全 文 ：球孢白僵菌 Bb174固态发酵产几丁质酶
产酶及酶学特征研究*
张 洁1 蔡敬民1 吴 克1 金胜先1 潘仁瑞1 樊美珍2* *
( 1 合肥学院生物科学与技术系,合肥 230022; 2安徽农业大学虫生真菌研究所,合肥 230036)
摘要 对球孢白僵菌( Beauveria bassiana) Bb174 产几丁质酶进行了固态发酵条件及酶学特征的研究.
结果表明, 以 4!1麸皮!蚕蛹粉、蛋白胨 1 g∀L- 1作为产酶最适培养基, 在 7 5 g 培养基中接种 3 ml液态种
子,自然 pH 下 28 # 培养 2 d, 酶活可达最高,为 126 U∀g - 1(干培养基) . 粗酶液的最适反应温度为 40 # ,
最适反应 pH 50,在 30~ 70 # 保温 1 h,得半失活温度 48 # .在 30~ 40 # 、pH 4~ 6 范围内,酶的性质最
稳定. 根据 LineweaverBurk 作图法,得到该酶的动力学参数 K m 为 0 52 mg∀ml- 1 , Vm 为 0 7 ∃ E680∀h- 1 .
关键词 球孢白僵菌 几丁质酶 固态发酵 酶动力学
文章编号 1001- 9332( 2004) 05- 0863- 04 中图分类号 Q938 1 文献标识码 A
Production and properties of chitinase from Beauveria bassiana Bb174 in solid state fermentation. ZHANG
Jie1 , CA I Jingmin1, WU Ke1 , JIN Shengx ian1 , PAN Renrui1, FAN Meizhen2 ( 1Depar tment of Biology Science
and Technology , H ef ei College, H ef ei 230022, China; 2 I nstitute of Economic Insects and Fungi , A nhui Agr i
cultural Univer sity , H ef ei 230036, China) . Chin. J . A pp l . Ecol . , 2004, 15( 5) : 863~ 866.
This paper studied the chitinase pr oduction of Beauver ia bassiana Bb174 under solid state fermentation condi
tion. The optimal medium consisted of wheat bran and silkworm chrysalis at the ratio of 4!1, supplemented wit h
1 g peptone∀L- 1 as nitrogen source and some other miner al nutrients. The enzyme activity reached 126 units per
gram dry medium after cultured for 2 days at 28 # and natural pH by inoculated 3 ml spore suspension into this
medium. The optimal temperature and pH for chintinase production were 40 # and 5. 0, respectively . The tem
perature to lose 50% activ ity of the enzyme w as 48 # after incubated at 30~ 70 # for 1 h. The enzyme was
stable at 30~ 40 # and pH 4~ 6, and the K m and Vmax values were 0. 52 mg∀ml- 1 and 0. 7∃ E680∀h- 1, respec
tively.
Key words Beauver ia bassiana, Chitinase, Solid state fermentation, Kinetic of enzyme reaction.
* 安徽省教育厅自然科学基金项目( 2000jl267 ) ,合肥学院科研基金
项目和安徽省优秀青年科技基金资助项目( 04043051) .
* * 通讯联系人.
2002- 11- 12收稿, 2003- 06- 16接受.
1 引 言
几丁质酶是一类能水解几丁质[由 N乙酰葡萄
糖胺( NAG)和葡萄糖胺以 1, 4 糖苷键连接的多
糖]的水解酶,广泛存在于植物、动物和微生物中. 几
丁质酶水解几丁质, 可用于海产加工业,如可用于虾
蟹等有壳水生动物废弃物的生物转换, 起到环保和
变废为宝的作用[ 19] , 也可用于真菌发酵工业的废物
转化和食品工业生产可食用单细胞蛋白.此外,利用
几丁质酶, 在食品、化工、轻工、医疗卫生等方面, 可
生产出无毒无味的絮凝剂、稳定剂和增凝剂等[ 7] .
几丁质酶在植物保护、防治植物病虫害方面具有极
大的应用价值[ 5, 12, 18] . 几丁质酶能催化水解真菌细
胞壁的重要成分几丁质, 从而抑制真菌的生长增
殖,提高植物的抗真菌能力.在具有几丁质外骨骼的
节肢动物中,几丁质酶在其蜕皮过程中发挥着重要
的作用. 几丁质酶还能增强 BT、核型多角体病毒
NPV的防治效果,这有利于克服或延缓昆虫对 BT
等的抗性[ 15] .近年来, 由于几丁质酶具有较大的应
用价值,引起了人们广泛的重视和研究热情.国内外
对放线菌、细菌和真菌几丁质酶发酵条件的研究均
有所报道[ 3, 4] , 但尚未见有球孢白僵菌几丁质酶固
态培养的研究报道. 本文报道球孢白僵菌 Bb174原
始菌株几丁质酶的固态发酵条件、粗酶酶学性质及
其动力学的初步研究结果.
2 材料与方法
2 1 菌株
球孢白僵菌菌株 Beauver ia bassiana Bb174, 由安徽农业
大学提供.
2 2 胶体几丁质制备
在 Jeuniaux[ 8]方法的基础上加以改进. 取几丁质粉 (由
大连鑫蝶甲壳素有限公司提供) ,置于浓盐酸中溶解后, 4 #
应 用 生 态 学 报 2004 年 5 月 第 15 卷 第 5 期
CHINESE JOURNAL OF APPLIED ECOLOGY, May 2004, 15( 5)!863~ 866
放置 24 h, 用玻璃棉过滤到蒸馏水中, 待胶体几丁质沉降,吸
去上清液,加蒸馏水反复洗涤至中性.
23 培养条件
231 培养基 斜面培养基: 葡萄糖 40 g∀L- 1 ,蛋白胨 10 g
∀L- 1 ,酵母粉 10 g∀L - 1, 琼脂 20 g∀L- 1 .液态种培养基: 葡萄
糖 40 g∀L - 1, 蛋白胨 10 g∀L - 1, 酵母粉 10 g∀L- 1 .固态发酵
培养基: 以 4!1 的麸皮!蚕蛹粉混合后, 取 75 g 加入到 250
ml三角瓶中, 用 11 5 ml营养盐配置. 营养盐: MgSO4 0 05 g
∀L- 1, KH2PO4 0 05 g∀L- 1 , KCl 005 g∀L- 1 , F eSO4∀7H2O
001 g∀L - 1, ZnSO4 01 g∀L- 1
232 接种和培养 在120 r∀min- 1摇床上, 用28 # 培养 3 d
的液态种液( 10 mg 干菌丝∀ml- 1 )接入固态培养基, 搅拌均
匀后,于 28 # 培养.
24 粗酶液制备
将培养结束的发酵曲以一定比例加入 0 2 mol∀L - 1、pH
50 的醋酸缓冲液,将曲充分捣碎后, 于室温浸提 1 h, 过滤
得粗酶液.
25 测定方法
251 几丁质酶活力的测定[ 11] 以 1 0 ml胶体几丁质为底
物,加入酶液 05 ml, 50 # 水浴震荡反应 1 h, 用 DNS ( 3, 5
二硝基水杨酸) 法[ 10]测定产生的还原糖. 在本实验条件下,
每分钟产生相当于 1 g NAG 还原糖所需的酶量定义为一
个酶活力单位( U ) .
252 几丁质酶酶学性质参数的测定 几丁质酶的最适温
度:将发酵粗酶液在不同温度下分别保温 1 h,测定几丁质酶
活力. 几丁质酶的热稳定性: 将发酵粗酶液在不同温度下保
温 1 h,立即冰浴, 测定其剩余酶活力.以剩余活力为 50% 时
的温度作为半失活温度. pH 对粗酶活力的影响: 选择不同
pH 值的缓冲液,在 50 # 下测定几丁质酶活力.几丁质酶的
pH 稳定性:发酵粗酶液分别加入不同 pH 值的缓冲液, 室温
下放置 1 h,测定酶活力.
253 蛋白酶活力 采用 Fo lin 酚法[ 9]测定. 在本实验条件
下,每分钟催化酪蛋白水解生成 1 mg 酪氨酸的酶量定义为
一个活力单位.
254 可溶性蛋白质含量 采用 Bradford 考马斯亮蓝比色
法[ 1]测定.
255 还原糖含量 取酶液 1 ml, 加入 3 ml DNS 煮沸 10
min, 用 DNS法测定.
3 结果与讨论
31 白僵菌 Bb174产几丁质酶的条件优化
311麸皮与蚕蛹粉配比对产酶的影响 球孢白僵
菌Bb174是一株虫生菌. 实验表明, 该菌在采用麸
皮并加入蚕蛹粉的培养基中可以较好地生长繁殖,
并合成各种酶类.以不同比例的麸皮对 Bb174菌进
行培养,结果见表 1. 从表 1 可以看出, 麸皮比例等
于或大于蛹粉时,所产几丁质酶活力高于蛹粉比例
大于麸皮时的活力,只有在麸皮比例过大时,几丁质
酶活力才下降.麸皮!蛹粉为 4!1 时, 相对酶活力最
高. 这一结果与我们研究的另 1 株球孢白僵菌
Bb176相同(未发表) , 与绿僵菌的麸皮!蚕蛹粉为 1
!3时活力最大[ 2]相比, 有较大的差别.
表 1 碳源配比对产酶的影响
Table 1 Effect of carbon sources component on the enzyme production
麸皮!蚕蛹
Wheat bran!S ilkw orm chrysalis 相对酶活力Relat ive act ivity( % )
1!1 809 % 236
2!1 786 % 261
3!1 714 % 193
4!1 100 % 096
5!1 321 % 305
1!2 476 % 186
1!3 357 % 121
1!4 393 % 132
1!5 286 % 137
312 含氮化合物对产酶的影响 在培养基中加入
不同的含氮化合物进行发酵发现, 添加不同的氮化
合物对 Bb174产几丁质酶具有较大的影响(图 1) .
从图 1可以看出, 蛋白胨(鱼蛋白胨)对产酶有明显
的促进作用. 这可能是蛋白胨的有机氮成分更符合
Bb174菌在含有机氮丰富的虫体上生长和代谢的习
性.蛋白胨能促进 Bb174菌迅速生长, 使其达到足
够的生物量,进行酶合成.这与我们在黑曲霉木聚糖
酶研究中添加 NaNO3 能提高产酶能力有所不同.
图 1 氮化合物种类对产酶的影响
Fig. 1 Effect of nit rogen on chit inase product ion.
氮化合物浓度均为 01% ;每个数据代表 3个数的平均值 % SD Con
cent rat ion of each nit rogen compound w as 01% , every datum w as the
average value of three group % SD.下同 The same below .
313 几丁质添加量对产酶的影响 在培养基中加
入不同比例的几丁质(图 2) .从图 2可以看出,添加
02%的几丁质, 可使 Bb174 菌产几丁质酶活力达
到最高, 说明球孢白僵菌几丁质酶为诱导酶, 与
Leger等[ 6]得出的虫生真菌产生的几丁质酶是诱导
酶的结论一致.适量的几丁质对几丁质酶的产生具
有诱导作用, 但过量的几丁质对产酶会产生抑制作
用.
864 应 用 生 态 学 报 15卷
图 2 几丁质添加量对产酶的影响
Fig. 2 Ef fect of chit in in th e medium on chit inase product ion.
314 接种量对产酶活力的影响 在固态培养基
中,不同的接种量对 Bb174菌产几丁质酶具有明显
的影响(图 3) .在 75 g 培养基中接种 3 m l种子液,
相对酶活力最高. 接种量低,菌体生长缓慢, 白色菌
丝不明显,发酵周期延长; 接种量过高, 酶活力也降
低,可能是由于大接种量使生长过快,造成短周期发
酵,对产酶不利.
图 3 接种量对产酶活力的影响
Fig. 3 Ef fect of inoculums size on enzyme product ion
315固液浸提比对几丁质酶提取率的影响 发酵
后的固体曲用 02 mol∀L- 1、pH50 的醋酸缓冲液,
以不同的液固浸提比( V∀W- 1 )浸提并过滤,得粗滤
液,测定几丁质酶活力(表 2) . 从单位酶活力大小比
较,依次为 6!1> 7!1> 5!1> 4!1> 3!1> 2!1. 但从
总酶活力看, 7!1 的液固浸提比对浸提 Bb174 菌固
体培养曲中的几丁质酶更合理, 酶的相对提取得率
最高.这说明浸提比越小, 酶的浸出量越低. 浸提比
是影响几丁质酶提取得率的主要因素之一.
32 Bb174菌固态发酵产酶过程
在已优化条件下, 对 Bb174 菌进行了固态发酵
培养, 产几丁质酶过程曲线见图 4. 接种后, 固态培
养曲中还原糖开始被利用,菌丝体生长,几丁质酶少
量合成, 12 h 形成一个小峰.培养 24 h 后,培养曲中
有少量白色菌丝出现,几丁质酶开始大量合成,还原
糖在达到最大值后被迅速利用,为菌体生长代谢提
表 2 浸提比对酶提取得率的影响
Table 2 Effect of extraction ratio on the enzyme yield
浸提比
Ext ract ion
rat io
单位浸提液酶活力
Chit inase act ivity
per ext ract ion
liquid volume
(U∀ml- 1)
总酶活力
Total act ivity
( U)
几丁质酶相对提取得率
Enzyme relative
extraction yield
( % )
2!1 114 171 151
3!1 12 270 238
4!1 174 522 460
5!1 18 675 595
6!1 246 1107 976
7!1 216 1134 100
供了碳能源物质.发酵 48 h 时,几丁质酶活力达最
大值,为 126 U∀g - 1.此后,几丁质酶开始呈持续下
降趋势.蛋白酶活力在 12 h 出现一个小峰,这可能
是由于菌体对自身蛋白的保护作用, 48 h 时达最低
值.随着蛋白酶活力的降低, 几丁质酶活力不断上
升.当蛋白酶活力降至最低时, 几丁质酶活力达最
大;此后, 随着蛋白酶活力的再次上升, 几丁质酶活
力降低.由此可见,几丁质酶活力的降低与蛋白酶分
解作用有关.在整个发酵过程中,可溶性蛋白质含量
保持上升趋势.
图 4 固态发酵几丁质酶的产酶过程
Fig. 4 Time course curve of chit inase in solid state culture.
& .几丁质酶 Chit inase, ∋ .蛋白酶 Proteinase, ( .可溶性蛋白 Soluble
protein, ).还原糖 Reducing sugar.
33 几丁质酶粗酶液的酶学性质
当酶液在不同温度下保温 1 h 后,测定几丁质
酶活力, 得粗酶液的最适反应温度为 40 # .用不同
pH 值缓冲液配制成底物,与酶液在 50 # 下反应后,
测定几丁质酶活力.结果表明, 该酶最适反应 pH 值
为 50.
固态发酵粗酶液在不同温度下静置 1 h 后, 立
即冰浴,测定几丁质酶活力,剩余酶活力为 50% 时
的温度作为半失活温度. 结果表明, 球孢白僵菌
Bb174菌几丁质酶粗酶液的半失活温度为 48 # .在
30~ 40 # 范围, 该酶较为稳定.
在HAcNaAc 缓冲系统中, 分别以不同的 pH
梯度,在 05 m l几丁质酶液中加入 05 ml缓冲液,
8655 期 张 洁等:球孢白僵菌 Bb174 固态发酵产几丁质酶产酶及酶学特征研究
室温下放置 1 h, 测定几丁质酶活力. 在 pH4~ 6 范
围内,几丁质酶活力相对稳定,与夏国庆等[ 16]研究
的曲霉几丁质酶酶学性质一致.
34 几丁质酶的反应动力学性质
分别取 1 ml不同浓度的胶体几丁质加入 05
ml粗酶液, 于 50 # 保温 1 h 测定其酶活力, 并作
LineweaverBurk图(图 5) . 由图 5 计算得到几丁质
酶反应动力学参数 K m= 052 mg∀ml- 1, V m= 07
∃E680∀h- 1 ( ∃E680为 680 nm 波长下光吸收速率的
增加值) .
图 5 几丁质酶 Linew eaverBurk曲线图
Fig. 5 Linew eaverBurk plot of chit inase.
4 结 语
球孢白僵菌属于虫生丝状真菌, 在自然界中具
有习惯在固态支持物上生长的习性.因此,采用固态
培养方式更接近其在天然状态下的生长条件. 球孢
白僵菌产几丁质酶的能力及性质早已得到重视和研
究[ 13] , 但尚未见有其产几丁质酶固态发酵的研究报
道.从我们对黑曲霉及木霉等丝状真菌的研究结果
可知, 固态发酵与液态发酵相比具有产酶活力
高[ 2]、设备简单、生产过程容易操作等优点, 对球孢
白僵菌产几丁质酶的试验结果也是如此.此外,固态
发酵的产酶高峰期比邱立友[ 14]和夏国庆[ 17]的霉菌
液态发酵提前了 3~ 4 d, 大大缩短了发酵周期.
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作者简介 张 洁, 女, 1960 年生, 硕士, 副教授, 主要从事
发酵工程教学和研究, 发表论文 25 篇. jzhang1111@ yahoo.
com.
866 应 用 生 态 学 报 15卷