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西伯利亚杏SRAP-PCR反应体系的优化研究



全 文 :2014年
第 4 期
2014
№4
辽 宁 林 业 科 技
Journal of Liaoning Forestry Science& Technology
西伯利亚杏分布范围广,多处于野生、半野生
状态,由于具有自交不亲合的特性,种间杂交现象
普遍,形态及产量性状等差异较大,种质资源异常
丰富。这一方面为良种选育提供了物质基础,但另
一方面也给种质资源的识别、鉴定增加了难度,采
取常规的形态学方法有时不能取得准确的结果。
相关序列扩增多态性(SRAP)是一种新型的基
于PCR的标记系统,为显性标记,由美国加州大学
蔬菜系Li与Quiros博士于 2001年从芸薹属作物开
发出来。由于具有简便、高效、产率高、高共显性、
重复性好、易测序、便于克隆目标片段的特点,与其
它的标记技术相比,SRAP具有很大的优势。目前
已成功地应用于作物遗传多样性分析、遗传图谱的
构建、重要性状的标记以及相关基因的克隆等方
面[1]。国内有关SRAP反应条件的优化研究,多采用
单因素试验的方法,忽视各因素之间相互作用的效
应。本实验拟采用正交试验设计[2]的方法,以 28号
西伯利亚杏无性系为材料,针对Mg2+、dNTPs、引物、
Taq DNA 聚合酶和模板DNA 5个影响因素分别设
置 4个浓度水平进行体系优化,旨在建立适合于西
伯利亚杏SRAP-PCR反应体系,为深入研究种质资
源提供技术基础。
1 试验材料和方法
1.1 试验材料
辽宁省北票市林木良种繁育中心的山杏种质
资源圃,东经120°18,北纬42°28,收集了不同种源
的初选丰产、抗冻、抗旱、晚花等无性系及形态变异
类型无性系 200多个。28号西伯利亚杏无性系树
收稿日期:2014-05-20
基金项目:国家林业公益性行业科研专项(201004034);中央财政林业科技推广示范资金项目([2010]02)。
*通讯作者
西伯利亚杏SRAP-PCR反应体系的优化研究
李 爽,董胜君,吴月亮,余海滨,刘明国*
(沈阳农业大学 林学院,辽宁 沈阳 110161)
摘 要:以西伯利亚杏为试验材料,进行基因组DNA的提取、扩增及电泳试验。通过L16(45)正交试
验,确定西伯利亚杏 SRAP-PCR优化反应体系 (反应体系总体积 20 μL):Mg2+ 2.0 mmol·L-1、dNTPs
0.25 mmol·L-1、引物浓度1.2 μmol·L-1、Taq聚合酶1.0 U、DNA模板20 ng。采用SRAP引物组合ME5/
EM10,对优化的SRAP-PCR反应体系进行初步验证,24个西伯利亚杏无性系SRAP分子标记试验
共扩增出谱带431条,引物扩增出23条谱带,其中338条为多态性谱带,多态百分率为78.42%。
关键词:西伯利亚杏;SRAP-PCR反应体系;优化
中图分类号:S662.2 文献标识码:A 文章编号:1001-1714(2014)04-0009-03
Optimization of SRAP-PCR system with orthogonal design in Prunus sibirica
LI Shuang,DONG Sheng-jun,WU Yue-liang,YU Hai-bin,LIU Ming-guo*
(College of Forest,ShenyangAgriculturalUniversity,Shenyang110161,China)
Abstract:With Prunus sibirica,genomic DNA extraction,amplification and electrophoresis tests were conducted. The optimal reaction
system(20 μL)of SRAP markers were as follows: 2.0 mmol·L-1 of Mg2+,0.25 mmol·L-1 of dNTPs,1.2μmol·L-1 of primer,1.0U of Taq
DNApolymerase,20.0 ng of DNA template. Using primer combination ME5/EM10,preliminary verification of the optimal SRAP-PCR
systemwas carried,24Prunus sibirica clones from different provenances as samples,431 loci were amplified,and a couple of primer am⁃
plified 23 loci. 338 loci were polymorphic,accounting for 78.42% of the total loci.
Key Words:Prunus sibirica;SRAP-PCR;optimization
—— 9
龄10 a,来源于内蒙敖汉旗木头营子林场南一区;以
来源于辽宁喀左县、朝阳县、北票市、内蒙敖汉旗、
扎兰屯市和俄罗斯的 24个西伯利亚杏无性系验证
开发的西伯利亚杏 SRAP-PCR反应体系,见表 1。
2013年 6月中旬进行取样,选取树冠向阳面中部 1
年生嫩枝。
1.2 DNA提取及检测
采用改良的CTAB法[3]从西伯利亚杏的嫩叶中
提取总DNA。用 1%的琼脂糖电泳检测DNA纯度,
再用紫外分光光度计检测DNA 含量,而后加TE缓
冲液将DNA稀释到50 ng·L-1,置于-20 ℃保存。
1.3 SRAP-PCR体系的正交设计
影响 SRAP-PCR扩增体系的因素主要有Mg2+、
dNTPs、引物、Taq DNA 聚合酶和模板DNA,选用L16
(45)正交试验设计,扩增体系20 μL,具体见表2。
1.4 SRAP-PCR扩增程序
随机选用引物对ME5/EM10进行 PCR扩增试
验。SRAP-PCR扩增程序为 94 ℃初始变性 5 min;
94 ℃变性30 s,35 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,共5
个循环;94 ℃变性 30 s,35 ℃退火 30 s,72 ℃延伸 1
min,共35个循环;72 ℃最后延伸10 min;4 ℃保存。
1.5 聚丙烯酰胺凝胶电泳
用所得 SRAP-PCR扩增产物进行聚丙烯酰胺
凝胶电泳试验,经过固定、染色、漂洗、显影,得到最
终产物。重复2次。将得到的凝胶置于灯箱上观察
记录,拍照存档。
1.6 SRAP-PCR优化体系的验证
用所得优化的SRAP-PCR反应体系,选用引物
对ME5/EM10对24个西伯利亚杏无性系进行扩增,
以验证所得到优化体系的效果。
2 结果与分析
2.1 DNA提取
采用改良的CTAB法提取总DNA,经1%琼脂糖
凝胶电泳检测。从图1可以看出,电泳谱带清晰、完
整,无拖尾现象,说明提取的DNA质量很好,经紫外
分光光度检测后A260/A280的比值在 1.75~1.97,完全
满足 SRAP分子标记的要求,可用于 SRAP-PCR扩
增反应。
2.2 SRAP-PCR反应体系的优化
从图 2可以看出,西伯利亚杏 16个 SRAP-PCR
扩增体系产生条带普遍较强,所有反应体系均能扩
增出条带,且条带清晰、对比明显。第 11、12、16反
应体系扩增出的条带少且集中在上部。对比各体
辽 宁 林 业 科 技第 4期 2014年
表1 验证材料
编号
1
6
10
25
33
37
39
41
46
53
62
81
收集时间
2004
2004
2004
2004
2004
2004
2004
2004
2004
2004
2004
2004
种质来源
辽宁喀左县老爷庙乡平方子村
辽宁喀左县草场乡郭彩店村
辽宁喀左县草场乡东汤村
内蒙古敖汉旗木头营子林场南一区
内蒙古敖汉旗木头营子林场南四区
内蒙古敖汉旗木头营子林场北二区
内蒙古敖汉旗萨立坝乡黄花甸子村
辽宁朝阳县台子乡郭杖子村
辽宁朝阳县台子乡郭杖子村
辽宁北票市林木良种繁育中心
辽宁北票市林木良种繁育中心
辽宁北票市林木良种繁育中心
编号
322
328
381
334
353
358
94
501
511
513
516
517
收集时间
2012
2012
2012
2012
2012
2012
2004
2012
2012
2012
2012
2012
种质来源
内蒙扎兰屯市大河湾镇金星村
内蒙扎兰屯市大河湾镇金星村
内蒙扎兰屯市大河湾镇金星村
内蒙扎兰屯市洼堤乡孤山村
内蒙扎兰屯市洼堤乡孤山村
内蒙扎兰屯市洼堤乡孤山村
俄罗斯季米里亚泽夫农学院
俄罗斯后贝加尔边疆区卡尔NM斯卡亚镇
俄罗斯后贝加尔边疆区布里亚特阿根斯克民族区
俄罗斯后贝加尔边疆区布里亚特阿根斯克民族区
俄罗斯后贝加尔边疆区布里亚特阿根斯克民族区
俄罗斯后贝加尔边疆区布里亚特阿根斯克民族区
表2 山杏SRAP-PCR 反应L16(45)正交设计
编号
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
Mg2+
/mmol·L-1
1.5
1.5
1.5
1.5
2.0
2.0
2.0
2.0
2.5
2.5
2.5
2.5
3.0
3.0
3.0
3.0
dNTPs
/mmol·L-1
0.15
0.20
0.25
0.30
0.15
0.20
0.25
0.30
0.15
0.20
0.25
0.30
0.15
0.20
0.25
0.30
引物
/μmol·L-1
0.3
0.6
0.9
1.2
0.6
0.3
1.2
0.9
0.9
1.2
0.3
0.6
1.2
0.9
0.6
0.3
Taq
/U
1.0
1.5
2.0
2.5
2.0
2.5
1.0
1.5
2.5
2.0
1.5
1.0
1.5
1.0
2.5
2.0
模板
/ng
10
20
40
80
80
40
20
10
20
10
80
40
40
80
10
20
—— 10
李 爽等:西伯利亚杏SRAP-PCR反应体系的优化研究第 4期 2014年
系条带效果可以看出,扩增片段长度大多数集中在
100~2 000 bp,且条带与背景对比清晰,分布均匀,
无弥散现象。
综合分析所有反应体系,考虑到Taq DNA聚合
酶用量,最终选择体系 7 作为西伯利亚杏的
SRAP-PCR 优化反应体系,即反应体系总体积
20 μL,Mg2+ 2.0 mmol·L-1,dNTPs 0.25 mmol·L-1,引
物浓度 1.2 μmol·L-1,Taq聚合酶量 1.0 U,DNA模板
量20 ng。
2.3 西伯利亚杏SRAP-PCR反应体系的验证
采用优化的 SRAP-PCR反应体系,用引物对
ME5/EM10对24个西伯利亚杏无性系做SRAP分子
标记试验,PCR扩增的电泳图谱见图3。
图1 西伯利亚杏总DNA 提取结果
图2 西伯利亚杏SRAP 正交试验扩增结果 图3 25个西伯利亚杏无性系PCR 扩增的电泳图谱
共扩增出谱带431条,引物扩增出23条谱带,其中
338条为多态性谱带,多态百分率为78.42%。扩增多
态性片段的长度在100~2 000 bp,分布均匀,范围广。
3 结论与讨论
选取西伯利亚杏树冠向阳面中部 1年生嫩枝,
采用改良 CTAB法提取总 DNA,经检测完全满足
SRAP标记的要求。通过 Mg2 +、dNTPs、引物、Taq
DNA 聚合酶和模板DNA的 5个因素 4个浓度水平
的正交试验,确定了 SRAP-PCR的优化反应体系
(反应体系总体积 20μL):Mg2+2.0 mmol·L-1、dNTPs
0.25 mmol·L-1、引物浓度 1.2 μmol·L-1、Taq聚合酶
1.0 U、DNA模板量 20 ng。应用这一 SRAP-PCR优
化反应体系对 24个西伯利亚杏无性系进行 SRAP
分子标记试验,扩增出的谱带多态百分率为
78.42%,说明 SRAP检测到的多态性很高。本研究
成果为应用SRAP标记研究山杏种质资源多样性及
分类提供了技术基础。艾鹏飞[4]等采用正交试验,
对影响大扁杏SRAP-PCR反应体系的4因素4水平
进行筛选,确立了大扁杏 SRAP-PCR的优化体系:
总体积 为 20μL ,dNTPs 为 0.2 mmol·L-1 ,Mg2+
为 2.5 mmol·L-1,引物浓度为0.9 μmol·L-1,Taq聚合
酶量为 1.5 U,退火温度 52 ℃。本试验结果与艾鹏
飞的试验结果有所不同,说明不同种类杏树
SRAP-PCR的最优体系有一定差别,不能完全通用。
参考文献:
[1] 吕耀平,胡则辉,王成辉,等.与“全红”瓯江彩鲤体色相关
的 SRAP及 SCAR分子标记 [J].水生生物学报,2011,
(1):45-50.
[2] 顾红雅.植物基因与分子操作[M].北京:高等教育出版
社,1995.
[3] 杨丽,王玉柱,孙浩元,等.两种方法提取杏基因组DNA
的比较[J].河北林果研究,2008,23(1):49-51.
[4] 艾鹏飞,甄志军,方闪闪,等.仁用杏SRAP-PCR体系的正
交设计优化[J].河北科技大学学报,2009,30(3):48-252.
(责任编辑:张素清)
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