全 文 ：* 国家自然科学基金项目(编号:81102817) ;江苏省滩涂生物资源与环境保护重点建设实验室项目(编号:JLCBE09021) ;盐城师范学院教
研项目(编号:13YCTCJY046) ;盐城师范学院博士科研启动基金资助项目
作者 Tel:(0515)83258773;E － mail:pharmyufan@ 163． com
HPLC法同时测定濒危植物———中华补血草中
异槲皮苷、桑色素、槲皮素、木犀草素和芹菜素的含量*
喻樊1，2
(1．江苏省滩涂生物资源与环境保护重点建设试验室，盐城 224002;2．盐城师范学院药学院，盐城 224051)
摘要 目的:建立 HPLC法测定濒危野生药用植物中华补血草(Limonium sinense (Girard)Kuntze)中异槲皮苷、桑色素、槲皮
素、木犀草素和芹菜素的含量，为中华补血草的质量控制提供理论依据。方法:采用高效液相色谱法同时测定中华补血草中
异槲皮苷、桑色素、槲皮素、木犀草素和芹菜素的含量。色谱柱:TUＲNEＲ KromasilTMC18柱(250 mm ×4. 6 mm，5 μm) ，以甲醇 －
0. 4%磷酸溶液为流动相进行梯度洗脱，流速为 1 mL·min －1，检测波长为 360 nm，柱温 30 ℃。结果:异槲皮苷、桑色素、槲皮
素、木犀草素和芹菜素的质量浓度与峰面积分别在 1. 00 ～ 99. 67 mg·L －1(r = 0. 9994)、0. 45 ～ 45. 42 mg·L －1(r = 0. 9997)、
0. 77 ～ 76. 57 mg·L －1(r = 0. 9996)、0. 43 ～ 42. 72 mg·L －1(r = 0. 9997)、0. 55 ～ 55. 39 mg·L －1(r = 0. 9998)范围内呈良好的
线性关系;平均加样回收率(n =6)分别为 98. 9%、98. 6%、98. 6%、97. 8%、98. 7%，ＲSD为 1. 6%、1. 7%、1. 7%、2. 2%、1. 7%。结
论:方法简便可行、重复性好，适合于同时测定中华补血草中异槲皮苷、桑色素、槲皮素、木犀草素和芹菜素的含量，可作为我国中
华补血草质量评价的方法之一。
关键词:中华补血草(海菠菜、海赤芍、匙叶草、盐云草) ;异槲皮苷;桑色素;槲皮素;木犀草素;芹菜素
中图分类号:Ｒ917 文献标识码:A 文章编号:0254 － 1793(2014)04 － 0632 － 04
Simultaneous determination of isoquercetin，morin，quercetin，luteolin and
apigenin in Limonium sinense (Girard)Kuntze by ＲP － HPLC*
YU Fan1，2
(1． Jiangsu Provincial Key Laboratory of Coastal Wetland Bioresources and Environmental Protection，Yancheng 224002，China;
2． School of Pharmacy，Yancheng Teachers University，Yancheng 224051，China)
Abstract Objective:To establish a determination method for the content of isoquercetin，morin，quercetin，luteo-
lin and apigenin in Limonium sinense (Girard)Kuntze by HPLC and provide theoretical support for quality control
of this medicine．Methods:The HPLC conditions with TUＲNEＲ KromasilTMC18 column (250 mm ×4. 6 mm，5 μm)
were used;the mobile phase consisted of methanol － 0. 4% phosphoric acid;the flow rate was 1 mL·min －1 and the
detection wavelength was set at 360 nm． The column temperature was 30 ℃ ． Ｒesults:The linear ranges for isoquer-
cetin，morin，quercetin，luteolin，apigenin were 1. 00 － 99. 67 mg·L －1(r = 0. 9994) ，0. 45 － 45. 42 mg·L －1(r =
0. 9997) ，0. 77 － 76. 57 mg·L －1(r =0. 9996) ，0. 43 － 42. 72 mg·L －1(r = 0. 9997) ，0. 55 － 55. 39 mg·L －1(r =
0. 9998) ，respectively． The average recoveries(n =6)were 98. 9%，98. 6%，98. 6%，97. 8% and 98. 7% with ＲSDs of
1. 6%，1. 7%，1. 7%，2. 2%，1. 7%，respectively． Conclusion:The method is simple and repeatable． This method
could be used to simultaneously determinate the contents of isoquercetin，morin，quercetin，luteolin and apigenin in Li-
monium sinense (Girard)Kuntze，and to identify and evaluate the quality of Limonium sinense (Girard)Kuntze．
Key words:Limonium sinense (Girard)Kuntze;isoquercetin;morin;quercetin;luteolin;apigenin
中华补血草 Limonium sinense (Girard)Kuntze
是蓝雪科补血草属植物，又名海菠菜、海赤芍、匙叶
草、盐云草，为多年生泌盐草本药用植物［1］，2001 被
列为中华人民共和国植物保护品种［2］。中华补血
—236— 药物分析杂志 Chin J Pharm Anal 2014，34(4)
草有清热解毒、止血散瘀、祛风消炎、抗癌、抗衰老的
功效［3］。研究表明，黄酮为中华补血草主要有效成
分之一。大量文献证实异槲皮苷、桑色素有抗炎、抗
氧化、降压等生物活性［4 － 5］，槲皮素具有抗氧化、抗
癌、抗突变等作用［6］，木犀草素亦有抗癌细胞增殖、
诱导癌细胞凋亡和凋亡增敏作用［7］，芹菜素有明确
的抗肿瘤活性和机制［8］，均为中药材中主要的黄酮
活性成分和衡量药材质量的重要指标［9］。本课题
对测定中华补血草中异槲皮苷、桑色素、槲皮素、木
犀草素和芹菜素的含量，留存原始野生中华补血草
的质量资料，以及后续中华补血草野生品种的保存
和鉴定、揭示中华补血草的药理作用，具有重要的
意义。
1 仪器与试药
1. 1 仪器 LC － 2010C 高效液相色谱仪(日本岛
津公司) ，分析天平(德国赛多利斯 BS210S) ，
SK5200H超声波清洗机(上海科导超声仪器有限公
司) ，双光束紫外可见分光光度计(尤尼柯仪器有限
公司，UV －4802H型)。
1. 2 试药 异槲皮苷对照品(阿拉丁，批号
1123631 ) ，桑 色 素 对 照 品 (Sigma，批 号
SLBB1225V) ，槲皮素对照品(中国食品药品检定研
究院，批号 100081 － 200806) ，木犀草素对照品(阿
拉丁，批号 1131358) ，芹菜素对照品(杭州天草科技
有限公司，批号 API201108261，纯度 ＞ 98%)。甲醇
(色谱纯，天津大茂化学仪器供应站) ，其他试剂均
为分析纯，水为纯净水。
中华补血草样品均自采集，经盐城师范学院生命
科学与技术学院于延球教授鉴定为蓝雪科补血草属
中华补血草 Limonium sinense (Girard)Kuntze全草。
2 方法与结果
2. 1 色谱条件 色谱柱:TUＲNEＲ KromasilTM(250
mm ×4. 6 mm，5 μm) ;流动相 A 为甲醇，B 为 0. 4%
磷酸溶液，梯度洗脱［0 ～ 6 min A － B(45∶ 55) ;6 ～ 13
min，A － B(40∶ 60) ;13 ～ 40 min，A － B(55∶ 45) ］;流
速:1 mL·min －1;检测波长:360 nm;进样量:20 μL;
柱温:30 ℃。
2. 2 混合对照品储备液的制备 精密称取干燥至
恒重的异槲皮苷、桑色素、槲皮素、木犀草素和芹菜
素的对照品于同一量瓶，以甲醇制备质量浓度依次
为 99. 67、45. 42、76. 57、42. 72、55. 39 μg·mL －1的
混合对照品储备液。
2. 3 供试品溶液的制备 取中华补血草药材样品，
粉碎，取粉末(过 3 号筛)约 1 g，精密称定，精密加
入甲醇 100 mL，称定重量，加热回流提取 60 min，放
冷后称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，0. 45
μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得［10 － 11］。
2. 4 系统适用性考察 分别量取混合对照品溶液、
供试品溶液注入色谱仪，记录色谱图(图 1) ，结果异
槲皮苷、桑色素、槲皮素、木犀草素和芹菜素与样品
中其他成分能较好分离。理论板数按异槲皮苷、桑
色素、槲皮素、木犀草素和芹菜素峰计算应均不低于
3000。
图 1 对照品(A)及中华补血草样品(B)的 HPLC图
Fig 1 The HPLC chromatograms of reference substance(A)and Limoni-
um sinense sample(B)
1．异槲皮苷(isoquercetin) 2． 桑色素(morin) 3． 槲皮素(querce-
tin) 4．木犀草素(luteolin) 5．芹菜素(apigenin)
2. 5 标准曲线的制备 精密吸取混合对照品储备
液 0. 1、2、4、6、8、10 mL，分别置 10 mL 量瓶中，加甲
醇稀释至刻度，摇匀，配成系列浓度的混合对照品溶
液。取 20 μL注入液相色谱仪，测定峰面积值，以峰
面积为纵坐标(Y)对对照品浓度(X)绘制标准曲
线，结果见表 1。
2. 6 精密度试验 精密吸取混合对照品溶液 20
μL，按“2. 1”项下色谱条件连续进样 6 次，测定待测
成分峰面积。结果异槲皮苷、桑色素、槲皮素、木犀草
素和芹菜素峰面积的 ＲSD 分别为 0. 97%、0. 55%、
0. 73%、1. 4%、1. 2%，表明仪器精密度良好。
2. 7 稳定性试验 精密吸取同一供试品溶液适量，
室温下放置，0、1、2、4、6、12 h 分别进样 20 μL，按
“2. 1”项下色谱条件测定，考察其稳定性。异槲皮
苷、桑色素、槲皮素、木犀草素和芹菜素峰面积的
ＲSD 分别为 1. 0%、1. 4%、0. 85%、1. 4%、0. 95%，
表明供试品溶液在 12 h内稳定。
—336—药物分析杂志 Chin J Pharm Anal 2014，34(4)
表 1 各黄酮成分的回归方程、相关系数及线性范围
Tab 1 Ｒegression equation，correlation coefficient and linear range of flavonoid component
成分(component)
回归方程
(regression equation)
r
线性范围
(linear range)/μg·mL －1
LOD
/μg·mL －1
LOQ
/μg·mL －1
异槲皮苷(isoquercetin) Y =3. 303 × 104X －1. 843 × 104 0. 9994 1. 00 － 99. 67 0. 048 0. 21
桑色素(morin) Y =3. 394 ×104X －1. 400 ×104 0. 9997 0. 45 － 45. 42 0. 052 0. 35
槲皮素(quercetin) Y =5. 129 ×104X +1. 183 ×104 0. 9996 0. 77 － 76. 57 0. 041 0. 24
木犀草素(luteolin) Y =8. 436 ×104X +1. 159 ×104 0. 9997 0. 43 － 42. 72 0. 038 0. 21
芹菜素(apigenin) Y =6. 784 ×104X +1. 011 ×104 0. 9998 0. 55 － 55. 39 0. 042 0. 24
2. 8 重复性试验 同一批样品，共 6 份，精密称定，
按“2. 3”项下方法制备供试品溶液，按“2. 1”项下色
谱条件进行测定，计算待测成分的含量。样品中异槲
皮苷含量为 2. 375 mg·g －1，ＲSD为 1. 2%;桑色素含
量为 0. 992 mg·g －1，ＲSD 为 1. 7%;槲皮素含量为
2. 248 mg·g －1，ＲSD为 1. 5%;木犀草素含量为 0. 774
mg·g －1，ＲSD为 2. 4%;芹菜素的含量为 0. 662 mg·
g －1，ＲSD为 1. 8%。结果表明，方法重复性良好。
2. 9 加样回收试验 精密吸取混合对照品溶液(异
槲皮苷质量浓度为 1. 24 g·L －1，桑色素质量浓度为
0. 55 g·L －1，槲皮素质量浓度为1. 23 g·L －1，木犀草
素质量浓度为 0. 42 g·L －1，芹菜素质量浓度为 0. 31
g·L －1)1 mL 共 6 份，分别置 100 mL 的具塞三角瓶
中，挥干溶剂，再在每一份中加入已知含量的中华补
血草粉末(过 3号筛)约 0. 5 g，按上述供试品溶液制
备方法和色谱条件操作，计算回收率，结果异槲皮苷、
桑色素、槲皮素、木犀草素和芹菜素平均加样回收率
(n = 6)分别为 98. 9%、98. 6%、98. 6%、97. 8%、
98. 7%，ＲSD为 1. 6%、1. 7%、1. 7%、2. 2%、1. 7%。
2. 10 样品测定 分别取不同产地的中华补血草药
材，按照“2． 3”项下方法制备供试品溶液，按照“2．
1”项下的色谱条件测定异槲皮苷、桑色素、槲皮素、
木犀草素和芹菜素的含量。结果见表 2。
表 2 不同产地中华补血草中槲皮苷、桑色素、
槲皮素、木犀草素和芹菜素的含量(mg·g －1，n =6)
Tab 2 Ｒesults of isoquercetin，morin，quercetin，
luteolin and apigenin in Limonium sinense
(Girard)Kuntze from different places
产地
(source)
异槲皮苷
(isoquercetin)
桑色素
(morin)
槲皮素
(quercetin)
木犀草素
(luteolin)
芹菜素
(apigenin)
大丰(Dafeng) 2. 375 0. 992 2. 248 0. 774 0. 662
东台(Dongtai) 1. 974 0. 641 1. 837 0. 553 0. 785
连云港
(Lianyungang)
1. 830 0. 982 1. 347 0. 398 0. 456
灌云(Guanyun) 1. 863 1. 127 1. 984 0. 675 0. 388
射阳(Sheyang) 1. 392 0. 975 1. 642 0. 534 0. 326
南通(Nantong) 0. 903 0. 595 1. 326 0. 329 0. 493
如东(Ｒudong) 1. 759 0. 784 1. 796 0. 541 0. 615
3 讨论
3. 1 指标性成分的确定 有关中华补血草的文献
报道很少，迄今为止仍未见其化学成分中有桑色素、
木犀草素、芹菜素的报道。笔者在对中华补血草进
行研究时发现了几个黄酮化合物，对其进行了提取、
分离、纯化和波谱解析，证实为桑色素、木犀草素、芹
菜素，这几种化合物为首次在该植物中发现。由于
异槲皮苷、桑色素、槲皮素、木犀草素和芹菜素这几
种黄酮类代表化合物均具有抗癌作用，且在中华补
血草中含量较高，故本文选择对其进行含量测定。
3. 2 提取条件的选择 传统的中药有效成分提
取方法有溶剂浸渍法、超声提取法、加热回流提取法
等，超声提取法和加热回流提取法在中药成分分析
中最为常用。本试验考察了超声提取法和加热回流
提取法 2 种方法在不同提取时间的提取效果，结果
表明加热回流提取法远比超声提取法的效果好。考
察了回流提取 30、60、90、120 min，综合考虑各指标
提取效率，兼顾节约能源等因素，最终选择了加热回
流提取 60 min的提取方法。
3. 3 检测波长的确定 文献报道黄酮类化合物的
常用检测波长为 255、360、370 nm［12 － 15］，利用紫
外 －可见光分光光度计对槲皮素和木犀草素对照品
溶液进行扫描，发现异槲皮苷在 257、358 nm 处，桑
色素在 254、358 nm 处，槲皮素在 255、370 nm 处有
较大紫外吸收，木犀草素在 254、349 nm 处，芹菜素
268、334 nm处有较大紫外吸收，但中华补血草中所
含的挥发油、香豆素［16］、蛋白质［17］、鞣质类［18］成分
对 254 nm处均有干扰，兼顾提高灵敏度和减少杂质
干扰的要求，本文选择了槲皮素与木犀草素均有较
大吸收的 360 nm作为含量测定的检测波长。
3. 4 流动相的选择 中华补血草所含成分复杂，且
分离的 5 个黄酮类成分极性差别小，流动相不合适
易造成出峰时间过长或分离效果不佳。笔者尝试采
用甲醇 －0. 4%磷酸(45∶ 55)、甲醇 － 0. 1% 磷酸(60
∶ 40)等作为流动相等度洗脱，但在分离中华补血草时
效果不佳，用梯度洗脱出峰时间较合适［19 － 20］。后又
—436— 药物分析杂志 Chin J Pharm Anal 2014，34(4)
尝试用加入少量醋酸、磷酸来改善峰形，醋酸因其易
挥发效果不佳，所以本文选择不挥发的磷酸来改善峰
形，而采用 0. 4%磷酸溶液能明显改善拖尾现象。故
本法采用甲醇 － 0. 4%磷酸作为流动相，采用梯度洗
脱，5个成分出峰快，分离完全，峰形也较好。
3. 5 中华补血草不同部位的含量研究 对中华补
血草不同器官中异槲皮苷、桑色素、槲皮素、木犀草
素和芹菜素的含量做了对比研究，结果表明:在植株
的花、叶、茎、根中均含有黄酮成分，其中根的异槲皮
苷、桑色素、槲皮素、木犀草素和芹菜素含量最高，花
次之，再次为叶，含量最少的是茎。
3. 6 不同地区品种的含量测定 不同地区的中华
补血草所含异槲皮苷、桑色素、槲皮素、木犀草素和
芹菜素差异非常大，可能与不同地区各自的生态环
境有关。在选种、育种及中华补血草黄酮类成分利
用时，应充分考虑不同产地的差异。
3. 7 结论 本文建立的方法简便，快速，准确度高，
重复性好。对深入研究中华补血草质量，选种育种，
保存中华补血草野生品种的相关数据资料及植物保
护等方面有重要的意义。关于野生中华补血草其他
成分的含量测定和质量评价正在进一步研究中。
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2010，30(6) :1145
［20］ ZHOU Cui(周萃) ，YANG Yan － yun(杨燕云) ，ZHANG Zhen －
qiu(张振秋) ，et al． HPLC with switching wavelength simultane-
ous determination of seven constituents in licorice and its pro-
cessed products(波长切换 HPLC 法同时测定甘草及其炮制品
中 7个物质的含量) ［J］． Chin J Pharm Anal(药物分析杂志) ，
2011，31(11) :2067
(本文于 2013 年 7 月 29 日收到)
—536—药物分析杂志 Chin J Pharm Anal 2014，34(4)