上花来治疗年久咳喘[1]。由于青荚叶中含有肉桂酸
和西米杜鹃醇等有机成分,因而可用于提取肉桂酸,
用来合成治疗冠心病的重要药物,还可用做合成保鲜
剂等[1]。因此,在食品、医药、化工等行业有着广泛
的用途,是一种极其丰富而宝贵的自然资源。
多糖作为药用始于20世纪40年代,近年来多糖
类物质是国内外研究的热点之一。我国学者王开发等
对5种植物的多糖进行提取和研究认为,多糖不但能
治疗机体的免疫缺陷疾病,还能治疗诸如风湿之类的
自身免疫性疾病,并且具有抗氧化及抗衰老作用[2]。但
对青荚叶多糖的研究还鲜有报道,因而对青荚叶多糖
的研究具有重要的科学价值。青荚叶中含有丰富的多
糖,运用改进的苯酚-硫酸法测定青荚叶多糖的含量,
可以为进一步合理开发青荚叶资源提供理论依据。
1 材料
1.1样品来源及前期处理
青荚叶于2009年6月采自三门峡市卢氏县。用万
能植物粉碎机将自然晾干的青荚叶粉碎成粉末状,过
40目筛。青荚叶中脂肪含量未知,脂肪的存在会影响
其多糖的分析,应先将青荚叶中的脂肪提取出来,以
取得较好的效果。
用索式提取器提取脂肪:恒重滤纸(脱脂后的滤
DOI:10.13669/j.cnki.33-1276/z.2010.02.005
50 温 州 职 业 技 术 学 院 学 报 2010年 6月
纸)筒,然后称其质量m1。恒重是指物品经连续两次
加热干燥,冷却后称得其质量相差不超过规定量,一
般规定为0.2~0.3mg。称取青荚叶样品,全部移至已
恒重过的滤纸筒内,称得其总质量m2。将滤纸筒放入脂
肪提取器的抽提筒内,连接已干燥的接收瓶,由抽提器
冷凝管上端加入无水乙醚至容积的2/3处,于75℃水浴
上加热,使乙醚不断回流提取(12次/h),抽提5h。
提取结束时检查脂肪是否提取完全的方法为,用玻璃
棒蘸取抽提管中的乙醚一滴滴在滤纸上,乙醚挥发后
无油迹即可。冷却至室温后,自上而下拆除抽提器,把
单口烧瓶和滤纸筒放实验室自然风干。称取风干后的
滤纸筒与青荚叶样品的总质量m3。将风干后的青荚叶
样品移入干净的滤纸(脱脂后)中,放入干燥器中储
存备用。青荚叶的脂肪含量按以下公式计算:
脂肪
青荚叶的脂肪含量见表1。
表1 青荚叶的脂肪含量
滤纸筒质量m1/g
1.1052
1.0942
脱脂前总质量m2/g
3.6043
3.9750
脱脂后总质量m3/g
3.3364
3.6421
脂肪含量/%
10.72
11.56
平均含量/%
11.14
RSD/%
3.80
1.2仪器及试剂
(1)仪器。万能植物粉碎机,722型分光光度计,
索式提取器,量筒(100ml),电子分析天平,圆底烧
瓶,冷凝管,铁架台,电子恒温水浴锅,SHB-Ⅲ循环
水式多用真空泵抽滤装置,滤纸,RE-2000旋转蒸发
器(上海荣生),循环式多用真空泵,XK96-B快速混
匀器,离心机,吸量管,分液漏斗,烧杯,吸管,玻璃
棒,具塞比色管(25ml,50ml),微量取液器(100μl),
吸耳球,漏斗,UV-1601型分光光度计,容量瓶,称
量瓶,烘箱,Zeeman偏振效应背景校正器,Tech -315A
型电热板,锥形瓶,漏斗。
(2)试剂。浓硝酸,葡萄糖,苯酚,浓硫酸,无
水乙醚,石油醚,氯仿,正丁醇,95%乙醇,无水乙
醇,La2O3,盐酸,以上均为分析纯;高氯酸(G·R),
去离子水,高纯水;试验中所用玻璃器材均用HNO3
(20%)浸泡24h以上,再用去离子水冲洗干净,烘干
后防尘储藏备用。
2 方法与结果
2.1苯酚试液的配制
用电子分析天平精确称取苯酚10g于棕色瓶中,
加150ml去离子水溶解,振荡摇匀,贴上标签备用(临
用前配制)[3]。
2.2葡萄糖标准溶液的配制
精确称取经105℃干燥至恒重的分析纯葡萄糖
100mg,置于100ml容量瓶中加去离子水溶解并稀释至
刻度,摇匀,配成浓度为1×103mg/l的标准葡萄糖
溶液备用。精确量取葡萄糖标准溶液(1×103mg/l)0μl,
100μl于25ml具塞比色管中,加蒸馏水至2.0ml,再
分别加苯酚溶液1.0ml,摇匀,迅速加入浓H2SO4溶液
5.0ml,摇匀后室温放置5min,置沸水浴中加热15min,
取出冷却至室温;在UV-1601型分光光度计上,以相应
的试剂为空白,于400~600nm处每隔5~10nm测定一
次吸光度,得λmax=490nm。其测定结果见表2、图1。
2.3标准曲线绘制[4]
精确量取葡萄糖标准溶液(1×103mg/l)0μl,10μl,
20μl,40μl,60μl,80μl,100μl于25m1具塞比
色管中,加蒸馏水至2.0ml,再分别加苯酚溶液1.0ml,
摇匀,迅速加入浓H2SO4溶液5.0ml,摇匀后室温放置
5min,置沸水浴中加热15min,取出冷却至室温;在
UV-1601型分光光度计上,以相应的试剂为空白,于
490nm处测定吸光度。其测定结果见表3、图2。将
实验数据作回归处理得回归方程:A=0.050416C-
0.00862,r=0.9997。
2.4多糖的提取及精制
表2 葡萄糖标准溶液不同波长下的吸光度值
λ/nm
410
420
430
440
450
460
465
470
475
吸光度
0.1874
0.2054
0.2239
0.2405
0.2723
0.3448
0.3997
0.4685
0.5492
λ/nm
80.0
85.0
490.0
490.5
495.0
500.0
505.0
10.0
515.0
吸光度
.6326
.7039
.7396
0.7395
.7064
.6035
.4709
.3452
.2556
λ/nm
520
530
540
550
560
570
580
590
600
吸光度
0.1967
0.1299
0.0801
0.0516
0.0397
0.0347
0.0315
0.0284
0.0253
图1 葡萄糖标准溶液不同波长下的吸收光谱曲线
第10 卷第 2期 51
表3 葡萄糖标准溶液下不同容积的吸光度值
编号
1
2
3
4
5
6
标准溶液含量/(mg·l-1)
1.25
2.50
5.00
7.50
10.0
12.5
吸光度
0.0574
0.1178
0.2407
0.3617
0.5044
0.6199
图2 葡萄糖标准曲线
表4 样品溶液不同波长下的吸光度值
λ/nm
410
420
430
440
450
460
465
470
475
吸光度
0.09010
0.09610
0.09610
0.09255
0.09610
0.11580
0.12500
0.15590
0.18240
λ/nm
480.0
485.0
489.5
490.0
495.0
5 0.0
5 5.0
510.0
515.0
吸光度
.20720
.22470
0.22920
.22820
.21320
.18320
.14820
.11740
.09419
λ/nm
520
530
540
550
560
570
580
590
600
吸光度
0.078350
0.055700
0.034980
0.021020
0.015020
0.013100
0.012020
0.011740
0.009555
图3 吸收光谱标准曲线
用电子分析天平精确称取三份脱脂后的青荚叶分
别为3.9750g、1.0004g、1.0004g,置于圆底烧瓶中,
分别加入120ml去离子水,于90℃水浴中加热(至水
浴温度升高开始计时)1h。把脱脂后的滤纸剪好置于
抽滤瓶的漏斗中,将提取液趁热进行抽滤。用旋转蒸
发仪(50℃,90rpm)旋转蒸发,将抽滤液中去离子水
除去,使滤液减压缩至6ml左右。将减压浓缩后的溶
液移入离心管中,加入20ml氯仿-正丁醇混合溶剂
(4:1),用XK-96B快速混匀器剧烈振荡20min,放入离
心机中离心(3000r/min)10min,离心后于分液漏斗
中萃取,弃去中间层的变性蛋白质及下层的有机液,
保留上清液于干净的小烧杯中(连续离心萃取3次)[5]。
用电子分析天平精确称取1.0000g活性炭倒入烧杯中,
用试管夹固定烧杯于沸水浴中加热,并用玻璃棒不断
搅拌。然后过滤,将活性炭除去。连续脱色两次,得
青荚叶多糖。
2.5换算因素的测定
精确称取青荚叶多糖50mg,置于100ml容量瓶中,
加蒸馏水溶解并稀释至刻度,摇匀制得青荚叶多糖储
备液,吸取储备液200μl,按照标准曲线制备的方
法测定吸光度,在UV-1601型分光光度计上,以相应
的试剂为空白,于489.5nm处测定吸光度,与标准溶
液的最大吸收波长相近,推测为多糖。其测定结果见
表4、图3。
从吸收光谱标准曲线中求出供试液中多糖的含
量,按以下公式计算:
F=m/ρvd
其中,m为多糖的质量(mg),ρ为供试液中多糖
的浓度(mg/l),v为供试液的体积(ml),d为多糖的
稀释因素[6];吸光度为0.2292,相应的葡萄糖浓度为
4.72mg/l,换算因素F=10.59。
2.6样品的测定
从烧杯中吸取50μl的样品液,加去离子水定容
于50ml具塞比色管中,用微量取液器吸取2ml稀释液,
加苯酚试液1.0ml,摇匀,迅速滴加浓硫酸5.0ml,摇
匀后放置5min,置沸水浴中加热15min,取出冷却至
室温,另以蒸馏水2.0ml,加苯酚和硫酸,与上述操作
做空白对照。用UV-1601型分光光度计于489.5nm处测
定吸光度[7]。其测定结果见表5。从图2葡萄糖标准曲
线中求出样品液中多糖的含量,按以下公式计算:
多糖含量=ρvdF/m
其中,ρ为样品溶液中多糖的浓度(mg/l),v为
样品溶液的体积(ml),d为样品的稀释因素,F为换
算因素,m为样品的质量(mg)。
李双妹:青荚叶多糖的提取及含量测定
2.7精密度试验
(1)仪器的精密度试验。将提取的多糖样品液重
复测定5次,求其相对标准偏差(RSD)。结果显示,所
测定RSD为0.0355%,说明此仪器的精密度较高。其试
验结果见表6。
表5 青荚叶多糖含量测定结果
编号
1
2
吸光度
0.2106
0.2151
多糖含量/(μg·g-1)
276.2
272.4
温 州 职 业 技 术 学 院 学 报 2010年 6月52
加标后中多糖的含量,测定该方法的回收率。采用标
样加入法测得平均回收率为100.7%。结果表明,此方
法的准确度高。
3 讨 论
多糖的测定方法很多,如蒽酮-硫酸法、苯酚-硫
酸法、水杨酸法、斐林法。由于苯酚-硫酸法操作简
单,价格低廉,因而本实验采用苯酚-硫酸法测定多
糖含量。实验中所作的标准曲线好,通过回收率测定
实验可知,本方法所测多糖含量准确率较高,且方法
简便、灵敏,在今后应用苯酚-硫酸法测定青荚叶多糖
含量时具有一定的参考价值。
在测定青荚叶多糖含量时,保持较高的硫酸浓度
非常重要,因为该显色反应是以对多糖的水解和糠醛
反应为基础的,硫酸浓度降低,会影响两种反应的进
行,由于样品溶液及苯酚的加入量都会影响硫酸的浓
度,因而必须控制一个合适的比例。本实验所建立的
方法简便、快速、灵敏、准确,测量结果可靠,测定
了青荚叶多糖平均含量为274.3μg/g,多糖的含量
较为丰富。由于多糖大多具促进免疫、抗病毒、抗肿
瘤等活性,青荚叶富含多糖,青荚叶具有广阔的开发
应用前景。
表6 青荚叶多糖含量测定精密度试验结果(N=5)
编号
1
2
3
4
5
吸光度
0.2106
0.2106
0.2106
0.2104
0.2104
葡萄糖含量 /
(μg·g-1)
276.2
276.2
276.2
276.0
276.0
RSD/%
0.0355
平均含量 /
(μg·g-1)
276.1
(2)方法的精密度试验。将同一批样品平行测定
2次,求其相对标准偏差(RSD)。结果显示,所测定
的RSD为0.693%,说明此方法的精密度高或重现性好。
其试验结果见表7。
表7 青荚叶多糖含量测定重现性试验结果(N=2)
取样量/g
1.004
1.004
吸光度
0.2106
0.2151
葡萄糖含量 /
(μg·g-1)
276.2
272.4
RSD/%
0.693
平均含量 /
(μg·g-1)
274.3
2.8回收率测定
采用标样加入法,用微量取液器吸取1.0ml稀释
液,向其中加入50μl葡萄糖标准溶液,按标准曲线的
制备方法测定吸光度,查标准曲线得样品液加标前和
[1]娄方明,白志川,杨娟.长叶胡颓子与中华青荚叶化学成分研究[D].重庆:西南大学,2006.
[2]王开发,支崇远,王隆华.我国花粉多糖测定及其意义[J].养蜂科技,2004(3):2-3.
[3]Gabriela Cuesta, Norma Suarez,Maria I Bessio,et al. Quantitative Determination of Pneumococcal Capsular Polysaccha-
ride Serotype 14 Using a Modification of Phenol-sulfuric acid Method[J]. Microbiological Methods,2003,52(1):69-73.
[4]鲁建江,王莉,顾承志,等.商陆多糖的微波提取及含量测定[J].首都医药,2002(5):55-56.
[5]张双凤,林香娟,于村.苯酚-硫酸法测定胖大海凉茶中多糖的研究[J].河南预防医学,2000,11(3):144-145.
[6]吴拥军,刘洁,吴予明,等.中药巴戟天多糖的测定及其微量元素的分析[J].光谱学与光谱分析,2005,12(25):2077-2078.
[7]高丽君,王汉忠,崔建华,等.苯酚-硫酸法测定白首乌中多糖含量[J].山东农业大学学报:自然科学版,2004,35(2):295-297.
[参 考 文 献]
[责任编辑:李 洁]
全国高等学校文科学报研究会
关于开展第四届评优活动的通知
在国家教育部实施的名刊名栏工程的推动下,高
等学校社会科学学报的面貌发生了显著变化,办刊质
量和办刊水平有不同程度的提高;在上级有关部门的
关心和广大会员单位的大力支持下,前三届研究会评
优工作取得了良好的效果。鉴于此,全国高等学校文
科学报研究会决定,于2010年6月中旬开展第四届评
优活动。评优活动的目的是,以评促改,以评促建,总
结经验,寻找差距,为进一步全面提高刊物的学术质
量、繁荣发展我国的哲学社会科学作出贡献。评奖活
动依据《中国高等学校社会科学学报质量标准及评估
办法》。奖项设立包括“权威学报”、“重点学报”、“百
强学报”、“优秀学报”奖和特色栏目奖。
(摘自《全国高等学校文科学报研究会通讯》)