全 文 ：收稿日期: 2004- 10- 08
基金项目: 国家重点基础研究发展计划项目( 2002CB412300) ; 中日
技术合作项目( DF)
作者简介: 侯文华( 1965- ) ,男,湖南安仁人,研究员,博士后.
3种重金属对青萍毒害的研究
侯文华1 , 宋关铃2 , 汪群慧2 , 缪 静2
( 1. 中国环境科学研究院 湖泊生态环境创新基地,北京 100012; 2. 哈尔滨工业大学市政环境工程学院,黑龙江哈尔滨 150001)
摘要: 对水体中主要的 3种重金属(铜、镉、铅)对青萍抗氧化酶系统的几种酶,包括过氧化物酶( POD)、超氧化物歧化酶( SOD)、过氧化氢酶( CAT) 的
活性,丙二醛( MDA)的含量,可溶性蛋白含量及叶绿体色素含量等指标的影响进行了研究。研究表明:青萍对镉污染反应最为敏感, 对铜的反应相对
缓和一些;青萍在铅的胁迫下表现出无序的状态。因此,青萍不适合应用于重金属镉污染的富营养化水体的治理和生态修复中。
关键词: 重金属污染; 青萍; 抗氧化酶; 富营养化; 生态修复
中图分类号: X50312 文献标识码: A 文章编号: 1001 - 6929( 2004)S0 - 0040 - 05
Toxic Effect of Three Kinds of Heavy Metals on Lemna minor
HOU Wen-hua
1
, SONG Guan-ling
2
, WANG Qun-hui
2
, MIAO Jing
2
( 1. Research Center for Lake Environments, Chinese Research Academy of Environmental Sciences, Beijing 100012, China;
2. Academy of City Environmental Engineering, Harbin Institute of Technology, Harbin 150001, China)
Abstract: The influence of three kinds of heavy metal ( copper, cadmium, lead) on the activities of peroxidase ( POD) , superoxide dismutase
( SOD) , catalase( CAT) and the contents of malondialdehyde( MDA) , soluble protein and chlorophyll of Lemna minor was investigated. Lemna minor
was more sensitive to cadmium than to copper. Some indexes of Lemna minor exposed to lead under menace conditions have no rules. The results.
suggest that Lemna minor is not suitable for recovering the eutrophicated water with cadmium pollution.
Key words: heavy metal pollution; Lemna minor; antioxidant enzymes; eutrophication; ecological restoration
目前, 水体污染已经是一个全球性的环境问题。
水体的污染包括水体的富营养化、重金属污染、有机污
染等等。通常情况下某些水体的污染并不只包括一种
类型的污染,所以研究某一类型污染的治理时要同时
考虑其他污染类型的影响。
近年来以大型植物为主的富营养化水体生态修复
工程已经被认为是富营养化水体治理的关键技术之一。
浮萍科植物以其繁殖速度快 [1 -2 ] , N, P 含量高[3 - 4] ,生长
范围广,适应性强 [5 - 6]和容易收获[7 ]等特点,被看成是富
营养化水体治理的首选大型水生植物之一。
由于水体污染及其复杂性, 所以笔者研究水体中
几种主要的重金属铜、镉、铅对我国浮萍科植物的主要
种类 ) ) ) 青萍的一些理化指标的影响,以确定该植物
是否适合应用于有重金属污染的富营养化水体的治理
和生态修复中。
1 实验方法
111 萍种来源及实验的前处理
青萍的种源取自太湖地区, 位于江苏省宜兴市大
浦镇境内的湿地系统。该湿地处于 31b17c24dN,
119b55c6dE。取回的青萍经流水清洗后放在大型的生态
水族箱中进行实验室内大规模扩大繁殖, 使其适合室
内的生长条件, 备用。水族箱的体积为 115 m @ 018 m
@ 016 m, 上面装水草灯来对浮萍进行灯光补偿, 每个
槽中均加泵,使水充氧和循环流动。温度用可调式加
热棒控制在( 25 ? 1) e 。光照时间为 16 hPd, 定时添加
培养液保持液面高度使其照度为4 000 lx, 培养液为
1P10浓度的 Hutner 完全培养液 [8 ] , 每 115 个月更换 1
次,前处理 5个月左右用于实验。
112 培养条件
培养前将青萍用 1% (体积分数) 的 NaClO 消毒
3~ 5 min,再用无菌水清洗 3次。500 mL 的烧杯装 300
mL 的培养液和一定量的青萍置于日本 SANYAO公司
生产的MLR - 350型人工恒温光照培养箱中培养,培养
温度为26~ 28 e , 照度为2 000 lx, 光照时间为 16 hPd,
湿度为 60%。铜和镉对青萍影响的研究培养采用添
加不同质量浓度的 Cu2+ 和 Cd2+ 的 Steinberg 培养基 [8 ] ,
由于 Pb2+ 容易和培养液中的许多离子产生沉淀,所以
其对青萍的影响采用过滤的池塘水( Q( TP)为01321 5
第 17 卷 增刊
环 境 科 学 研 究
Research of Environmental Sciences
Vol. 17, Suppl. , 2004
DOI：10.13198/j.res.2004.s1.42.houwh.009
mgPL, Q(TN)为21365 4 mgPL)来进行研究。3种重金属
分别用 CuSO4#5H2O, CdCl2#2H2O 和 Pb( CH3COO) 2 配
成Cu2+ , Cd2+ 和 Pb2+ 的质量浓度均为 100 mgPL的标准
溶液,实验时根据需要进行添加。3种重金属的添加
量均分别为 0, 0105, 015, 5, 10和 20 mgPL 6个浓度水
平, pH 为 615。烧杯中放 2 g 浮萍(用滤纸吸 3~ 5 min
至干) ,每组实验 3个重复。培养 4 d 后记录青萍宏观
生长的变化,并测定相关的理化指标。
113 分析方法
a. 叶绿体色素含量的测定:用 96%的酒精研磨去
根的青萍(即青萍的叶状体)后用比色法测定 [9 ] ,最后
换算成 mgPg(以鲜重计) 表示。色素的浓度根据如下
公式进行计算:
C a= 13195OD 665 - 6188OD 649
C b= 24196OD 649 - 7132OD 665
C= Ca+ Cb
C x. c= ( 1000OD 470 - 2105C a - 11418Cb )P245
其中, OD 665 , OD 649 , OD 470分别为在 665, 649和 470
nm波长下的吸光度; C a 为叶绿素 a 的质量浓度, mgPL;
Cb 为叶绿素b的质量浓度, mgPL; C 为总叶绿素的质量
浓度,mgPL; Cx. c表示类胡萝卜素的质量浓度, mgPL。
b. 酶液的制备: 称取 015 g 浮萍, 加入 50 mmolPL
磷酸缓冲液( pH= 718) ,研磨, 4 e 下15 000 rPmin离心
15 min,上清液定容至 5 mL,取部分上清液经适当稀释
后用于可溶性蛋白含量和酶活性测定。
c. 可溶性蛋白含量测定采用考马斯亮蓝蛋白染
色法。蛋白标准和试剂均购自南京建成生物工程研究
所,测定方法按照试剂盒的说明书进行。
d. 过氧化物酶( POD)活性的测定采用愈创木酚
法 [10 ] , 以 470 nm波长 OD 增加 0. 01为 1个酶的活力
单位( U) , 酶活性以每分钟每毫克可溶性蛋白的酶活
表示,单位为UPmg。
e. 过氧化氢酶( CAT) 活性的测定采用过氧化氢
法 [10 ] , 以240 nm 波长 OD 降低 0101为 1个酶的活力
单位( U) , 酶活性以每分钟每毫克可溶性蛋白的酶活
表示,单位为UPmg。
f . 超氧化物歧化酶(SOD)活性的测定采用黄嘌呤
氧化法。药品购自南京建成生物研究所, 测定方法按
照试剂盒的说明书进行。用每毫克可溶性蛋白的酶活
表示,单位为UPmg。
g. 丙二醛(MDA)含量变化的测定用硫代巴比妥
酸( TBA)法 [11 ] ,上清液 115 mL 于带塞试管中(可做 2
个重复) ,加入 015% (质量分数) TBA 溶液 215 mL, 混
合后于沸水浴上反应 20 min, 冷却后离心,上清液分别
于532, 600和 450 nm波长下测定 OD。计算公式为:
c (MDA) = 6145( OD 532 - OD 600 ) - 0156OD 450
式中, c (MDA)为丙二醛浓度, LmolPL , 然后以材料鲜
重(LmolPg)表示丙二醛含量。
2 结果与讨论
211 青萍可溶性蛋白和叶绿体色素含量的变化
在重金属胁迫下, 培养 4 d后青萍可溶性蛋白随
重金属变化的情况见图 1。由图 1可知, 青萍在有镉
和铜污染的情况下, 其可溶性蛋白含量均明显的降低,
尤其是在重金属镉污染的水体环境中。在非常低的铜
质量浓度( 0105 mgPL)培养条件下, 青萍可溶性蛋白的
含量基本无太大的变化。铜是植物生长必须的元素之
一,低质量浓度对植物生长有利,所以不会造成其合成
能力的降低,而相同质量浓度的镉却可以使青萍的可
溶性蛋白含量急剧降低。在有铅污染的情况下,青萍
可溶性蛋白含量表现出没有规律的变化, 总体上还有
上升的趋势。可溶性蛋白含量的降低说明了机体合成
蛋白能力的下降。在环境胁迫的一般情况下,可溶性
蛋白的含量均下降。而铅胁迫下可溶性蛋白的含量表
现出来的增加, 并非真的是其机体合成蛋白能力的增
强,这是因为在有铅存在的情况下,青萍表现出了明显
的断根现象,可溶性蛋白含量的升高应该是青萍根中
蛋白含量相对低于叶状体中蛋白含量的一种表现。
图 1 3种重金属对青萍可溶性
蛋白含量的影响
Fig. 1 The influence of three kinds of heavy
metal on the content of soluble protein
of Lemna minor
在 3种重金属胁迫下,青萍叶绿体色素和类胡萝
卜素的含量均发生了很大的变化(见表 1, 2)。总的来
说, 3 种重金属均使青萍叶绿素和类胡萝卜素的含量
降低。低质量浓度( 0105 mgPL)的铜可以使青萍的叶
绿素和类胡萝卜素含量轻微升高, 这也说明了低质量
浓度的铜对青萍生长无害。相对而言, 重金属镉对青
萍的伤害作用较大, 较低的质量浓度就可以使其色素
的含量明显降低。铅对青萍色素含量的影响仍然出现
了似乎不能解释的情况, 也就是在低质量浓度铅的胁
41增刊 侯文华等: 3种重金属对青萍毒害的研究
迫下青萍色素的含量也有升高, 并且总体上铅对叶绿
素和类胡萝卜素含量的影响相对于其他 2种重金属要
相对缓和。铅本身并非植物生长所必须的元素,并且
是我国实施排放总量控制的指标之一 [12 ]。从实验过
程中的宏观表现看, 低质量浓度的铅就可以伤害掉青
萍大部分的根, 但也确实是在铅的胁迫下,青萍叶状体
并不像镉污染的情况下变黄的那么快。铅对青萍的影
响很复杂,其低质量浓度时叶绿素及类胡萝卜素含量
的升高也并不能说明在该浓度下铅是有利于青萍生长
的。这或许是植物体内一种代谢反应失调所导致的,
如细胞内失水等;也可能是因为铅本身容易在生物体
内蓄积,其蓄积的量在不同生物体表现出的症状也差
别很大。
212 青萍抗氧化酶系统的变化
表 1 3 种重金属对青萍叶绿体色素含量的影响
Table 1 The influence of three kinds of heavy metal on the content of chlorophyll a of Lemna minor
重金属离子质
量浓度P(mg#L - 1)
w(叶绿素 a)P( mg#g - 1 ) w (叶绿素 b)P( mg#g - 1)
Cu2+ Cd2+ Pb2+ Cu2+ Cd2+ Pb2+
0 0. 457 4 0. 460 3 0. 355 3 0. 255 9 0. 284 9 0. 233 5
0. 05 0. 458 8 0. 430 0 0. 412 3 0. 257 0 0. 281 2 0. 236 7
0. 5 0. 381 3 0. 374 0 0. 406 3 0. 245 8 0. 275 5 0. 271 4
5 0. 359 8 0. 340 5 0. 372 9 0. 223 6 0. 258 0 0. 235 9
10 0. 291 2 0. 269 7 0. 339 4 0. 203 5 0. 220 2 0. 231 8
20 0. 283 5 0. 247 3 0. 302 9 0. 177 3 0. 221 8 0. 220 8
表 2 3 种重金属对青萍类胡萝卜素含量的影响
Table 2 The influence of three kinds of heavy metal on the content of carotenoid of Lemna minor
项目 Q( Cu2+ )P( mg#L- 1)
0 0. 05 0. 5 5 10 20
w (类胡萝卜素)P( mg#g - 1 ) 0. 178 2 0. 179 5 0. 159 3 0. 134 0 0. 114 4 0. 110 6
项目 Q( Cd2+ )P( mg#L- 1)
0 0. 05 0. 5 5 10 20
w (类胡萝卜素)P( mg#g) - 1 0. 212 0 0. 197 3 0. 194 1 0. 154 8 0. 121 7 0. 110 7
项目 Q( Pb
2+ )P(mg#L - 1)
0 0. 05 0. 5 5 10 20
w (类胡萝卜素)P( mg#g) - 1 0. 166 2 0. 192 9 0. 190 5 0. 174 5 0. 159 3 0. 141 1
笔者重点研究了 3种重金属对青萍抗氧化酶系统
的影响。当植物遭受逆境的条件时, 植物体内就会产
生过多的活性氧。叶绿体和线粒体是细胞内产生活性
氧的重要器官。细胞内氧气的浓度在光合作用时是最
高的, 因此叶绿体是活性氧产生的关键细胞器 [13 ]。活
性氧升高可以通过破坏脂类、核酸和蛋白质等来扰乱
细胞正常的代谢。植物在长期的进化过程中,通过自
然选择而发展了抗自由基损伤的保护系统, 包括几种
主要的保护酶: CAT, POD, SOD和一些抗氧化剂。它
们能及时清除活性氧, 因而不会积累到足以损伤机体
的浓度。当植物处于逆境中时,细胞的结构受到损伤,
活性氧的积累量有可能增多,如果超过生物体内在的
防御能力, 就会发生死亡。实验中测定了 CAT, POD,
SOD活性和MDA含量的变化,以研究水体环境中重金
属污染对浮萍抗氧化酶系统的影响, 从而确定青萍对
3种重金属的耐受范围。
重金属对青萍 POD活性的影响见图 2。低质量浓
度镉( 0105 mgPL)就可以使青萍 POD的活性急剧升高,
高于 015 mgPL时青萍的酶活性不再有升高的能力,开
始降低。宏观上也表现出在 0105 mgPL 镉存在的情况
下,培养 4 d时青萍已经有了枯萎、死亡的迹象。铜也
是在低的质量浓度范围内就可以使青萍过氧化物酶的
活性升高, 在培养 4 d 的过程中, 在培养浓度为 10
mgPL时其POD活性达到最大值, 此时青萍在宏观上也
表现出明显的枯萎死亡症状。相对而言, 青萍对铜的
耐受能力相对高于对镉的耐受能力。铅对青萍 POD
活性的影响并不明显, 可能是在铅的胁迫下青萍根的
断掉影响了其结果, 也可能是铅对青萍过氧化物酶就
是这样一种不明显的影响,也或许它的毒害反映在其
他的生理指标上。POD是一种涉及到植物生长、发育
以及代谢等的一类酶, 它们影响植物体内木质素和乙
烯的合成及 IAA的分解, 同时也参与植物体内对病菌、
伤害等的防御和保护作用 [14 -15]。通常植物体受到环
境胁迫均会表现出 POD活性的升高或降低。一般的
情况为植物在受到伤害时,升高 POD的活性来减轻机
体的伤害,当植物体无法通过自身的调节作用来减轻
这种伤害时其 POD的活性开始降低。由以上的数据
可以看出,青萍对镉污染胁迫反应最为敏感, 在镉质量
浓度为 0105 mgPL 时 POD 活性急剧升高, 高于 015
mgPL时开始下降。此时青萍已经无法清除该类活性氧
42 环 境 科 学 研 究 第 17 卷
图 2 3种重金属对青萍 POD活性的影响
Fig . 2 The influence of three kinds of heavy metals
on the POD activity of Lemna minor
而开始表现出了明显的死亡症状。
3种重金属对青萍 CAT 活性的影响见图 3。在镉
胁迫的条件下,青萍 CAT 活性的变化较为明显, 也是
在质量浓度为 0105 mgPL 时表现急剧升高, 在质量浓
度为 015 mgPL时达到最大,以后青萍 CAT活性开始急
剧下降。铜对青萍 CAT 活性的影响相对缓和。铅对
青萍 CAT 活性基本上没有大的影响。CAT 是植物细
胞内一种重要的清除活性氧酶。这种酶参与清除过氧
化氢的积累和毒害 [16] 来维持细胞内 H2O2 的正常水
平。CAT 的作用是把 H2O2 分解成水和氧气 [17] , 细胞
CAT的活性是H2O2 转化的重要信号 [18 ]。在镉的胁迫
下,在较低质量浓度的情况下,青萍的细胞内就积累了
大量的H2O2 ,青萍通过提高 CAT 的活性将 H2O2 进行
分解, 镉的质量浓度超过 015 mgPL 时由于青萍受到的
毒害作用太高而使其 CAT 的活性降低。铜对青萍
CAT活性的影响类似于镉对其活性的影响, 只是相对
来说要缓和一些。铅对青萍 CAT 活性的影响表现的
并不是很明显, 也有人认为铅对浮萍过氧化氢酶的活
性有明显的抑制作用, 也就是说铅可以使浮萍过氧化
氢酶的活性降低 [19]。该研究中青萍 CAT 的活性没有
表现出明显的降低现象。
图 3 3种重金属对青萍 CAT活性的影响
Fig . 3 The influence of three kinds of heavy metals
on the CAT activity of Lemna minor
3种重金属对青萍 SOD影响见图 4。3种重金属
胁迫下,青萍SOD活性均有不同程度的提高。SOD是
一种广泛存在于生物界的金属酶类, 它的存在与细胞
的需氧代谢密切相关 [20 ]。SOD作为植物抗氧化系统
的第一道防线, 可清除细胞中多余的超氧根阴离
子 [21 ]。在镉胁迫超过 015 mgPL, 铜胁迫超过 10 mgPL
时,青萍 POD活性和 CAT 活性开始下降,而 SOD活性
仍然上升,其机体清除活性氧的能力已经出现了不一
致,说明在该质量浓度相对应的重金属污染的情况下,
青萍本身的调节机能已经发生了紊乱, 构成了致死性
的伤害。
图 4 3 种重金属对青萍 SOD活性的影响
Fig. 4 The influence of three kinds of heavy
metals on the SOD activity of Lemna minor
3种重金属对青萍MDA含量的影响见图 5。青萍
在3种重金属的胁迫下其MDA的含量均升高, 特别是
在镉胁迫下,其MDA含量的升高最为明显。丙二醛是
常用的膜脂过氧化指标, 是植物器官衰老或在逆境条
件下发生膜脂过氧化的产物之一, 其含量高低表示细
胞膜脂过氧化程度和植物对逆境条件耐受的强弱 [22 ]。
在重金属胁迫下,青萍 MDA 含量的升高(特别是在镉
的胁迫下)充分地说明了青萍对重金属镉和铜较敏感。
在实验浓度下, 短短 4 d 的培养就使其细胞膜脂发生
了严重的过氧化。
图 5 3 种重金属对青萍MDA含量的影响
Fig. 5 The influence of three kinds of heavy
metals on MDA content of Lemna minor
43增刊 侯文华等: 3种重金属对青萍毒害的研究
在3种重金属胁迫下青萍许多的生理指标都发生
了变化,该植物相对于其他的大型植物来说是比较敏
感的, 尤其是对水体中镉的污染。在利用该植物进行
富营养化水体的治理和生态修复中, 一定要考虑水体
中是否有镉等重金属的污染。
3 结论
a. 3种重金属中,镉对青萍的伤害最大, 在其质量
浓度为 015 mgPL 时,就可以使细胞内抗氧化系统发生
紊乱。
b. 在极低的浓度下, 铜对青萍生长无害, 其质量
浓度超过 0105 mgPL 时开始对青萍构成胁迫, 质量浓
度达到10 mgPL时细胞抗氧化系统发生紊乱。
c. 铅对青萍生长的影响出现了无序的现象,该方
面的机理问题还有待于进一步研究。
d. 在 3种重金属中青萍对镉污染最敏感, 最适合
作为金属镉污染的环境指示种。
e. 青萍不适合应用于镉污染的富营养化水体的
治理和生态修复中。
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(责任编辑 孙彩萍)
44 环 境 科 学 研 究 第 17 卷