全 文 ：收稿日期:2008-06-12;　修订日期:2009-01-15
基金项目:河北省张家口市科技局资助项目(No.041129)
作者简介:邢立强(1965-),男(汉族),河北安新人 ,现任河北北方学院实
验中心教授 ,硕士学位 ,主要从事肿瘤生物学研究工作.
瑞香狼毒水提取物对人肺鳞状细胞癌
Survivin表达的影响
邢立强1 ,赵建清 2 ,李　旺 1 ,孙 　黎1
(1.河北北方学院实验中心 ,河北 张家口　075029;　2.河北北方学院附属第一医院 ,河北 张家口　075029)
摘要:目的 研究瑞香狼毒水提取物对人肺鳞状细胞癌 NCI-H520细胞株的抑制作用及对 Survivin表达的影响。方法
用不同浓度的瑞香狼毒水提取物处理 NCI-H520细胞 ,分别用 MTT法检测肺癌细胞抑制率 、半定量 RT-PCR检测 Sur-
vivinmRNA水平以及用 Western-bloting检测蛋白水平的表达。结果 瑞香狼毒水提取物可显著抑制 NCI-H520细胞的
生长 , 随着药物浓度的升高抑制作用逐渐增强。瑞香狼毒作用 4 h后细胞内 Survivin蛋白的表达水平降低 , 而 Survivin
mRNA的表达变化不明显。结论 ①瑞香狼毒水提取物可抑制 NCI-H520细胞的生长 ,并具有浓度和时间依赖性;②瑞
香狼毒水提取物可降低 NCI-H520细胞的 Survivin蛋白表达水平 , 而对 mRNA水平无明显影响。
关键词:瑞香狼毒水提取物;　NCI-H520细胞株;　生存素
中图分类号:R285.5　　文献标识码:B　　文章编号:1008-0805(2009)09-2185-01
　　肺癌是当今世界危害人类生命健康最常见的恶性肿瘤之一 ,
发病率呈逐年上升趋势。在发达国家 , 肺癌居恶性肿瘤发病率及
死亡率的第一位 [ 1] , 在肺癌病例中非小细胞肺癌(主要有鳞状细
胞癌 、腺癌 、大细胞癌)占 80%左右。近年来有报道 Survivin在非
小细胞肺癌的表达可引起对化疗药物的耐受 ,进而影响病人的化
疗效果。本研究应用中药瑞香狼毒水提取物作用于人肺鳞状细
胞癌细胞株 NCI-H520, 探讨瑞香狼毒对 NCI-H520生物学行
为的影响 , 旨在为中西药结合治疗人肺鳞状细胞癌 , 提高患者对
化疗药物的敏感性及改善临床治疗效果提供依据。
1　材料和方法
1.1　人肺鳞状细胞癌细胞株 人肺鳞状细胞癌细胞株 NCI-
H520购自中国医学科学院基础医学研究所细胞中心。
1.2　 药品与试剂 Survivin鼠单抗(SantaCruz公司产品)、β -
actin鼠单抗(美国 Sigma公司产品)、过氧化物酶标记的羊抗兔
二抗 、过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗购自北京中杉金桥生物公
司;BCA蛋白定量试剂盒 、WesternBlotECL显影试剂盒购自武汉
博士德公司;医用感光胶片为中国 Lucky公司产品;Trizol试剂和
RT-PCR试剂盒均为 Invitrogen公司产品;瑞香狼毒采自河北北
部 , 提取前经中药专家鉴定确认 , 水提取物终浓度为 5g/ml生药。
1.3　细胞培养 将 NCI-H520细胞复苏后接种至培养瓶。加含
有 10%胎牛血清和双抗的 RPMI1640培养基 5ml, 瓶盖微松 ,放
置 37℃, 5%CO2及饱和湿度的细胞培养箱中 , 细胞培养至对数
生长期。消化 、计数 ,调整细胞浓度至 5×104个 /ml, 将其接种至
96孔培养板中。
1.4　MTT法检测 NCI-H520细胞抑制率 将细胞接种至 96孔
板 , 每孔 100μl;置 CO2培养箱中继续培养 24 h后 , 于 96孔板中
依次加入不同浓度的瑞香狼毒水提取物(5, 0.5, 0.05 g/ml)每一
浓度设 4个复孔 , 另设空白组和对照组。继续培养 4, 8, 12, 24 h
后每孔加入 MTT试剂 30 μl混匀 , 置 CO2培养箱中继续培养 4 h
后弃上清 , 每孔加二甲基亚砜 100 μl, 10 min后用酶标仪在 492
nm发射波长下读数 ,计算细胞抑制率。抑制率的计算:抑制率 =
1-(OD处理组 -OD空白组 / OD对照组 -OD空白组)。
1.5　逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)Trizol一步法提取不同
浓度瑞香狼毒水提取物作用不同时间的细胞总 RNA, 取 1μg总
RNA用 RT-PCR试剂盒进行逆转录 , PCR扩增 Survivin, 同时扩
增 β -actin作为内参。引物由大连宝生物工程公司合成 , Sur-
vivin引物序列为 F:5-CCCTGCCTGGCAGCCCTTTC-3R:5-
CTGGCTCCCAGCCTTCCA-3所扩增片段为 188 bp。 β -actin引
物序列为 F:5-GGGAAATCGTGCGTGACATT-3R:-CG-
GACTCGTCATACTCCTGCTTG-3所扩增片断大小为 512 bp。 产
物经 2%的琼脂糖凝胶检测 , 紫外灯下观察并拍照。
1.6　Western-blotting检测 Survivin蛋白的表达 收集与药物作
用不同时间的细胞 ,裂解后用 BCA蛋白定量试剂盒测定各组的
总蛋白浓度 ,各组取总蛋白 80 μg经 15%SDS-PAGE凝胶电泳
分离后转移至 PVDF膜上 ,然后用含 2%脱脂奶粉的 TBS缓冲液
室温封闭 1 h, 洗膜后加入 Survivin鼠单抗 4℃孵育过夜。再洗
膜 , 加过氧化物酶标记的羊抗兔二抗室温孵育 1 h, 洗膜后 ECL
显影试剂 ,暗室曝光。膜经 Stripping缓冲液处理后重新封闭 , 用
β -actin单克隆抗体进行杂交 ,过程同上。用灰度扫描仪扫描各
组条带 ,将各组两种蛋白的表达量相比 , 得出 Survivin的相对表
达量 , 并以对照组的相对量为 1,其它相对量与其相比 , 得出各组
的比值 。
2　结果
2.1　瑞香狼毒对 NCI-H520细胞的生长抑制作用 用 MTT法检
测瑞香狼毒水提取物处理 4, 8, 12, 24 h后的各组细胞毒性分析
结果显示 , 瑞香狼毒对该细胞株有明显的生长抑制作用 , 浓度越
高作用时间越长抑制作用越明显。
2.2　瑞香狼毒对 NCI-H520细胞株 SurvivinmRNA表达的影响
将 NCI-H520细胞株用不同浓度的瑞香狼毒处理 4, 8, 12, 24 h
后 , 按 Trizol试剂盒说明提取总 RNA, 然后用反转录试剂盒把
mRNA转录成 cDNA, 用 Survivin和 β -actin的引物对各样品的
cDNA进行扩增 , 扩增完毕后用 2%的琼脂糖凝胶电泳检测 ,结果
表明 Survivin的表达在 mRNA水平上无明显改变。
2.3　瑞香狼毒对 NCI-H520细胞株 Survivin蛋白水平表达的影
响 将 NCI-H520细胞经瑞香狼毒提取液处理 4, 8, 12, 24 h后 ,
用 Western-blotting检测 Survivin和 β -actin蛋白的表达 , 经灰
度扫描 ,将各组两种蛋白的表达量相比 , 得出 Survivin的相对表
达量 , 并以对照组的相对量为 1。其它相对量与之相比 , 得出各
组的相对比值 ,结果显示 , Survivin蛋白的表达量在 4 h的时候已
经开始下降 ,在 8 ～ 24 h时进一步降低 , 而未经药物处理的对照
组细胞 Survivin蛋白的表达量变化不大。
3　讨论
瑞香狼毒作为中草药应用已有悠久历史 , 《中国药典》记载
其性味苦 、平 、辛 、有毒 , 入肝 、肺 、脾三经 ,有逐水 、祛痰 、破积 、杀
虫之功效 [ 2] , 并发现其具有明显的抗肿瘤作用。目前由于恶性
肿瘤化疗中常用化疗药物的剧烈毒副作用和获得性耐药的出现 ,
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LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH 2009VOL.20NO.9 时珍国医国药 2009年第 20卷第 9期
严重影响了化疗效果。近年来 , 中药抗肿瘤逐渐引起人们的重
视。国内外学者对瑞香狼毒的抗肿瘤作用进行了大量研究。如
对肝癌 、肺癌 、食管癌 、宫颈癌 、肉瘤 、白血病细胞等 [ 3 ～ 5]恶性肿瘤
方面影响的研究均有涉足。现有研究多侧重于瑞香狼毒提取物
对不同类型肿瘤细胞的抑制率和瑞香狼毒抗肿瘤成分等方面。
对瑞香狼毒水提取物抗肿瘤机理的研究较少。
Survivin是新发现的凋亡抑制蛋白家族(inhibitorofapoptosis
proteinfamily, IAPfamily)中的新成员 , 与细胞分裂 、增殖等功能
密切相关。 Survivin在胚胎组织和大多数肿瘤组织中高表达 ,而
在正常的终末分化组织和癌旁组织沉默 [ 6] , 提示此蛋白可能与
肿瘤的发生有密切关系。Survivin的过表达几乎出现在所有早期
非小细胞肺癌病人 , 因此 , Survivin的过表达可作为肺癌早期诊
断的一个参考性指标 , 具有早期诊断价值 [ 7] 。 Survivin的表达状
况与患者的年龄 、性别 、病理组织学之间无关 , 而与分期有关 ,分
期越晚其阳性率越高 [ 8] , 又可作为判断肺癌病人预后的指标 [ 9] 。
研究还表明 , 单独封闭 Survivin基因可充分介导细胞凋亡 , 具有
较好的靶向特异性 , 有望成为抗肿瘤治疗的一个新途径。
非小细胞肺癌包括腺癌 、鳞状细胞癌 、大细胞未分化癌等类
型 , 约占肺癌患者总数的 80%。本研究选择人肺鳞状细胞癌 NCI
-H520细胞株 , 探讨给予瑞香狼毒处理后细胞的生长抑制及凋
亡抑制蛋白 Survivin的表达及其 mRNA转录水平。结果显示:瑞
香狼毒水提取物对 NCI-H520细胞株具有明显的抑制作用。这
与我们以往的研究结果一致 [ 10] , 也为许多学者的研究所证实。
研究结果还发现瑞香狼毒水提取物对 Survivin的表达具有明显
抑制作用 , 并具有浓度和时间依赖性。 而 SurvivinmRNA的转录
水平变化不明显。由此可见 , 瑞香狼毒对肺癌细胞 NCI-H520
的抑制作用一部分可能是通过抑制凋亡抑制蛋白 Survivin的表
达而实现的。 SurvivinmRNA的转录水平变化不明显说明瑞香狼
毒抑制 Survivin的表达不是通过影响 Survivin基因的从头合成产
生的。只是特异性地作用于 Survivin的转录后调节或翻译过程
而抑制 Survivin的表达水平。可能肿瘤组织中的某些基因或其
表达产物对 Survivin的表达起到开关作用。如果找到 Survivin表
达的控制机制将为提高肺癌的化疗效果起到重要的推动作用。
本研究证实瑞香狼毒提取物可抑制凋亡抑制蛋白 Survivin的表
达 , 它或许对临床某些耐药病例的化疗起到增效作用 ,将为中西
药治疗肺癌开辟新的治疗途径。由于肺癌耐药机制非常复杂 , 具
体对哪些病例和哪些治疗方案起到增效作用还有待进一步证实。
综上所述 ,瑞香狼毒可通过抑制肺癌细胞中 Survivin的表达
诱导细胞的凋亡 ,而这种表达的抑制不是通过影响 Survivin基因
的从头合成产生的。可能是作用于 Survivin的转录后调节或翻
译过程而抑制 Survivin的表达水平。 Survivin作为抑制凋亡蛋白
家族成员其与肺癌细胞的耐药有密切关系。因此 ,本结果提示瑞
香狼毒降低 Survivin的表达 ,可能对肺癌细胞的耐药具有抑制作
用。可增加肺癌对化疗药物作用的敏感性 ,增强肺癌化疗效果。
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收稿日期:2008-10-11;　修订日期:2008-12-29
基金项目:辽宁省教育厅科研课题(No.2008T121)
作者简介:李正言(1982-),女(满族),辽宁丹东人 ,现任辽宁中医药大学
药学院在读硕士研究生 ,学士学位 ,主要从事中药鉴定与质量控制工作.
＊通讯作者简介:翟延君(1956-), 女(满族),辽宁本溪人 , 现任辽宁中医
药大学药学院教授 ,博士学位 , 主要从事中药鉴定与质量评价教科研工
作.
不同商品柘木中槲皮素和山萘酚的含量测定
李正言 ,翟延君＊ ,滕　宇 ,伍伟超
(辽宁中医药大学药学院 ,辽宁 大连　116600)
摘要:目的 测定柘木药材中双指标成分槲皮素与山萘酚的含量 , 为柘木商品药材的质量控制提供方法 。方法 采
用高效液相色谱法 , 以槲皮素和山萘酚为指标 , 对购自广西不同商品柘木药材进行含量测定。 结果 不同商品柘木
中槲皮素和山萘酚的含量有显著差异。 结论 实验方法简便 、快速 、准确 , 可为鉴定柘木的药用部位和控制柘木药
材的质量提供参考。
关键词:柘木;　槲皮素;　山柰酚;　高效液相色谱法
中图分类号:R284.2　　文献标识码:B　　文章编号:1008-0805(2009)09-2186-02
　　柘木为桑科植物柘树 Cudraniatricuspidata(Carr.)Bur.的干
燥根及木材 [ 1] 。柘木始载于《本草拾遗》, 1977年版 《中国药典》
曾将柘树的根收载于穿破石项下 [ 2] , 是我国传统的中药材。 柘
树广泛分布于我国的华南 、华东 、西南以及河北以南地区。民间
多用柘木的水煎液治疗消化系统的癌症 [ 3] , 能明显改善病人生
活质量 ,延长生存期。柘木糖浆作为消化系统癌症治疗中的辅助
治疗药物具有较好的临床疗效。文献报道柘木中含有黄酮 、生物
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时珍国医国药 2009年第 20卷第 9期 LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH 2009VOL.20NO.9