全 文 ：第 41卷第 4期
2007年 4月
浙　江　大　学　学　报(工学版)
Journal o f Zhejiang Univ ersity(Engineering Science) Vol. 41 No. 4Apr. 2007
收稿日期:2006-01-18. 浙江大学学报(工学版)网址:www . journals. z ju. edu . cn /eng
基金项目:浙江省科技厅重点科研资助项目(2004C21036).
作者简介:吴绵斌(1969- ),男,浙江宁波人 ,副教授 ,从事生物活性物质的发酵与分离研究. E-mai l:w um b@zju. edu. cn
南方红豆杉叶中活性多糖的分离与纯化
吴绵斌 ,郑宝华
(浙江大学 生物工程研究所 , 浙江 杭州 310027)
摘　要:采用水提醇沉方法从南方红豆杉枝叶中得到红豆杉总多糖 ,经 DEAE-Sephar ose FF 阴离子交换色谱分离
得到 3 种酸性多糖 ,分别命名为红豆杉多糖-1(PTM-1)、红豆杉多糖-2(PTM-3)和红豆杉多糖-3(PTM-3), 条件为:
色谱柱先用 pH 值为 8. 5的 HCl-T ris 缓冲液平衡 , 然后用 0. 1 、 0. 3、 0. 5 、0. 7 和 0. 9 mol /L 的 NaCl溶液阶跃洗
脱. PTM-3 进一步采用凝胶过滤色谱纯化 、脱盐和冻干后 , 用高压凝胶渗透色谱 、紫外 、红外和薄层色谱分析其结
构 , 发现 PTM-3 不含蛋白和核酸 , 重均相对分子质量 Mw 为 12. 3 kD , 单糖组成含有 L-阿拉伯糖 、D-半乳糖 、D-葡
萄糖醛酸和 L-鼠李糖 ,以 β-(1 , 3)糖苷键连接.
关键词:多糖;红豆杉;分离;纯化
中图分类号:Q81　　　　　文献标识码:A　　　　　文章编号:1008-973X(2007)04-0696-04
Isolation and purification of bio-active polysaccharides from
leaves of Taxus mairei
WU Mian-bin , ZH ENG Bao-hua
(I nstituteo f Bioengineering , Zhe jiang University , Hangz hou 310027 , China)
Abstract:Crude , bioactive w ater-soluble po ly saccharides w ere isolated f rom the leaves o f Ta xus mairei
using ho t w ater ex t raction followed by ethanol precipi tation. T hree polysaccharides named PTM-1 , PTM-
2 and PTM-3 w ere f ractionated by DEAE-Sepharose FF anion ion-exchange chromatog raph. The column
w as pre-equi librated using HCl-Tris buf fer w ith the pH value being 8. 5 , and w as w ashed w i th de-ionized
w ater fol lowed by successive elution w ith sodium chloride solutions of increasing concentration (0. 1 , 0. 3 ,
0. 5 , 0. 7 and 0. 9 mo l /L) in a stepw ise manner. A fter furthe r purif ied by size exclusion chromatog raph fo l-
lowed by desalted and freeze-dried , PTM-3 w as analyzed w ith gel permeation chromatog raph (GPC), ul-
t ravio le t spect roscopy (UV), inf rared spect roscopy (IR) and thin layer chromatog raph (TLC). The re-
sults indica ted that the PTM-3 is a homogeneous pure poly saccharide w hich is composed of Gal 、GlcVA 、
Rha and A ra wi th β-(1 , 3)-linkages , and that the weight-average molecular weight (Mw) is 12. 3 kD.
Key words:poly saccharides;Taxus mairei;separat ion;purif icat ion
　　目前关于红豆杉抗肿瘤的研究主要集中在紫杉
烷类化合物特别是紫杉醇方面. 提取紫杉醇的主要
原料 ———红豆杉目前主要依靠人工种植 ,而红豆杉
在被提取紫杉醇后基本被废弃 ,既浪费了资源又污
染了环境.红豆杉中除含紫杉醇等小分子活性物质
外 ,最近发现红豆杉枝叶中含有的活性多糖还具有
提高免疫 、保护肝脏等功效 ,对肿瘤也有一定的辅助
治疗作用 ,而目前关于红豆杉多糖的研究还未见有
其他文献报道.
本文通过水提醇沉 ,结合离子交换色谱和凝胶
过滤色谱从红豆杉枝叶中发现 3种不同相对分子质
量的酸性多糖 ,并对其中一种主要的多糖进行了进
一步的分离纯化和结构鉴定 ,为进一步综合利用红
豆杉资源打下坚实的基础.
1　材料与方法
1. 1　材料与仪器
红豆杉粗多糖由本实验室自制 , DEAE-Sepha-
rose FF 、Sephacryl S-300 HR 、Sephadex G-25 为
GE Heal thcare公司产品 ,其他试剂均为分析纯.
UNICO UV /VIS 2802PC 分 光 光 度 计 ,
CHRIS T A LPHA 1-2 D 冷冻干燥机 , Sartorius
PP-20 E全自动电化学分析仪.
1. 2　实验与分析方法
1. 2. 1　实验方法　红豆杉枝叶粉碎至 40 目后 ,经
石油醚脱脂阴干 ,按照 10 mL /g 的比例加入去离子
水 ,于 100 ℃水煮 2 h ,取液体 ,减压蒸馏浓缩 ,加入
乙醇至质量分数为 85%后沉淀 ,得固体 ,重溶 ,过滤
后透析 ,脱色 ,冻干得粗多糖.
将粗多糖溶于去离子水中 ,离心除杂 ,上清液 ,
过 DEAE-Sepharose FF(Ф2. 6 cm ×60 cm)层析柱
分离 ,先用缓冲液冲洗 ,再用 NaCl洗脱 ,部分收集
器收集 ,各管取样 ,硫酸-蒽酮法显色 ,620 nm 处吸
光度检测多糖 ,收集各管的含糖.收集的组分旋蒸浓
缩后 ,过 Sephacry l S-300(Υ1. 6 cm×80 cm)进一步
纯化 ,Sephadex G-25(Υ1. 6 cm ×80 cm)脱盐 , 冻
干 ,用高效液相(HPLC)、紫外 、红外和薄层分析.
1. 2. 2　分析方法　多糖检测:采用硫酸-蒽酮法[ 1] .
NaCl的检测:NaCl浓度根据电导率计算. 在相
同温度下测量不同浓度的高纯度标准 N aCl溶液的
电导率 γ,制作标准曲线. 收集待测溶液 ,稀释至原
浓度的 1 /10 ,测定电导率 ,根据标准曲线计算浓度.
相对分子质量测定:采用高压凝胶渗透色谱
法[ 2]分析.将不同相对分子质量的标准葡聚糖上柱
制取标准曲线 ,根据标准曲线计算相对分子质量.
T LC分析:用 10 mL 安瓿管将 20 mg 精制单
组分多糖溶于 4 mL 去离子水中 ,加入 1 mo l /L 的
三氟乙酸 4 mL. 用酒精喷灯将安瓿瓶封口 , 100 ℃
水解 4 h.水解完毕后打开安瓿瓶 ,将溶液在 40 ℃下
蒸干 ,加乙醇除去三氟乙酸 , 再次蒸干 , 然后加入
1. 0 ～ 2. 0 mL去离子水 ,即可点样.点样后用展开剂
展开 ,喷上显色剂 , 100 ℃下将硅胶板烘干 ,分析结
果[ 1 , 3] .
紫外光谱检测:取精多糖 1. 5 mg ,适量去离子
水溶解 ,进行紫外扫描(波长为 200 ～ 400 nm),去离
子水为对照.
红外光谱检测:取精多糖 1 mg , 与适量干燥
KBr 粉末混合研磨至极细 ,压片后测定[ 1] .
2　结果与讨论
2. 1　多糖的离子交换色谱分离
目前已有较多关于采用离子交换色谱分离生物
多糖的报道[ 3-6] .本文将红豆杉粗多糖溶液用离子交
换色谱进一步分离 , 缓冲液为 pH =8. 5 的 HCl-
Tris ,洗脱剂为 NaCl 溶液 , 阶跃浓度分别为0. 1 、
0. 3 、0. 5 、0. 7和 0. 9 mol /L ,体积流量 qV 为 1 mL /
min ,洗脱液用硫酸-蒽酮法检测多糖.
从图 1中可以发现 0. 1 和 0. 3 mol /L 的 NaCl
溶液进行洗脱的交界处出了很宽的峰 A ,而在0. 5
mol /L的 NaCl溶液洗脱时则出现了一个比较对称
的峰 B.经 HPLC分析 ,峰 A 中含有 2种不同的多
糖.图中 V w 为洗脱体积.
图 1　红豆杉粗多糖离子交换的阶跃洗脱曲线
Fig. 1　Gradient elution curve o f c rude po ly saccharides pu-
rified by DEAE-Spharo se FF
2. 2　PTM-1与 PTM-2的分离
2. 2. 1　pH 值的影响　调节 pH 值 ,洗脱峰 A 可分
为 2 个峰 A 1 和 A 2 , 分别命名为红豆杉多糖-1
(PTM-1)和红豆杉多糖-2(PTM-2). 从图 2中发现 ,
随着 pH 值的增大 , PTM-1和 PTM-2 的出峰时间
及出峰时间间隔都增大 ,2峰峰形变化较小. 这是由
于随 pH 值的增大 ,糖的解离度增大 ,其保留值增
大 ,出峰时间变长.但糖是部分解离的 ,由于其碳链
的长短不同 ,pH 值的影响不同[ 7] ,使得 2 个峰的出
峰时间增加幅度不同. 故可以通过改变 pH 值 ,实现
PTM-1和 PTM-2 的分离. 从图可知 ,在 pH =8. 5
时 PTM-1和 PTM-2已基本分离 ,考虑到多糖在高
pH 时不稳定 ,选择 pH =8. 5为最佳条件.
2. 2. 2　体积流量的影响　图3表明 ,当pH=8. 5时 ,
体积流量增大 ,峰 A1 和 A2 的保留体积与峰形变化
不大 ,洗脱时间大大减少. 当洗脱体积流量大于 4
mL /min时 ,柱压显著升高 , 对操作条件要求较高.考
虑操作条件 ,最佳分离体积流量为4 mL /min.
697第 4 期 吴绵斌 ,等:南方红豆杉叶中活性多糖的分离与纯化
图 2　pH值对红豆杉多糖离子交换分离的影响
F ig . 2 　Effect of pH value on ion-exchange purification of
poly saccharide s fr om leaves o f Ta xus mairei
图 3　体积流量对红豆杉多糖离子交换分离的影响
Fig. 3　Effect of vo lume flow rate on ion-exchange purifica-
tion of po lysaccharides from leaves o f Taxus mairei
2. 3　PTM-3的分析
2. 3. 1　Sephacryl S-300 凝胶过滤 　将粗多糖经
DEAE-Spharo se FF 分离收集 0. 5 mol /L 的 N aCl
溶液的洗脱峰 B ,减压浓缩后上 Sephacryl S-300凝
胶过滤 ,用 0. 1 mol /L 的 NaCl溶液洗脱 ,体积流量
为 1 mL /min ,分离曲线如图 4所示. 初步可以判断
洗脱峰 B是单一多糖.
2. 3. 2　Sephadex G-25凝胶过滤脱盐 　将 Sephacryl
S-300凝胶过滤得到的多糖浓缩后 ,上 Sephadex G-25
柱脱盐 ,流动相为去离子水 ,qV 为 0. 2 mL /min.图 5
表明糖和盐得到有效分离 ,收集该多糖组分 ,冻干 ,命
名为红豆杉多糖-3(PTM-3).
2. 3. 3　紫外光谱分析　将得到的 PTM-3在 180 ～
400 nm 紫外波长范围内进行扫描. 由图 6 可见
PTM-3在 260和 280 nm 波长处均无显著吸收峰 ,
说明样品中无蛋白质(多肽)和核酸类杂质.
2. 3. 4　PTM-3的GPC分析　高效液相图谱(图 7)
表明 PTM-3中不含其他杂质 ,为单一组分多糖 ,以标
准相对分子质量葡聚糖为标样建立 GPC 标准曲线 ,
表明该组分的重均相对分子质量为 12. 3 kD.
2. 3. 5　多糖组成分析　样品水解物与标准单糖的
薄层层析图谱 (图 8)表明 PTM-3中单糖组成含有
L-阿拉伯糖(L-A ra)、D-半乳糖(L-Gal)、D-葡萄糖
醛酸(L-GlcVA)和 L-鼠李糖(L-Rha).
2. 3. 6　红外光谱分析　PTM-3的红外光谱如图 9
所示.结果表明:在 897 cm - 1处的吸收峰表示该糖
的糖苷键为 β构型;1 333和 2 927 cm - 1处的吸收峰
图 4　PTM-3的 Sephacryl S-300洗脱图谱
Fig. 4 　Gel filt ration chromatog raphy o f PTM-3 on
Sephacr yl S-300
图 5　PTM-3 Sephadex G-25 凝胶过滤脱盐图谱
Fig . 5　Desalting of PTM-3 on Sephadex G-25
698 浙　江　大　学　学　报(工学版)　　　　　　　　　　 　第 41 卷　
图 6　PTM-3 紫外吸收图谱
Fig . 6　Ult ravio let spectrum of PTM-3
图 7　PTM-3 高效液相图谱
Fig. 7　Chromatog raphy of PTM-3 on H PLC
图 8　TLC对照图谱
Fig. 8　Thin layer chr omatog r aph of PTM-3
图 9　PTM-3红外光谱
Fig . 9　Infrar ed spec trog ram o f PTM-3
表示该糖糖苷键为 β-(1 , 3)糖苷键;870 cm -1处无特
征峰 ,证明没有甘露糖存在;1 612 cm - 1处的特征峰
表示该糖中存在酰胺基.
3　结　语
采用水提醇沉法提取红豆杉叶中的多糖 , 经
DEA E-Spharose FF 上柱层析 , NaCl阶跃洗脱 ,用
pH 值为8. 5的 HCl-T ris缓冲液洗脱获得3个组分
多糖(命名为 PTM-1 、PTM-2和 PTM-3).收集含有
PTM-3 的峰 , 通过 Sephacryl S-300 凝胶过滤和
Sephadex G-25 脱盐后冻干 , 得到多糖 PTM-3 ,
HPLC 和紫外分析确定其不含蛋白和核酸等杂质 ,
为单一组分多糖 ,重均相对分子质量 12. 3 kD. 经
TLC 分析知 ,其由 L-阿拉伯糖 、D-半乳糖 、D-葡萄糖
醛酸和 L-鼠李糖等单糖组成;红外分析确定单糖间
以 β-(1 , 3)糖苷键为主连接.
参考文献(References):
[ 1] 张惟杰. 糖复合物生化研究技术[ M] . 2 版. 杭州:浙江
大学出版社 , 2003.
[ 2] MAGDALEN L B , ELVIRA L T , S USANA B. Im-
proved size-exclusion high-pe rfo rmance liquid chromato-
gr aphic method fo r the simple analy sis o f g rape juice and
wine poly saccharides [ J] . Journal of Chromatography A ,
1998(823):339-347.
[ 3] 王莹 ,赵毅民 , 张起凤 ,等. 黄芪中一种新葡聚糖的分离
[ J] . 中草药 , 2001 , 32(11):962-964.
WANG Yin , ZH AO Yi-min , ZHANG Qi-feng , et al. I-
solation and str ucture elucidation of novel g lucan form
Astr agalus mongho licus [ J] . Chinese Traditional and
Herbal Drugs , 2001 , 32(11):962-964.
[ 4] 吴亚林 ,黄静 , 潘远江. 无花果多糖的分离 、纯化和鉴定
[ J] . 浙江大学学报:理学版 , 2004 , 31(2):177-179.
WU Ya-lin , HUANG Jing , PAN Yuan-jiang . Isolation ,
purification and identification of po ly saccharide of Ficus
ca rica [ J] . Journal of Zhejiang University:Science Edi-
tion, 2004 , 31(2):177-179.
[ 5] 李志昂 ,李卫旗 , 颜邦干 , 等. 可德兰多糖的分离纯化和
化学结构分析[ J] . 浙江大学学报:农业与生命科学版 ,
2004 , 30(3):326-330.
LI Zhi-ang , LI Wei-qi , YAN Ban-gan , et al. S tudy on
separa tion , purifica tion and chemical str ucture of Curd-
lan poly saccharide [ J] . Journal of Zhejiang University:
Agriculture and Life Science , 2004 , 30(3):326-330.
[ 6] 陈海华 , 许时婴 ,王璋. 亚麻籽胶中酸性多糖和中性多糖
的分离纯化[ J] .食品与发酵工业 , 2004 , 30(1):96-100.
CH EN H ai-hua , XU Shi-ying , WANG Zhang. Separa-
tio n and purifica tion o f acidic po ly saccharides and neutral
polysaccharide s f rom flax seed gum [ J] . Food and Fer-
mentation Industries , 2004 , 30(1):96-100.
[ 7] 丁明玉 ,田松柏. 离子色谱原理与应用[ M] . 北京:清华
大学出版社 , 2001.
699第 4 期 吴绵斌 ,等:南方红豆杉叶中活性多糖的分离与纯化