全 文 ：西北植物学报 , 2011 , 31(2):0291-0297
Acta Bot.Boreal .-Occident.Sin.
文章编号:1000-4025(2011)02-0291-07 ＊
瑞香狼毒根中活性物质的分离鉴定及作用机理
杨甲月1 ,燕志强1 ,徐 蕊1 ,刘 权1 ,金 辉1 ,崔海燕1 ,秦 波1 , 2＊
(1 中国科学院兰州化学物理研究所 中国科学院西北特色植物资源化学重点实验室/甘肃省天然药物重点实验室 ,兰州 730000;
2 兰州大学功能有机分子化学国家重点实验室 ,兰州 730000)
摘 要:以瑞香狼毒根为研究材料 , 模式植物拟南芥为受体 ,采用实验室活体生物实验方法研究了瑞香狼毒根提取
物及不同极性溶剂萃取物对 7 d 龄拟南芥幼苗的生长抑制作用;采用活性跟踪的化合物分离方法 , 分析了其中的活
性化合物成分 ,并通过拟南芥 DR5-GUS 转基因株系 ,研究了单体化合物对拟南芥生长发育及根系生长素分布的影
响.结果显示 , 瑞香狼毒根乙醇提取物对拟南芥有很强的生长抑制作用 , 其乙酸乙酯和氯仿萃取物的抑制活性最为
显著 ,从氯仿萃取物中分离得到两种香豆素类化合物伞形花内酯(1)和西瑞香素(2),其中化合物 1 能够显著抑制
拟南芥幼苗生长及根系发育 ,且明显降低了根部内源生长素的分布水平;化合物 2 也有较为明显的抑制活性.研究
表明 ,氯仿和乙酸乙酯萃取物是瑞香狼毒植物毒活性的主要有效部位;伞形花内酯(1)和西瑞香素(2)是瑞香狼毒
植物毒活性的有效成分 ,化合物 1 对拟南芥生长发育的抑制作用与生长素途径密切相关.
关键词:瑞香狼毒根提取物;拟南芥;生长抑制;香豆素;生长素
中图分类号:Q501;Q945.78 文献标志码:A
Isolation of Plant Growth Inhibitory Components from the Root
of Stellera chamae jasme and Function Mechanism
YANG Jia-yue1 ,YAN Zhi-qiang1 , XU Rui1 , LIU Quan1 , JIN Hui1 ,CUI Hai-yan1 , QIN Bo1 , 2＊
(1 Key Laboratory of Chemist ry of Northw es tern Plan t Resou rces and Key Laboratory for Natural M edicin e of Gansu Province ,
Lanzh ou Ins ti tu te of C hemical Physics , Chinese Academy of Sciences , Lanzh ou 730000 , Chin a;2 State Key Laboratory of Applied
Organic Chemist ry , Lanzh ou Universi ty , Lanzh ou 730000 , Chin a)
Abstract:The inhibi to ry effects of the ro ot ext ract and fractions prepared wi th dif fe rent solv ents f rom
Stel lera chamaejasme on 7-day-old Arabidopsis thaliana seedling s w ere te sted and compared by living-bio-
assay methods.A bioact ivity-driven f ractionat ion w as conducted to analyze the active chemical constituents
of the ro ot ex tract and the effect of the purified compounds on the endogenous auxin lev els w as researched
by A.thal iana DR5-GUS transgenic line.Results show ed that the ethanol ex t ract and i ts chloro fo rm and
e thylacetate f ractions have significant phy to toxic effect .Tw o coumarins umbellife rone (1)and daphno retin
(2)were isolated f rom the chlo roform fraction.Compound 1 signif icant ly inhibited the grow th of A.thali-
ana seedlings and g reat ly reduced the accumulation levels of the endogenous auxin at roo t tips.Compound 2
also show ed inhibitory act ivity .Our research indicated that the chloroform and ethy lacetate ext racts w ere
the main ef fective phy totoxic f ractions of S.chamaejasme .Umbellife rone(1)and daphnoretin(2)were the
ef fective phy to tox ic compounds , and umbelliferones inhibitory effect correlated to auxin pathw ay.
Key words:roo t ex t ract of S tel lera chamaejasme ;Arabidopsis thaliana;g row th inhibition;coumarins;auxin
＊ 收稿日期:2010-10-09;修改稿收到日期:2011-01-05
基金项目:国家自然科学基金面上项目(31070386);甘肃省科技支撑计划-社会发展类项目(1011FKCA128)
作者简介:杨甲月(1974-),男 ,硕士 ,助理研究员,主要从事植物化学成分研究.E-mai l:jyyan g@licp.cas.cn
＊通讯作者:秦 波 ,博士 ,研究员 ,主要从事植物资源化学方面的研究.E-mai l:bqin@licp.cas.cn
瑞香狼毒(Stel lera chamaejasme L.)为瑞香科
狼毒属多年生草本植物 ,广泛分布于中国东北 、华
北 、西南及西北等地区的草地及高山向阳处[ 1] .瑞香
狼毒全株有毒 ,含有丰富的活性化学物质[ 2] ,研究表
明 ,瑞香狼毒在抗肿瘤[ 3] 、抗病毒[ 4] 、抗菌[ 5-7] 以及杀
灭农业害虫[ 8] 方面具有独特的效能.但关于瑞
香狼毒中单体化合物植物毒活性方面的研究尚鲜有
报道.
近年来 ,瑞香狼毒在中国北方局部草原地区大
面积蔓延 ,逐渐取代原有物种 ,形成优势种群 ,致使
优良牧草逐年退化 ,造成草场逆行演替 ,使草地生态
平衡遭受破坏 ,危害草地畜牧业生产[ 1] .瑞香狼毒的
大肆蔓延 ,除了过度放牧以及其本身具有很强的生
态竞争力和适应性[ 1] 外 ,还与其在草地生态中的化
感作用有关.如冯娜等[ 9] 报道瑞香狼毒叶挥发油对
虎尾草 、翅碱蓬 、水稻 、白菜等具有化感作用;周淑清
等[ 10-11]发现瑞香狼毒土壤腐解对苜蓿和红豆草生长
具有抑制作用;王慧等[ 12]也报道了狼毒根中含有抑
制小冠花生长的物质.但关于瑞香狼毒对植物生长
抑制作用的有效成分以及其活性作用机理研究 ,迄
今尚未见有研究报道.本研究以 7 d 龄拟南芥为活
性试验受体 ,测定并比较了瑞香狼毒根提取物及不
同极性溶剂萃取物对拟南芥幼苗生长抑制活性 ,明
确了瑞香狼毒植物毒活性的有效部位;采用活性跟
踪分离方法 ,从其有效分离物中鉴定出 2个香豆素
类化合物 1和 2 ,并研究了 2种化合物对拟南芥幼苗
生长 、根系发育以及内源生长素分布的影响 ,以明确
瑞香狼毒根中植物毒活性物质的化学结构及其活性
作用的方式和途径 ,为深入开展瑞香狼毒化学生态学
及其在植物源除草剂开发方面的研究奠定基础.
1 材料和方法
1.1 植物材料和实验仪器
瑞香狼毒根于 2009年 10月采自甘肃省岷县高
山草甸 ,阴凉处放置至完全干燥.拟南芥 Co l野生型
及 DR5-GUS 转基因株系种子由兰州大学生命科学
学院提供.
实验仪器:1H 和13C-NMR谱在氘代溶剂(DM-
SO-d6)中用 V arian Mercury-400BB超导核磁共振
仪测定 ,以 TM S 为内标.柱层析用硅胶(200 ～ 300
目)由青岛海洋化工厂生产 , 反相硅胶 Rp18 由
Merck公司生产 ,凝胶Sephadex LH-20为 Pharma-
cia F ine Chemical 公司生产 , 薄层色谱用硅胶板
GF254(0.20 ～ 0.25 mm)由青岛海洋化工厂出品 ,
显色剂为 5%硫酸乙醇溶液 ,加热显色 ,所用化学试
剂均为分析纯.
1.2 方 法
1.2.1 化合物分离制备 瑞香狼毒根 5.13 kg 粉
碎后用 95%乙醇室温下冷浸提取 4次(10 L×4),
提取液过滤后合并减压浓缩至体积约 3 L ,浓缩液
依次用石油醚 、氯仿 、乙酸乙酯分别萃取 4次 ,收集
浓缩得到石油醚萃取物77.4 g 、氯仿萃取物89.8 g 、
乙酸乙酯萃取物 417.6 g 和水溶性萃取物 98.5 g.
氯仿萃取物用硅胶柱层析 ,石油醚∶丙酮(0∶1 ～
1∶0)梯度洗脱 , 分为 5 部分(Fr1:12.66 g;Fr2:
20.23 g;Fr3:3.62 g;Fr4:2.56 g ;Fr5:34.13 g),
Fr2经 Sephadex LH-20 、硅胶及反相硅胶柱层析反
复分离纯化.
1.2.2 拟南芥培养 将拟南芥种子置于 4℃冰箱
避光放置 3 d , 用升汞(0.1%氯化汞)表面消毒 7
min ,播于 1/2M S固体培养基上(直径 9 cm 的培养
皿中),置于光照培养箱中培养 ,培养条件为光照度
2 000 lx ,光周期为光 16 h/暗 8 h ,温度为 22℃.
1.2.3 提取物活性测定 分别称取瑞香狼毒根乙
醇提取物及石油醚 、氯仿 、乙酸乙酯 、水相萃取物适
量 ,加入二甲基亚砜(DMSO)溶解 ,制成浓度为 40
g/L 的母液 ,将上述母液于无菌滤膜过滤 ,分别稀释
至 20 、10 、5 g/L ,于24孔板中每孔加入 1/2MS 液体
培养基 990μL 及上述试验样品 4个浓度梯度的液
体各 10 μL(稀释 100倍),于超净工作台上接种 7 d
龄拟南芥(Col)幼苗 ,置于恒温摇床液体培养 7 d
后 ,以滤纸吸净水分 ,电子天平测定拟南芥幼苗全株
鲜重.每处理组各设 4 个重复 ,以相应浓度(1%,预
实验证明为安全浓度)的 DMSO 为对照.恒温摇床
的培养条件为光照周期为光 16 h/暗 8 h , 温度为
22℃,转速 105 r/min.
1.2.4 化合物活性测定 分别称取化合物 1和化
合物 2适量 ,加入 DMSO 溶解 ,制成浓度为 20 g/L
的母液 ,经无菌滤膜过滤后 ,分别稀释至 10 、5 、2.5
g/L .然后在 24孔板中每孔加入 1/2MS 液体培养
基 990μL 及上述试验样品 4个浓度梯度的液体各
10 μL(稀释 100倍),于超净工作台上接种 7 d 龄拟
南芥(Co l)幼苗 ,置于恒温摇床液体培养 7 d 后 ,以
滤纸吸净水分 ,测量拟南芥幼苗整株鲜重.每处理组
各设4个重复 ,以1%的DMSO 为对照.恒温摇床的
培养条件为光照周期为光 16 h/暗 8 h , 温度为
22℃,转速 105 r/min.抑制活性按如下公式评价:
292 西 北 植 物 学 报 31 卷
相对抑制率(%)=对照值-处理值对照值 ×100%
相对抑制率>0 ,表明其有抑制作用 ,且数值越大 ,抑
制效果越明显.
1.2.5 生长素分布检测 拟南芥 DR5-GUS 转基
因株系幼苗的处理同 1.2.3方法 ,收集处理后的幼
苗 ,转入 1.5 mL 微量离心管中 ,丙酮固定 30 min ,
用基础缓冲液[缓冲溶液含有 50 mmol/L 的磷酸盐
缓冲液(pH 7.0), 0.5 mmol/L 的铁氰化钾 , 0.5
mmo l/L 的氰化亚铁 , 10 mmo l/L 的 EDTA Na ,
0.1% Triton-100(V/V)] 冲洗 2 遍 ,将处理好的材
料放入染色液(1 mg X-Gluc/1 mL 基础缓冲液)中 ,
37℃避光染色 3 h ,染色完成后将染色液吸出 ,用无
水乙醇脱色 ,75%乙醇中浸泡 15 m in ,再用含 0.24
mol/L 盐酸的 20%甲醇溶液 37℃下孵育15 min ,随
后用含 7%氢氧化钠(W/V)的乙醇(60% V/V)在
室温下孵育 15 min ,用 40%、20%和 10%(V/V)的
乙醇各处理5 m in ,然后在 5%的乙醇和 25%甘油中
放置 15 min.用 50%甘油压片 ,倒置显微镜下观察
检测 、拍照 ,每处理设 10个重复.
2 结果与分析
2.1 不同瑞香狼毒根提取物对拟南芥生长的影响
2.1.1 鲜重 由表 1可以看出 ,瑞香狼毒根乙醇提
取物具有较强的植物毒活性 ,在 0.05 ～ 0.20 g/L 低
试验浓度区间呈现强-弱-强的抑制效应 ,随着处理
浓度的升高 ,抑制活性明显加强.瑞香狼毒根石油
醚 、氯仿 、乙酸乙酯 、水相 4种萃取物对拟南芥生长
呈不同的作用效果 ,其中氯仿与乙酸乙酯萃取物是
抑制活性最为明显 ,石油醚萃取物呈低促高抑趋势 ,
水相萃取物抑制活性相对较弱.乙酸乙酯萃取物与
对照相比 ,其活性在 0.05 g/L 浓度下已经达到显著
水平 ,随着浓度升高 ,差异越发明显 ,达极显著水平;
氯仿萃取物 0.05 g/L 浓度下与对照差无明显差异 ,
随着浓度升高 ,差异逐渐达到显著或极显著水平;水
相萃取物在部分浓度下与对照间有一定差异 ,但均
未达到极显著水平;石油醚部位与其他部位不同 ,在
0.05 g/L 浓度下 ,其对拟南芥幼苗的生长表现为促
进作用 ,而随着浓度升高 ,又转变为抑制作用 ,且抑
制活性逐渐加强 ,呈现一种低促高抑的作用规律.
2.1.2 相对抑制率 图 1为不同萃取物对拟南芥
幼苗生长的相对抑制率分析结果 ,从中可以看出 ,各
萃取物对拟南芥的相对抑制率与其抑制作用强度一
致.石油醚萃取物在 0.05 g/L 低浓度下 ,其相对抑
制率为-18.73%,表现为促进拟南芥幼苗的生长.
因此 ,乙醇总提取物在 0.05 ～ 0.20 g/L 低试验浓度
区间对拟南芥幼苗的生长出现强-低-强的抑制效应
是由于低极性的石油醚部位造成的.
0.10 g/L 浓度下 ,石油醚 、氯仿 、乙酸乙酯和水
相萃取物的相对抑制率依次为 9.92%、11.42%、
41.82%和 29.53%,即 4部分萃取物都表现为抑制
活性.随着试验浓度增加至 0.20和 0.40 g/L , 4种
萃取物对拟南芥幼苗生长的抑制强度顺序为:乙酸
乙酯萃取物>氯仿萃取物>石油醚萃取物>水相萃
取物.其中 , 0.20 g/L 氯仿萃取物对拟南芥生长的
相对抑制率为 59.93%,是相同浓度下石油醚萃取
物的 2.14倍 ,水相萃取物的 4.35倍.
2.1.3 活性部位及其线性分析 从拟南芥鲜重减
少程度和相对抑制率的分析结果可以发现 ,瑞香狼
毒根提取物对拟南芥的植物毒性主要集中在氯仿和
乙酸乙酯萃取部位.这 2 个萃取部位的浓度与相对
抑制率的线性回归方程分别为 y=0.180 8x+0.113 6
(r=0.958 8), y=0 .244 2x-0.259 6(r=0.902 0).线性
分析的结果表明 ,氯仿和乙酸乙酯萃取物是瑞香狼
毒植物毒活性的主要有效部位 ,其生长抑制作用具
有良好的量效关系.
表 1 瑞香狼毒根乙醇提取物及不同萃取物在不同浓度下对拟南芥鲜重的影响
Table 1 Effect o f the roo t ex tracts of S.chamaej asme on A.thaliana at diffe rent concentra tions
处理
T reatmen t/(g/L)
乙醇提取物
E thanol ex t ract
石油醚萃取物
Pet roleum
ether ext ract
氯仿萃取物
Ch loroform ext ract
乙酸乙酯萃取物
Ethylacetate
ext ract
水相萃取物
Water phase
0 96.15±4.50 a 85.15±2.29 ab 78.23±6.77a 89.25±9.03 a 87.13±2.01 a
0.05 46.90±5.16 bc 101.10±9.43 a 76.75±10.94 a 58.90±8.88 b 77.18±5.16 ab
0.10 58.18±2.47 b 76.70±11.55 bc 69.30±8.71 ab 51.93±7.80 b 61.40±8.40 b
0.20 33.98±6.62 cd 61.30±9.66 bc 31.35±2.80 bc 32.73±9.10 c 75.13±9.71 ab
0.40 25.98±6.95 d 57.00±9.50 c 25.73±5.56 c 11.50±1.74 d 66.48±7.50 ab
注:表中数据为平均值±标准误差 ,平均值为 4次重复的平均值;同列不同小写字母表示同一处理组不同浓度间差异达 0.05水平.下同.
Note:The format of data in the table is mean±SE;Th e dif ferent normal letters af ter the values in the sam e calumn m ean significan t di ff er-
ence at 0.05.The same as below .
2932 期 杨甲月 ,等:瑞香狼毒根中活性物质的分离鉴定及作用机理
图 1 不同浓度瑞香狼毒萃取物对拟南芥幼苗生长的相对抑制率
Fig.1 Inhibition rate of the ex tracts of S .chamae jasme on A.thaliana at five diffe rent concentrations
2.2 瑞香狼毒根活性化合物的分离和结构鉴定
活性试验表明 ,氯仿和乙酸乙酯萃取物是瑞香
狼毒抑制拟南芥生长的主要有效部位(表 1 ,图 1),
因此 ,进一步将氯仿萃取物经硅胶柱层析 、葡聚糖凝
胶以及反相硅胶反复分离纯化 ,得到化合物 1(32.2
mg)和化合物 2(20.0 mg).
化合物 1 在 254 nm 处有亮蓝色荧光.从1H-
NMR中可以看到 5 个芳香质子信号 , δH 6.12(1H ,
d , J =9.2 Hz),7.81(1H ,d , J =9.2 Hz ,H-4),7.42
(1H , d , J =8.4 Hz), 6.73(1H , d , J =8.4 Hz),
6.66(1H , s),其中 2对邻位氢信号.从13C-NMR中 ,
可以看到香豆素特征的羰基碳信号 ,δC160.6(C-2).
通过与文献对照 ,确定其结构为伞形花内酯[ 13](1)
(图 2).
化合物 2 在 254 nm 处也有亮蓝色荧光 ,疑为
香豆素类化合物.在1H-NMR中可以看到 8个芳香
质子信号 ,δH 6.36(1H , d , J =9.2 Hz),8.02(1H , d ,
J =9.2 Hz), 7.69(1H , d , J =8.8 Hz), 7.10(1H ,
d , J =8.8 Hz), 6.84(1H , s), 7.85(1H , s), 7.19
(1H , s), 7.16(1H , s),其中 2对邻位氢信号 ,一个
甲氧基信号δH 3.79(3H , s).化合物2比一般的香豆
素类化合物在骨架上多出 3 ～ 4个质子氢 ,初步推测
为香豆素二聚类化合物.在13 C-NMR中出现了 2个
明显的香豆素特征羰基碳信号δC160.6(C-2),161.
4(C-7)证实我们的推测.参考相关文献 ,确定其结构
为西瑞香素[ 14] (2)(图 2).
其1H-NMR和13C-NM R具体数据如下:
伞形花内酯(1):1H-NMR(400 MHz , DMSO):
δH 6.12(1H , d , J =9.2 Hz , H-3), 7.81(1H , d , J =
9.2 Hz , H-4),7.42(1H ,d , J =8.4 Hz ,H-5),6.73
图 2 化合物 1 和 2 的化学结构
F ig.2 Chemical structures o f compound 1
and compound 2
(1H ,d , J =8.4 Hz , H-6), 6.66(1H , s , H-8);13C-
NMR(100 MHz , DMSO):δC160.6(C-2), 111.4(C-
3),144.4(C-4),129.7(C-5), 113.2(C-6),161.4(C-
7),102.3(C-8),155.6(C-9), 111.3(C-10).
西瑞香素(2):1H-NMR(400 MHz , DMSO):
δH 6.36(1H ,d , J =9.2 Hz , H-3′),8.02(1H , d , J =
9.2 Hz , H-4′), 7.69(1H , d , J =8.8 Hz , H-5′),
7.10(1H ,d , J =8.8 Hz ,H-6′),6.84(1H , s , H-8′),
7.85(1H , s , H-4), 7.19(1H , s , H-5), 7.16(1H , s ,
H-8),3.79(3H , s ,OMe);13C-NMR(100 MHz , DM-
SO):δC160.0(C-2), 135.7(C-3), 130.8(C-4),
109.4(C-5), 145.6(C-6),147.7(C-7),104.0(C-8),
150.3(C-9),114.3(C-10), 159.6(C-2′), 113.4(C-
3′),144.0(C-4′),129.8(C-5′),110.1(C-6′),156.9
(C-7′),102.7(C-8′), 154.9(C-9′), 113.8(C-10′),
56.0(OM e).
294 西 北 植 物 学 报 31 卷
2.3 瑞香狼毒根活性化合物对拟南芥生长的抑制
作用
用不同浓度的伞形花内酯(1)和西瑞香素(2)处
理 7 d龄拟南芥幼苗 ,伞形花内酯(1)抑制作用极其
显著 ,西瑞香素(2)抑制活性也比较明显(表 2 、图
3).在 0.025和 0.050 g/L低浓度下 ,伞形花内酯(1)
已经造成拟南芥幼苗根部和部分叶片变黄(图 3 ,A),
而在 0.100和 0.200 g/L 浓度下 ,甚至导致幼苗死亡
(图 3 , A).西瑞香素(2)在各浓度下对拟南芥幼
苗的正常生长无明显影响(图3 , A).在相对抑制率
图 3 不同浓度化合物 1 和 2对拟南芥生长的抑制作用
A.化合物 1和 2处理后 1周后拟南芥幼苗的表型,标尺为 1 cm;B.不同浓度化合物 1和 2对拟南芥幼苗生长的相对抑制率
Fig.3 Inhibition effects of compounds 1 and 2 on A.thaliana at different concentrations
A.Phaenotypes of A.thal iana seedlings treated by compounds 1 and 2 for one week.Bar=1 cm;
B.The inhibi tion rate of compounds 1 and 2 on A.thaliana at diff erent concentrations
图 4 化合物 1 和 2处理后 DR5-GUS转基因拟南芥幼苗的 GUS 染色结果
A.生长素在主根根尖的分布;B.侧根及侧根原基的生长发育和生长素的分布情况;LRP.侧根原基;LR.侧根
Fig.4 GUS staining of DR5-GUS seedlings after treated by compounds 1 and 2
A.Auxin distribution in primary root tip;B.Lateral root and lateral root primodia development
and auxin dist ribution;LRP.Lateral root primodia;LR.Lateral root
2952 期 杨甲月 ,等:瑞香狼毒根中活性物质的分离鉴定及作用机理
表 2 伞形花内酯和西瑞香素在不同浓度下对拟南芥鲜重的影响
Table 2 Effect of the compound 1 and compound 2 on A.thaliana at different concentrations
处理
Treament
浓度 Concent ration/(g/L)
0 0.025 0.050 0.100 0.200
伞形花内酯(1)Umbelliferone(1) 55.35±4.37 a 26.15±7.96 b 10.68±1.20 c 1.53±0.46 c 0.49±7.23 c
西瑞香素(2)Daphnoretin(2) 70.63±5.35 a 51.63±2.21 b 46.68±3.11 b 56.28±4.60 ab 60.18±7.23 ab
方面 ,浓度分别为 0.025 、0.050 、0.100 、0.200 g/L
时 ,伞形花内酯(1)为 52.76%、80.71%、97.24%、
99.11%(图 3 , B), 而西瑞香素(2)为 26.91%、
33.92%、20.32%、14.80%(图 3 ,B).以上数据说明
伞形花内酯(1)强烈抑制拟南芥幼苗生长 ,且在高浓
度下导致幼苗死亡;而西瑞香素(2)抑制活性相对于
伞形花内酯(1)不甚显著 ,但也有一定抑制作用.
2.4 瑞香狼毒根活性化合物对拟南芥幼苗根形态
及生长素分布的影响
人工构建的能够对生长素响应的报告基因
DR5-GUS ,其表达部位和分布可以用来检测植物地
上和地下部分生长素流向的动态变化[ 15] .以带有
DR5-GUS 报告基因的拟南芥为材料 ,通过 GUS 染
色 ,观察化合物处理后幼苗根尖生长素的分布变化
情况.结果显示 ,当用伞形花内酯(1)处理 12 ～ 24 h
后 ,根尖生长素含量显著降低 ,在处理 7 h 后在主根
和侧根中几乎检测不到 GUS 的染色 ,说明伞形花
内酯(1)可能加速了生长素的分解或阻断生长素的
合成 ,也有可能是影响了生长素的极性运输;同时 ,
经化合物 1处理后拟南芥幼苗主根(图 4 , A)和侧根
(图 4 ,B)的根尖畸变膨大 ,侧根原基突起变成了瘤
状(图 4 ,B).化合物 2处理后 ,拟南芥幼苗主根和侧
根的根尖都可以观察到和对照相似的 GUS 染色效
果 ,说明化合物 2对生长素合成分解以及极性运输
无明显的影响.这与上述活性检测结果相一致 ,伞形
花内酯(1)通过改变拟南芥根中的生长素的分布 ,从
而强烈抑制幼苗的生长发育;而西瑞香素(2)对生长
素的积累影响不明显 ,其对拟南芥幼苗的生长发育
的影响也不如伞形花内酯(1)明显.
3 讨 论
香豆素类化合物是一类重要的植物次生代谢产
物 ,具有抗菌 、防紫外线损伤等多种生物功能 ,能够
抑制植物种子的发芽 ,可作为调节昆虫 、共生菌 、病
原菌与植物互作反应的信号分子 ,控制植物的生长
过程 ,调节植物的生长活动[ 16-17] .
生长素(IAA)作为一种重要的植物内源激素 ,
参与了从胚胎发育 、原基形成到果实成熟等植物发
育的诸多过程[ 18] .内源生长素的合成 、运输以及分
解 ,关系到植物的多种生理反应 ,如根和茎的生长发
育 ,细胞分裂 、分化和扩大 ,器官的衰老 ,以及植物的
向地和向光反应等[ 15] .吲哚乙酸氧化酶(IAAO)是
生长素分解代谢的关键酶 ,能降解 IAA ,调节植物
体内的 IAA 水平[ 19] .IAAO 是含铁的血红蛋白 ,它
需要 2个辅助因子 ,即 Mn2+和酚.IAAO 的活性能
够被一些一元酚(如 2 , 4-二氯苯酚 、阿魏酸等)加
速 ,同时受一些二元酚(如:绿原酸 、儿茶酚等)的抑
制[ 1 7] .
同为香豆素类化合物 ,化合物 1能够显著抑制
拟南芥幼苗生长 ,而化合物的抑制活性相对较弱 ,根
据 2种化合物的结构特点 ,我们推测这种差异与其
对 IAAO 的活性影响有关.化合物 1 为一元酚类化
合物 ,可以增强 IAAO 的活性 ,从而加速生长素的
分解 ,改变生长素在拟南芥根中的分布 ,明显地抑制
拟南芥的生长;化合物 2 结构中虽然也存在酚羟基
活性基团 ,但它是由 2个香豆素通过氧桥连接 ,在水
溶液中醚键容易断裂离解为 1个含有 2个羟基的香
豆素和化合物 1 , 从而部分抵消了一元酚促进
IAAO的活性 ,进而减缓生长素的分解 ,可以在一定
程度上减少生长素在根中的含量 ,对拟南芥的生长
有一定的抑制作用.
瑞香狼毒作为草原主要有毒植物之一 ,近年来
在中国北方草地局部地区大面积蔓延 ,导致草场退
化 ,危害畜牧业生产[ 1] .瑞香狼毒对草地生态系统的
影响及其防除措施方面的研究备受关注[ 20-21] ,而关
于瑞香狼毒化学生态学方面的研究工作报道较少.
前人的研究已表明瑞香狼毒挥发油 、腐解物等对一
些受体植物的种子萌发以及幼苗的生长发育具有明
显的抑制作用[ 9-12] .本研究在此基础上 ,进一步明确
了瑞香狼毒植物毒活性作用的有效部位及活性成分
的化学结构.我们推测 ,瑞香狼毒体内产生的香豆素
类等具有植物毒活性的次生代谢物 ,能够释放到周
围土壤中 ,通过对生长素等植物生长发育因子的调
节 ,对其生境周围其他植物的生长发育产生抑制作
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用 ,从而提高了自身的环境适应性和在草场植物种
群的竞争力 ,进而在草地上大面积蔓延 ,导致草地植
物群落逆向演替 ,造成了草地生态系统的不断恶化.
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