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中国科学 C 辑:生命科学 2008 年 第 38 卷 第 10 期: 963 ~ 973
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《中国科学》杂志社
SCIENCE IN CHINA PRESS
中国温带地区根瘤菌与山黎豆和棘豆的新共生组合
隋新华, 韩丽丽, 汪恩涛, 江枫, 刘艺海, 陈文新*
中国农业大学生物学院，农业部农业微生物资源及其应用重点开放实验室，北京 100193
* 联系人, E-mail: wenxin@cau.edu.cn
收稿日期: 2008-07-08; 接受日期: 2008-07-23
国家基础科学和技术平台建设(批准号：2005DKA21201-1)、国家自然科学基金(批准号：30670001)和国家重点基础研究发展计划(批准号：
2006CB100206)资助项目

摘要 采用 16S rDNA PCR-RFLP, 16S-23S IGS RCP-RFLP, TP-RAPD, MLEE, 16S
rDNA和持家基因序列分析(atpD, recA 和 glnⅡ)等多种方法研究了 50株分离自中国
北方地区的山黎豆属(Lathyrus)和棘豆属(Oxytropus)植物根瘤菌的遗传多样性和系统
发育关系. 结果表明, 山黎豆属植物主要与根瘤菌属(Rhizobium)结瘤, 而棘豆属植物
主要与中华根瘤菌属(Sinorhizobium)结瘤. 一个与蚕豆根瘤菌(R. fabae)相近的根瘤菌
种群和苜蓿中华根瘤菌(S. meliloti)分别被鉴定为山黎豆和棘豆在本地区的主要共生
细菌, 而这两个根瘤菌-豆科植物的组合还没有在其他地区被发现. 这些结果扩展了
与该两属植物共生的细菌谱, 并为根瘤菌的生物地理学研究提供了新证据.
关键词
山黎豆属
棘豆属
根瘤菌
遗传多样性
北方地区



山黎豆属(Lathyrus)(蝶形花亚科 , 野豌豆族)和
棘豆属(Oxytropus) (蝶形花亚科, 山羊豆族)是广泛生
长于我国北方地区自然生态系统中, 尤其是草地土
壤的草本豆科植物, 它们能与土壤中广泛存在的根
瘤菌属(Rhizobium)菌株形成根瘤而共生固氮, 因此
它们在自然生态系统中起重要的作用. 由于能在贫
瘠的土壤、干旱、半干旱以及寒冷地区生长良好, 这
两种豆科植物中的很多种都可以用做牧草、绿肥、水
土保持和蜜源植物 , 有些种类还可用做观赏花卉[1].
近年来, 它们的药用功能[2]和对重金属的吸收功能[3]
越来越受到重视.
全世界记载山黎豆属 130 多个种, 中国有 18 个
种, 棘豆属有 300 多个种, 我国有 146 个种. 由于山
黎豆和棘豆是非大量种植的重要的经济作物[1], 所以
对它们的共生根瘤菌的研究很少. 20 世纪 80 年代曾
研究过分离自北美的山黎豆根瘤菌, 它们的分类地
位是豌豆根瘤菌野豌豆生物型 (Rhizobium legumi-
nosarum bv. viciae)[1,4]. 而最近一株分离自突尼斯南
部 的 Lathyrus numidicus 根 瘤 菌 被 鉴 定 属 于
Phyllobac- terium ifriqiyense[5]. 而分离自加拿大魁北
克及北极地区的两种山黎豆根瘤菌, 虽然属于豌豆
根瘤菌野豌豆生物型, 但它们具有耐受北极的寒冷
气候并耐受几种重金属的特性[1], 这预示着不同地区
山黎豆植物可能与不同的根瘤菌群体共生固氮.
中国青海-西藏地区[6]、美国和加拿大地区[7]的棘
豆属的几个种的根瘤菌曾被研究过, 它们属于豌豆
根瘤菌(R. leguminosarum)、高卢根瘤菌(R. gallicum)、
百脉根中慢生根瘤菌(Mesorhizobium loti)、鹰嘴豆中
慢生根瘤菌(M. ciceri)、费氏中华根瘤菌 (Sinorhizo-
bium fredii)、叶瘤杆菌属(Phyllobacterium sp.)和肠杆
菌科(Enterobacteriaceae). 但是与棘豆属内大量的种
相比, 对棘豆根瘤菌的多样性研究相对少得多, 棘豆
根瘤菌丰富的遗传多样性有待研究.
棘豆和山黎豆植物在生态系统中起着重要作用,




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对于它们共同的地理环境分布以及对其共生根瘤菌
的多样性尚缺乏研究. 为了解这两种豆科植物和根
瘤菌的共生关系, 本实验采用多种分子生物学方法
研究了这两种豆科植物根瘤菌的遗传多样性特征.
1 材料和方法
1.1 根瘤菌菌株
所有研究菌株列于表 1. 所有根瘤菌分离物来自
我国北方地区两种豆科植物的野生植株的根瘤. 菌
株分离和回接实验采用标准方法[8], 共分离了 33 株
山黎豆根瘤菌和 17 株棘豆根瘤菌, 所有分离物都能
与原宿主植物形成红色有效根瘤. 参比菌株包括根
瘤菌属的 10 个种、土壤杆菌属的 3 个种和中华根瘤
菌属或剑菌属[9]的 7 个种的模式菌或参比菌共 21 株.
菌体在甘露醇酵母粉培养基(YMA)上 28℃培养.
1.2 DNA 提取
菌株在 TY 培养基上培养 24 h, 2 mL 菌液于
14000 r/m 离心收集菌体, 500 μL 生理盐水离心洗涤 3
次, 然后提取 DNA [10] 并用作扩增模板.
1.3 扩增16S rDNA限制性分析和16S rDNA测序
16S rDNA 扩增引物 P1(大肠杆菌 16S rDNA
8~37 位, 5′- AGA GTT TGA TCC TGG CTC AGA
ACG AAC GCT-3′)和 P6(大肠杆菌 16S rDNA
1479~1506 位, 5′- TAC GGC TAC CTT GTT ACG
ACT TCA CCCC- 3′), 扩增程序见 Tan 等人[11]的补法,
5 μL 扩增产物分别用过量的 4 种限制性内切酶 Msp
Ⅰ, HaeⅢ, HinfⅠ和 AluⅠ酶切(每反应 5 U, TaKaRa),
加无菌水使终体积 10 μL 在 37℃下反应 4 h, 酶切产
物用 2.5%琼脂糖凝胶电泳分离并照相[12]. RFLP (re-
striction fragment length polymorphism) 图 谱 用
GelcomparⅡ 3.5 软件的 UPGMA (unweighted pair
grouping with mathematic average)法聚类分析, 具有
相同 RFLP 图谱类型被称为一个 rDNA 类型.
代表菌株的 PCR 产物纯化后采用 Hurek 方法[13]
测序(上海生工), 参比菌株的序列从 NCBI 下载, 采
用MEGA 4软件聚类分析[14], 采用 Jukes-Cantor 方法
重复 1000 次构建邻接系统发育树[15].
1.4 16S-23S rDNA 间隔区(IGS)DNA 的 PCR-
RFLP 分析
引物 FGPS 1509 (位于 16S rDNA 区) 和 23S-38
(位于 23S rDNA 区), 扩增程序如 Rasolomampianina
等人[16]报道, 分别用 MspⅠ, HaeⅢ和 HhaⅠ3 种酶酶
切, 其他条件和方法同 1.3 节.
1.5 双引物随机扩增多态性 DNA
引物8F(5′-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3′)
和 1522R(5′-AAG GAG GTG ATC CAN CCR CA-3′),
扩增及电泳根据 Rivas 等人[17] 的方法, 数据分析同
1.3 节.
1.6 多位点酶电泳
酶提取和淀粉凝胶电泳采用 Caballero-mellado
等人[18]报道的方法, 共分析 10 个酶：异柠檬酸脱氢
酶(IDH)、苹果酸脱氢酶(MDH)、次黄嘌呤脱氢酶
(XDH)、6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶 (6PG)、6-磷酸葡萄
糖脱氢酶(G6P)、己糖激酶 (HEX), 过氧化物歧化酶
(SOD)、脂酶 (EST)、过氧化物酶 (PO) 和磷酸葡萄
糖变位酶 (PGM), 酶活性采用 Selander 等人[19]描述
的方法, 相似性用两菌株共有的等位基因酶占全部
等位基因酶比率表示, 采用UPGMA方法计算相似性
并构建树状图[20].
1.7 持家基因 atpD, recA 和 glnⅡ的系统发育分析
atpD 序列引物为 atpD255F (5′-GCT SGG CCG
CAT CMT SAA CGT C-3′) 和 atpD782R (5′-GCC
GAC ACT TCM GAA CCN GCC TG-3′), recA 序列引
物为 recA41F (5′-TTC GGC AAG GGM TCG RTS
ATG-3′) 和 recA640R (5′-ACA TSA CRC CGA TCT
TCA TGC-3′), 扩增方法如文献[21]报道. 部分 gln
Ⅱ 基因扩增引物为 glnⅡ12F (5′-YAA GCT CGA
GTA CAT YTG GCT-3′) 和 glnII689R (5′-TGC ATG
CCS GAG CCG TTC CA-3′), 采用 16S rDNA 扩增程
序. 扩增产物的测序和系统发育树的构建同 1.3 节.
2 结果
2.1 ARDRA 分析的 rDNA 型
ARDRA 方法能将菌株分群并初步确定它们的




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表 1 分离自中国的山黎豆和棘豆的根瘤菌
聚群结果#
菌株 (CCBAU No.)* 宿主植物拉丁名
rDNA 型 IGS 群 MLEE 群 TP-RAPD 群
地理来源
“R. leguminosarum”
05232 L. japonicus 14 7 8 S 河北
R. etli
25080 L. davidii 20 8 NO 山东
Rhizobium sp. I
81010 L. quinquenervius 9 11 NO 青海
01259 L. quinquenervius 13 11 3 3 内蒙
05108 O. caerulea 15 11 2 4 河北
01241 L. quinquenervius 16 11 2 3 内蒙
25154 L. davidii 17 S 1 1 山东
25235 L. odoratus 17 7 1 NO 山东
25267 L. odoratus 17 S 2 2 山东
45263, 45187, 45247,
45261 L. davidii 17 9 1 1 河南
45262 L. davidii 18 9 1 1 河南
45097, 45121 L. davidii 19 9 1 1 河南
45260 L. davidii 21 9 1 1 河南
45022 L. davidii 39 9 3 1 河南
05016 O. ochrantha 39 S 1 S 河北
“R. gallicum” or “R. yanglingense”
05034 O. ochrantha 22 3 7 S 河北
05160 O. ochrantha 23 3 7 S 河北
05147 O. hirta 23 3 7 S 河北
01173 O. psammocharis 25 NO S S 内蒙
“R. tropici”
25226 L. davidii 30 NO S 山东
01186 L. davidii 31 10 NO 内蒙
43133 L. davidii 32 6 S 湖北
43165 L. davidii 33 6 S 湖北
45242 L. davidii 34 10 S 河南
Rhizobium spp.
73018 L. pratensis 8 S NO 甘肃
81094 L. quinquenervius 10 S S 青海
81095 L. quinquenervius 11 S NO 青海
01225 L. quinquenervius 12 S NO 内蒙
“S. morelense”
01082 O. ochrantha 1 4 6 S 内蒙
01092 L. quinquenervius 2 4 S 3 内蒙
01232 O. ochrantha 3 4 6 S 内蒙
01025 O. myriophylla 5 4 6 S 内蒙
15029 L. quinquenervius 6 5 S 黑龙江





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聚群结果#
菌株 (CCBAU No.)* 宿主植物拉丁名
rDNA 型 IGS 群 MLEE 群 TP-RAPD 群
地理来源
15008 L. odoratus 7 5 S 黑龙江
Sinorhizobium sp.
13037 L. quinquenervius 40 S NO 吉林
S. meliloti
05054 O. ochrantha 41 1 4 S 河北
05296 O. caerulea 44 1 4 S 河北
05294 O. hirta 44 1 4 4 河北
05097 O. caerulea 44 1 4 S 河北
05295 O. caerulea 44 1 4 4 河北
05027 O. hirta 44 1 4 4 河北
05200 O. hirta 45 1 4 4 河北
Unclassified genera
73063 L. pratensis 51 S S 甘肃
01219 L. sativus 53 S 5 S 内蒙
01072 O. myriophylla 54 S 5 S 内蒙
Main referente strains§
R. etli CFN 42T 17 8 S 墨西哥
R. gallicum USDA 2918T 24 2 S 法国
R. leguminosaru USDA 2370T 13 7 美国
R. yanglingense CCBAU 71623T 38 2 中国
S. meliloti USDA 1002T 45 1 4 美国
S. morelense Lc 04T 4 4 墨西哥
* 黑体菌株用于序列分析; #霉群结果中 NO 代表无 PCR 产物, S 表示不聚群的菌株; § 下列菌株也被用于不同分析：Agrobacterium
rhizogenese IAM 13570T, A. rubi IAM 13569T, A. tumefaciense IAM 13129T, R. galegae HAMBI 540T, R. giardinii USDA 2914T, R. huautlense
S02T, R. mongolense USDA 1844T, R. sullae IS 123T, R. tropici CFN 299, R. tropici CIAT 899T, S. kostiense HAMBI 1489T, S. arboris HAMBI
1552T, S. sahelense LMG 7837T, S. fredii CCBAU 110, S. medicae USDA 1037T

系统发育关系. 本研究中 50 个根瘤菌分离物共产生
39 种 rDNA 型 (表 1). 聚类分析中, 72％的相似性水
平上，71 株菌被分为 5 个群和 1 个单一菌株(CCBAU
15008) , 4 个群分别包括莫雷兰中华根瘤菌 (S. mo-
relense)、根瘤菌属内种、中华根瘤菌属内种、贾氏
根瘤菌-土壤杆菌(R. giardini-Agrobacterium)的参比
菌和根瘤菌分离物, 群 V 包括 3 株根瘤菌分离物而
无已知根瘤菌种的参比菌株, 该群与其他 4 个群差别
很大; 在 90％左右可细分成 9 个亚群. 33 株山黎豆根
瘤菌中, 27 株属于根瘤菌属, 4 株属于中华根瘤菌属,
其余 2株和 1株棘豆根瘤菌 CCBAU 01072属于群 V;
16株棘豆根瘤菌中 10株属于中华根瘤菌属, 6株属于
根瘤菌属; 聚类分析结果表明 ARDRA 方法能快速
确定菌株的属, 但不同 rDNA 型的种群地位需用其
他方法确定.
2.2 16S-23S rDNA 间隔区(IGS)的 PCR-RFLP
分析
此方法能在种群水平上将分离物聚群. 包括 48
株代表不同 rDNA 型的分离物和 15 株参比菌, 其他
菌株因未扩增出产物而未加入此研究(表 1, 图 1). 聚
类分析中, 所有 63 株菌产生 46 个 IGS 酶切类型, 它
们在 80％的相似性水平上被分成 11 个群(图 1), 群 1
包括 7 株分离物和苜蓿中华根瘤菌 USDA 1002T, 群
2 由杨凌根瘤菌(R. yanglingense) CCBAU 71623T 和
蒙古根瘤菌(R. mongolense)USDA 2918T 组成, 群 4 包
括 4 株分离物和 S. morelense Lc04T, 群 7 由 3 株分离
物和 R. leguminosarum USDA 2370T 组成, 群 8 包括
CCBAU 25080 和菜豆根瘤菌 (R. etli)CFN 42T, 群 3,
5, 6, 9, 10 和 11 分别包括 3, 2, 3, 9, 2 和 4 株分离
物, 这 6 个群都不含参比菌株. 群 1, 3 和 4 基本和
(续表 1)




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图 1 山黎豆和棘豆根瘤菌与参比菌株 16S~23S IGS RFLP 聚类分析树状图





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ARDRA 分析中的亚群 9, 6 和 1 分别对应, 而群 6 和
10 与 ARDRA 的亚群 7 相一致, 群 7 和 11 与 ARDRA
的亚群 4、群 8 和 9 与 ARDRA 的亚群 5 也分别有一
致的对应关系(表 1). 这些结果支持 ARDRA 分析得出
的菌群间的亲缘关系并进一步将分离物鉴定到已知种
内.
2.3 双引物随机扩增多样性指纹图谱分析
该方法用于鉴别种群水平的多样性. 共获得了
42 株分离物和 19 株参比菌株的扩增产物(表 1). 在聚
类分析中, 在 81％的相似性水平形成了 5 个群, 所有
参比菌株的指纹图谱都不同, 群 1 包括 10 株来自河
南和山东两省的大山黎豆(L. davidii)根瘤菌, 群 2 由
CCBAU 25267 和苜蓿中华根瘤菌 USDA 1002T 构
成, 群 3 含有 3 株山黎豆(L. quinquenervius)根瘤菌,
群 4 包括 5 株棘豆(Oxytropis spp.)根瘤菌, 其他分离
物都没有聚群, 群 1 和 4 分别与 ISG-RFLP 的群 9
和 1 相对应. 聚类分析结果与 IGS RFLP 的分群结果
相似, 但是存在较多的未聚群的菌株这个事实说明
该方法在评估菌株的遗传多样性上更有价值.
2.4 多位点酶电泳分析
多位点酶电泳分析与 IGS RFLP 分析一起常被
用于确定基因型种. 分析了代表 4 个 IGS RFLP 群的
33 株根瘤菌和 13 株参比菌, 它们共产生 46 种电泳类
型, 聚类结果表明在 90％的相似性水平上分为含有 2
到 10个不等菌株的 8个群(图 2, 表 1), 这些群与 IGS
RFLP 及 16S rDNA RFLP 聚类群基本相对应.



图 2 山黎豆和棘豆根瘤菌 MLEE 指纹图谱树状图




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2.5 16S rDNA, atpD, recA 和 glnⅡ 基因序列系
统发育关系分析
16S rDNA 和持家基因序列分析常用于确定分离
物的属，并验证其他方法的分类结果. IGS 群 9 代表
菌株 CCBAU 45187 和 CCBAU 45121(rDNA 型 17
和 19)、群 1 代表菌株 CCBAU 05200 和 CCBAU
05296 (rDNA 型 45 和 44)、与 R. gallicum 相近的菌
株 CCBAU 01173 和参比菌株的 16S rDNA 序列一起
构建系统发育树(图 3), 从系统发育树看出, CCBAU
45187 和 CCBAU 45121 位于 Rhizobium 分支, 两者的
序列相似性为 99.9％ , 它们与蚕豆根瘤菌(R. fa-
bae)CCBAU 33202T[22]相似性最高, 分别是 99.9％



图 3 山黎豆和棘豆根瘤菌代表菌株和参比菌株的 16S rDNA 序列系统发育树
标尺代表核酸差异率, 大于 70％的扩展值在节点显示





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图 4 山黎豆和棘豆极瘤苗代表菌株和参比菌株的 atpDtrecA 发育树序列系统
标尺代表核酸差异率, 大于 70％的扩展值在节点显示

和 99.8％, 与 R. etli CFN 42T 的相似性为 99.5％;
CCBAU 05200 和 CCBAU 05296 位于 Sinorhizobium
分支, 它们与 S. meliloti 和 S. kummerowiae 的模式菌
株的序列相同; CCBAU 01173 与 R. gallicum R602T
和 R. yanglingense SH22623T (=CCBAU 71623)的相似
性最高为 99.9％.
IGS 群 1, 3, 7 和 9 的 7 株代表菌株和参比菌株
的持家基因 atpD, recA 和 glnⅡ 的部分序列系统发
育树分别被构建, 3 个树显示了一致的系统发育关系,
于是构建了 atpD 和 recA 合并序列的系统树(图 4),
几个参比菌株的 glnⅡ 基因序列数据缺少而未加入
合并序列系统树中 , 但 glnⅡ 序列系统发育树与
16S rDNA 序列树和合并树显示了一致的系统发育关
系. 在合并序列系统树中, CCBAU 45121 和 CCBAU
45187 序列相似性是 99％, 与 R. fabae CCBAU 33202T
序列相似性分别是 96.9％和 95.2％; CCBAU 05296 和
CCBAU 05200 序列相似性为 98.8％, 与 S. meliloti
USDA 1002T的相似性为 98.5％ 和 98.8％; IGS 群 7
的代表菌株 CCBAU 05232 与 R. leguminosarum
USDA 2370T 的相似性最高; 群 3 代表菌株 CCBAU
05160 和 CCBAU 01173 与 R. yanglingense CCBAU
71623T, R. mongolense USDA 1844T 和 R. gallicum
R602T 的序列密切相关. 以上结果不仅支持 ARDRA，
IGS RFLP，TP-RAPD 和 MLEE 几种方法的分析结
果, 并进一步明确了研究菌株的系统发育关系和种
属地位.




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3 讨论
近年来，多相分类的方法被广泛用于细菌分类.
该方法是利用尽可能多的表观型和基因型研究方法
的数据, 以互相印证得到一致的分类结果, 并与 16S
rDNA 序列揭示的系统发育关系相一致[23]. 按照这一
分类理论, 本研究采用几种分子水平研究方法来确
定 50 株山黎豆和棘豆根瘤菌的分类地位, ARDRA,
IGS-RFLP, TP-RAPD 和 MLEE 这 4 种方法用于确定
细菌基因型种, ARDRA 和 IGS RFLP 是基于核糖体
DNA 区的多样性分析, 而 TP RAPD 和 MLEE 研究的
是总染色体上分散的 DNA 区的多样性, 这几种方法
在确定菌株的种群地位上的价值已被证明[11,16~18]. 本
研究中上述方法聚类结果总体上都非常相似(表 1), 同
时也存在一些独特的、细微的差异. 16S rDNA 序列
分析能确定基因型种、属的地位, 持家基因分析进一
步支持 16S rDNA 序列系统发育关系[21].
多相分类结果表明所有根瘤菌分离物分布在
Rhizobium, Sinorhizobium 以及未定属的菌群Ⅴ (表 1)
中, 前两属中含几个不同的基因型种. 大多数山黎豆
根瘤菌属于根瘤菌属, 而大多数棘豆根瘤菌是中华
根瘤菌. 对山黎豆而言, 与已知根瘤菌不同的根瘤菌
种群Ⅰ(Rhizobium sp.Ⅰ)是最大的共生群体, 其次的
基因型种分别是 R. leguminosarum, R. etli, 热带根瘤
菌 (R. tropici)和 Rhizobium spp., Sinorhizobium spp.和
未定属的菌群Ⅴ是山黎豆属中的少数共生体. 而对
于棘豆属植物, S. meliloti 是它们最大的共生群体, 其
他是 R. gallicum, Rhizobium sp.Ⅰ, S. morelense, Rhizo-
bium spp.和未定属的菌群Ⅴ. 表明尽管这两种豆科植
物生长环境相似并能与相同的根瘤菌群共生, 但其
实它们喜欢的根瘤菌群体不同.
分离自棘豆[6,7]和山黎豆[1]的 R. gallicum 和 R.
leguminosarum 已有报道 . 本研究对山黎豆根瘤菌
Rhizobium sp.Ⅰ和来自棘豆的与 S. meliloti 最近的菌
群进行了深入研究, 16S rDNA 和持家基因序列分析
证明这群棘豆根瘤菌分类地位就是 S. meliloti, 同时
确定了 Rhizobium sp.Ⅰ与新种 R. fabae 亲缘关系最
近[22], 然而交叉结瘤实验表明Rhizobium sp.Ⅰ的菌株
不能与蚕豆结瘤(未发表数据). 因此, 需要 DNA 同
源性杂交、表型性状分析和共生基因型鉴定以进一步
确定 Rhizobium sp.Ⅰ的分类地位.
本研究中, 来自大山黎豆 (L. davidii)的 11 株和
香豌豆 (L. odoratus)的 2 株根瘤菌属于 Rhizobium sp.
I, 另 5 株来自 L. davidii 的根瘤菌属于 R. tropici, 相
反, 15 株分别来自牧地山黎豆(L. pratensis, 2 株)、山
黎豆 (L. quinquenervius , 10 株)、 家山黎豆 (L. sa-
tivus, 1 株)、日本山黎豆 (L. japonicus, 1 株)和 L.
odoratus (1 株)属于 R. leguminosarum, S. morelense,
Rhizobium spp., 这 表 明 L. davidii 喜 欢 选 择 与
Rhizobium sp.Ⅰ 和 R. tropici 共生结瘤. 而 L. quin-
quenervius 及其他的种选择共生根瘤菌的范围较宽;
地理来源可能影响根瘤菌和 Lathyrus 结合, 因为 L.
davidii 根瘤菌主要来于河南和山东省, 而其他根瘤菌
来自不同的地区. Drouin 等人[1]的研究也有相似的情
况, 他们发现分离自加拿大魁北克的 L. japonicus 和 L.
pratensis的根瘤菌都属于 R. leguminosarum. 而本研究
中来自 L. japonicus 的 CCBAU 05232 属于 R. legumi-
nosarum, 但来自 L. pratensis 的 CCBAU 73018 和
CCBAU 73063分别属于Rhizobium和未确定地位菌群,
这与他们的研究不同.
长期以来, 仅苜蓿 (Medicago)、草木樨 (Melilotus)
和葫芦巴属 (Trigonella)被认为能与 S. meliloti 结瘤,
但最近从 Tunisian Oasis 的菜豆 (Phaseolus vulgaris)
中分离的一些根瘤菌被鉴定为 S. meliloti 的一个新的
生物型-地中海生物型 (bv. mediterranense)[24]. 这群
根瘤菌与来自其他宿主的 S. meliloti 及 R. etli 的结瘤
基因都不同. 由此推测, 如果来自棘豆的 S. meliloti
菌株的结瘤基因不同于该种内其他菌株, 它们即可
能是一个新的生物型.
与棘豆结瘤的有中慢生根瘤菌属 (Mesorhizo-
bium)、叶瘤杆菌属 (Phyllobacterium)、Rhizobium 和
Sinorhizobium 的不同种已有报道[6,7], 但是加拿大的
棘豆根瘤菌[7]完全不同于中国的 Kan 等人[6]研究的和
本研究的棘豆根瘤菌. 加拿大的棘豆根瘤菌主要是
百脉根中慢根瘤菌-鹰嘴豆中慢生根瘤菌群(M. loti-M.
ciceri)、地中海中慢生根瘤菌(M. mediterraneum), 只
有 1 株菌是 R. gallicum. 而研究过的中国棘豆根瘤菌
属于 Rhizobium 和 Sinorhizobium, 只有 3 株菌是华癸
中慢生根瘤菌-紫穗槐中慢生根瘤菌(M. huakuii-M.




隋新华等: 中国温带地区根瘤菌与山黎豆和棘豆的新共生组合


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amorphae). R. gallicum 无论是在加拿大(1 株)还是中
国(3 株)都是与棘豆结瘤共生的小菌群. 基于这些研
究结果, 在宿主植物、环境因子(土壤类型, 气候)和
两者综合作用 3 个因素之间, 两国的棘豆植物选择不
同的根瘤菌群体的主要决定因子仍难以确定, 然而
两个国家的棘豆共生的主要根瘤菌类群或种不同这
一点非常明确. 本研究还证明了棘豆可以有很宽泛
的共生细菌谱, 这种共生混杂的特性导致它们是研
究根瘤菌与宿主间互作关系、根瘤菌基因背景、根瘤
菌共生基因以及环境因子对共生结合的影响的最好
材料.
Martiny 等人[25]综述了微生物的生物地理学, 指
出自生微生物的分类单元能展示它们的地理分布图
谱, 提出了微生物空间分布的多样性在一定程度上是
环境选择的结果的假设. 已有研究[22,26,27]证明根瘤菌
也存在着地理分布图谱, 其与本研究共同证明了根瘤
和茎瘤共生细菌的地理分布, 取决于它们的环境和
宿主植物的地理分布.
总之, 本研究明确了中国温带地区山黎豆属和
棘豆属植物能与多种根瘤菌共生结瘤. 山黎豆属植
物和 Rhizobium sp.Ⅰ、棘豆属植物和 S. meliloti 的大
量共生结合初次被发现, 这一发现扩展了根瘤菌与
这两种豆科植物的共生系谱. 同时, 中国温带地区根
瘤菌群体组成上的差异也为根瘤菌的生物地理学提
供了新的证据.
致谢 感谢中国农业大学的陈文峰博士给予计算机软件使用上的指导.
参考文献
1 Drouin P, Prevost D, Antoun H. Classification of bacteria nodulating Lathyrus japonicus and Lathyrus pratensis in Northern Quebec
as strains of Rhizobium leguminosarum biovar viciae. Int J Syst Bacteriol, 1996, 46: 1016—1024
2 Chase L A, Peterson N L, Koerner J F. The lathyrus toxin, beta-N-oxalyl-L-alpha, beta-diaminopropionic acid (ODAP), and homo-
cysteic acid sensitize CA1 pyramidal neurons to cystine and L-2-amino-6-phosphonohexanoic acid. Toxicol Appl Pharmacol, 2007,
219: 1—9
3 Panda G C, Das S K, Guha A K. Biosorption of cadmium and nickel by functionalized husk of Lathyrus sativus. Colloids Surf B Bio-
interfaces, 2008, 62: 173—179
4 Brenner D J, Krieg N R, Staley J T, et al. Bergey′s Manual of Systematic Bacteriology, 2nd ed. New York: Springer, 2005. 325—340
5 Mantelin S, Saux M F, Zakhia F, et al. Emended description of the genus Phyllobacterium and description of four novel species asso-
ciated with plant roots: Phyllobacterium bourgognense sp. nov., Phyllobacterium ifriqiyense sp. nov., Phyllobacterium leguminum sp.
nov. and Phyllobacterium brassicacearum sp. nov. Int J Syst Evol Microbiol, 2006, 56: 827—839
6 Kan F L, Chen Z Y, Wang E T, et al. Characterization of symbiotic and endophytic bacteria isolated from root nodules of herbaceous
legumes grown in Qinghai-Tibet plateau and in other zones of China. Arch Microbiol, 2007, 188: 103—115
7 Laguerre G, van Berkum P, Amarger N, et al. Genetic diversity of rhizobial symbionts isolated from legume species within genera As-
tragalus, Oxytropis, and Onobrychis. Appl Environ Microbiol, 1997, 63: 4748—4758
8 Vincent J A. Manual for the Practical Study of Root Nodule Bacteria. International Biological Programme Handbook. Oxford: Black-
well Science Publisher, 1970. 15—39
9 Martens M, Dawyndt P, Coopman R, et al. Advantages of multilocus sequence analysis for taxonomic studies: a case study using 10
housekeeping genes in the genus Ensifer (including former Sinorhizobium). Int J Syst Evol Microbiol, 2008, 58: 200—214
10 Terefework Z, Kaijalainen S, Lindström K. AFLP fingerprinting as a tool to study the genetic diversity of Rhizobium galegae isolated
from Galega orientalis and Galega officinalis. J Biotechnol, 2001, 91: 169—180
11 Tan Z Y, Xu X D, Wang E T, et al. Phylogenetic and genetic relationships of Mesorhizobium tianshanense and related rhizobia. Int J
Syst Bacteriol, 1997, 47: 874—879
12 Wang E T, Rogel M A, García-de L S A, et al. Rhizobium etli bv. mimosae, a novel biovar isolated from Mimosa affinis. Int J Syst
Bacteriol, 1999, 49: 1479—1491




中国科学 C 辑: 生命科学 2008 年 第 38 卷 第 10 期


973
13 Hurek T, Wagner B, Reinhold-Hurek B. Identification of N2-fixing plant- and fungus-associated Azoarcus species by PCR-based ge-
nomic fingerprints. Appl Environ Microbiol, 1997, 63: 4331—4339
14 Kumar S, Tamura K, Nei M. MEGA 3: integrated software for molecular evolutionary genetics analysis and sequence alignment. Brief
Bioinfo, 2004, 5: 150—163
15 Nei M, Li W H. Mathematical model for studying genetic variation in terms of restriction endonucleases. Proc Natl Acad Sci USA,
1979, 76: 5269—5273
16 Rasolomampianina R, Bailly X, Fetiarison R, et al. Nitrogen-fixing nodules from rose wood legume trees (Dalbergia spp.) endemic to
Madagascar host seven different genera belonging to α- and β -Proteobacteria. Mol Ecol, 2005, 14: 4135—4146
17 Rivas R, Velázquez E, Valverde A, et al. A two primers random amplified polymorphic DNA procedure to obtain polymerase chain
reaction fingerprints of bacterial species. Electrophoresis, 2001, 22: 1086—1089
18 Caballero-mellado J, Martinez-Romero E. Limited genetic diversity in the endophytic sugarcane bacterium Acetobacter diazotrophicus.
Appl Environ Microbiol, 1994, 60(5): 1532—1537
19 Selander R K, Caugant D N, Ochman H, et al. Methods of multilocus enzyme electrophoresis for bacterial population genetics and
systematics. Appl Environ Microbiol, 1986, 51(5): 873—884
20 Sneath P H A, Sokal R R. Numerical Taxonomy: the Principles and Practice of Numerical Classification. San Francisco: W H Freeman
and Company, 1973
21 Vinuesa P, Rademaker J L, de Bruijn F J, et al. Genotypic characterization of Bradyrhizobium strains nodulating endemic woody leg-
umes of the Canary Islands by PCR-restriction fragment length polymorphism analysis of genes encoding 16S rRNA (16S rDNA) and
16S-23S rDNA intergenic spacers, repetitive extragenic palindromic PCR genomic fingerprinting, and partial 16S rDNA sequencing.
Appl Environ Microbiol, 1998, 64: 2096—2104
22 Tian C F, Wang E T, Han T X, et al. Genetic diversity of rhizobia associated with Vicia faba in three ecological regions of China.
Arch Microbiol, 2007, 188: 273—282
23 Vandamme P, Pot B, Gillis M, et al. Polyphasic taxonomy, a consensus approach to bacterial systematics. Microbiol Rev, 1996, 60: 407—
438
24 Mnasri B, Mrabet M, Laguerre G, et al. Salt-tolerant rhizobia isolated from a Tunisian oasis that are highly effective for symbiotic
N2-fixation with Phaseolus vulgaris constitute a novel biovar (bv. mediterranense) of Sinorhizobium meliloti. Arch Microbiol, 2007,
187: 79—85
25 Martiny J B H, Bohannan B J M, Brown J H, et al. Microbial biogeography: putting microorganisms on the map. Nat Rev Microbiol,
2006, 4: 102—112
26 Gu C T, Wang E T, Sui X H, et al. Diversity and geographical distribution of rhizobia associated with Lespedeza spp. in temperate
and subtropical regions of China. Arch Microbiol, 2007, 188: 355—365
27 Lin D X, Man C X, Wang E T, et al. Diverse rhizobia that nodulate two species of Kummerowia in China. Arch Microbial, 2007, 188:
495—507