全 文 ：[ 文章编号] 　1007-3949(2007)15-01-0011-04 ·实验研究·
半边莲生物碱抑制肾性高血压大鼠
内皮素 1 mRNA 和蛋白表达
张晓玲1 , 薛 冰1 , 李莉1 , 陈 融1 , 任冬梅2 , 李瑞峰1 , 胡维诚1
(山东大学 1.医学院;2.药学院 , 山东省济南市 250012)
[ 关键词] 　病理学与病理生理学;　半边莲生物碱;　内皮素 1;　肾性高血压;　原位杂交;　免疫组织化学染色;
　放射免疫技术
[ 摘　要] 　目的　观察半边莲生物碱对肾性高血压大鼠内皮素 1 mRNA 表达 、蛋白合成和释放的影响。方法　采
用两肾一夹高血压大鼠模型 ,随机分为高血压组 、半边莲组 、卡托普利组和假手术组。用原位杂交技术观察大鼠外
周血白细胞内皮素 1 mRNA 的表达 ,应用免疫组织化学染色计数大鼠主动脉内皮细胞铺片内皮素阳性细胞率(反映
内皮素1 蛋白的合成),用放射免疫技术测定大鼠血浆内皮素的含量。结果　与假手术组比较 , 高血压组外周血白
细胞内皮素 1 mRNA 表达增强(34.64%±8.39% 比 9.34%±4.47%, P <0.05), 动脉内皮细胞合成内皮素增多
(7.42%±0.24%比 1.58%±0.24%, P<0.05), 血浆内皮素水平显著升高(221±24 ng L比 138±19 ng L , P <0.
05)。应用半边莲生物碱 8 周后 ,与高血压组比较 ,内皮素 1 mRNA 表达(20.38%±11.31%比 34.64%±8.39%, P <
0.05)、内皮素合成(3.53%±0.21%比 7.42%±0.24%, P<0.05)和血浆内皮素水平(191±21 ng L比 221±24 ng L ,
P<0.05)均受到显著抑制。结论　肾性高血压大鼠伴有内皮素表达增强 ,半边莲生物碱能抑制内皮素基因的转
录 、蛋白合成及翻译 , 对防治肾性高血压所致的血管病变具有一定作用。
[ 中图分类号] 　R363 [ 文献标识码] 　A
Lobelia Chinensis Lour Alkaloids Inhibit Expression of Endothelin-1 mRNA and Protein
in Renal Hypertensive Rats
ZHANG Xiao-Ling1 , XUE Bing1 , LI Li1 , CHEN Rong1 , REN Dong-Mei2 , LI Rui-Feng1 , and HU Wei-Cheng1
(1.School of Medicine;2.School of Pharmaceutical Sciences , Shandong Universi ty , Jinan 250012 , China)
[ KEY WORDS] 　Lobelia Chinensis Lour Akaloids;　Endothelin;　Renal Hypertension;　In Situ Hybridization;　Immuno-
histochemical Technique;　Radioimmunoassay
[ ABSTRACT] 　　Aim　To investigate the effects of the Lobelia Chinensis Lour Alkaloids(LCLA)on endothelin-1(ET-1)mR-
NA expression and endothelin synthesis and release in renal hypertensive rats(RHR).　　Methods　The glodblatt renovascular
hypertension model was induced in rats by two-kidney one clip method.　After 4 weeks the rats were divided into 3 groups , in-
cluding the hypertensive group , the captopril group and the LCLA group , while the control group was given sham-operation.　Us-
ing in situ hybridization to observe ET-1 mRNA expression in peripheral blood leucocytes.　Using immunohistochemical technique
to count positive rate of ET in “en face” preparations of arterial endothelium to reflect the synthesis of ET.　Using radioimmunoas-
say to examine the level of ET in serum.　　Results　Compared with the sham operation group , the positive rate of ET-1 mRNA
in peripheral blood leucocytes(34.64%±8.39% vs 9.34%±4.47%, P <0.05), the positive rate of ET in arterial endotheli-
um(7.42%±0.24% vs 1.58%±0.24%, P <0.05)and the plasma concentration of ET(221±24 ng L vs 138±19 ng L , P
<0.05)were increased significantly in hypertensive rats.　After treating with LCLA for 8 w , compared with the hypertensive
group , ET-1 mRNA expression(20.38%±11.31% vs 34.64%±8.39%, P<0.05), endothelin(ET)synthesis(3.53%±
0.21% vs 7.42%±0.24%, P<0.05)and release(191±21 ng L vs 221±24 ng L , P<0.05)were significantly inhibited.
　　Conclusions　The expression of ET was increased in RHR.　The LCLA can inhibit the expression of ET in the transcrip-
tional and translational level which may be effective to the preventing and treatment of the renal hypertension.
[收稿日期] 　2006-09-04　　　　[ 修回日期] 　2007-01-03
[基金项目] 　教育部高等学校博士学科点专项科研基金
(39730210);山东省自然科学基金(Q2004C03)
[作者简介] 　张晓玲 ,硕士研究生 ,研究方向为心血管病理生理学 ,
E-mail为 zhangxl2004072000@yahoo.com。通讯作者李瑞峰 ,教授 ,硕
士研究生导师 , 主要研究方向为心血管病理生理学 , 联系电话为
0531-88382044 , E-mail为 ruifeng@sdu.edu.cn。
　　研究证实 ,半边莲生物碱(Lobelia Chinensis Lour Alkaloids , LCLA)能够减少高脂血症大鼠动脉内皮
细胞内皮素 1(endothelin-1 , ET-1)的合成与释放 ,减
轻血管中膜平滑肌细胞的增殖[ 1 , 2] 。研究报道肾性
高血压大鼠血浆内皮素含量显著高于正常大鼠[ 3] ,
但该大鼠内皮素表达增强究竟是发生在翻译水平还
是转录水平鲜有报道。本研究采用肾性高血压大鼠
模型 ,从转录和翻译水平上观察该模型内皮素表达
11CN 43-1262/R中国动脉硬化杂志 2007年第 15卷第 1期
的变化 ,并探索 LCLA 对其内皮素基因和蛋白表达
及血压的影响。
1　材料和方法
1.1　药品与试剂
半边莲生物碱由本校药学院天然药物化学教研
室制备。半边莲产自广东省 ,将半边莲药材粉碎 ,粗
粉置索氏提取器中 ,加入 5倍量 95%乙醇(含适量
浓盐酸),水浴加热提取 2 h ,过滤 ,滤液减压浓缩得
流浸膏;流浸膏加适量热水混悬 ,冷却后用乙醚多次
萃取 ,得到水溶液用浓氨水调 pH 值至 8 ～ 9后乙醚
多次萃取;乙醚液加入无水硫酸钠放置过夜 ,过滤 ,
回收溶剂得黄色油状物 ,再加入1 mol L盐酸将此油
状物溶解 , 过滤 、浓缩 , 于冰箱中静置过夜 , 析出
LCLA结晶 。将 LCLA溶于二甲基亚枫(DMSO)中 ,
然后用蒸馏水稀释 ,并配成浓度为 500 mg L 溶液 ,
DMSO的最终浓度小于 0.01%。卡托普利(capto-
pril)购于山东新华制药有限公司(批号 0111008)。
1.2　动物与分组
雄性Wistar大鼠50只 , 200 ～ 240 g ,由山东省实
验动物中心提供 。随机取 10只为假手术组(无菌切
开腹壁 ,暴露肾脏 ,小心分离左肾动脉后缝合腹壁切
口 ,正常饲养),其余 40只大鼠应用两肾一夹法进行
肾性高血压模型制备[ 4] 。剥离左侧肾动脉 ,用特制
银夹(内径 0.2 mm)造成左侧肾动脉狭窄 。术后 4
周 ,尾动脉血压≥140 mmHg 者选入 ,随机分为高血
压组(9只)、LCLA 组(8只)和卡托普利组(8 只)。
术后 4周 ,高血压组和假手术组每日生理盐水 5 mL
kg 灌胃;LCLA 组每日 LCLA(500 mg L)5 mL kg 灌
胃;卡托普利组每日卡托普利 30 mg kg灌胃。
1.3　血压测定
应用尾袖法连接 RBP-1B型大鼠血压计(中日
友好临床医学研究所),测量给药前后清醒大鼠尾动
脉收缩压的变化。测压时保持大鼠尾部温度适宜 ,
以保持大鼠安静和尾动脉有搏动信号。
1.4　外周血白细胞内皮素 1 mRNA表达的检测
用药 8 周 , 严格无菌操作 ,尾端断尾取血 0.5
mL ,肝素抗凝 , 0.1%焦碳酸二乙酯(diethyl pyrocar-
bonate ,DEPC)水处理无菌 EP管 ,室温静置 2 h ,取上
层富含白细胞血浆 0.1 mL ,置 EP 管中 ,加入 4%多
聚甲醛1 mL固定 3 h , 4 000 r min 离心 5 min ,弃上
清;0.05 mol L PBS 1 mL 洗涤沉淀 2min ,4 000 r min
离心 5 min ,弃上清 ,重复 3 次;0.05 mol L PBS 0.2
mL 混匀沉淀 ,吸取白细胞混悬液 20μL ,涂片 , 37 ℃
干燥过夜 ,按本室设计的原位杂交流程操作[ 5] ,计数
3 ～ 5个高倍视野中的白细胞总数和杂交阳性白细
胞数 ,计算内皮素 1 mRNA 阳性细胞率。探针由武
汉博士德生物工程有限公司提供 。
1.5　主动脉内皮细胞内皮素水平的检测
用药8周 ,大鼠腹腔注射 1.5%戊巴比妥钠(35
mg kg体重),采用本实验室主动脉内皮细胞铺片
法[ 1] :于左颈总动脉插管 ,用0.1 mol L 磷酸缓冲液
配制的 4%多聚甲醛(pH7.2)恒压(100 mmHg)灌注 ,
持续 10 min ,剥离出主动脉置于上述固定液内 1 h。
沿纵轴剖开血管 ,按顺序切成1 cm 左右长度的动脉
段 ,内皮面朝上用钢针固定于特氟隆片上 。缓冲液
冲洗3 次 ,3%过氧化氢孵育 5 min ,滴加一抗(兔抗
内皮素血清 ,武汉博士德生物工程有限公司),4℃冰
箱过夜;滴加二抗(生物素标记羊抗兔 IgG),孵育 30
min ,过氧化酶标记的链霉卵白素孵育 60 min ,缓冲
液冲洗 , DAB 显色 30 min , 4%多聚甲醛过夜。经
35%～ 100%酒精系列脱水后 ,将标本内膜面朝下压
贴在火棉胶片上 。放入 35%酒精内 1 h后 ,剥离动
脉外膜和中膜 ,将保留在火棉胶片上的内膜标本反
转压贴在明胶片上 ,置中性缓冲固定液内 1 ～ 2 天 ,
再用醇 醚溶液溶解火棉胶 ,便得到一层腔面朝上的
内皮细胞铺片 。苏木素复染 ,酒精脱水 ,二甲苯透
明 ,中性树胶封固。光学显微镜下计算内皮细胞内
皮素阳性细胞率。
1.6　血浆内皮素活性的测定
分别在用药前和用药后 8周 ,用乙醚麻醉大鼠
后断鼠尾取血 , 放射免疫法测定血浆内皮素的含
量[ 1] 。放射免疫药盒由 301医院科技开发中心放射
免疫所提供 。
1.7　统计学处理
数据以 x±s 表示 ,进行两组间的 t检验和多组
间的方差分析 ,以 P<0.05为差异有显著性 。
2　结 果
2.1　各组大鼠尾动脉血压的变化
给药前 ,高血压组 、LCLA组及卡托普利组血压
均明显高于假手术组。用药后高血压组血压继续升
高 ,用药 4周和 8周后明显高于用药前(P <0.05 , P
<0.01);LCLA组用药后血压未发生明显变化 ,但明
显低于高血压组(P <0.05 , P<0.01);用药 4周和 8
周后 ,卡托普利组血压明显低于用药前及高血压组
(P<0.05 , P<0.01)(表 1)。
12 ISSN 1007-3949 Chin J Arterioscler , Vol 15 , No 1
表 1.各组大鼠尾动脉血压的比较(x±s , mmHg)
分　组 用药前 用药后 1 w 用药后 4 w 用药后 8 w
假手术组 116±5 115±6d 115±5d 112±3d
高血压组 151±13 160±13 168±20a 177±11b
LCLA组 154±4 146±3 152±9c 151±11d
卡托普利组 156±14 142±3a 122±10bd 122±3bd
　a 为 P<0.05, b为 P<0.01 , 与同组用药前比较;c为 P<0.05 ,
d为 P<0.01 , 与高血压组比较。
2.2　各组大鼠外周血白细胞内皮素 1 mRNA 表达
的比较
用药前 ,高血压组外周血白细胞内皮素 1mRNA
表达明显高于假手术组(29.32%±5.47%比 8.61%
±1.49%, P <0.05)。用药 8周时 ,LCLA组 、卡托普
利组和假手术组外周血白细胞内皮素 1 mRNA表达
明显高于高血压组(P <0.05);LCLA组与假手术组
之间 、卡托普利组与假手术组之间差异均有显著性
(P<0.05);LCLA组和卡托普利组之间差异无显著
性(P>0.05)(表 2和图 1)。
表 2.用药 8周时各组大鼠外周血白细胞内皮素 1 mRNA 阳
性细胞率及内皮细胞内皮素阳性率的比较(x±s)
分　组 内皮素 1 mRNA阳性细胞率
内皮素阳性
细胞率
假手术组 9.34%±4.47%b 1.58%±0.24%
高血压组 34.64%±8.39%a 7.42%±0.24%a
LCLA 组 20.38%±11.31%ab 3.53%±0.21%ab
卡托普利组 19.95%±5.37%ab 4.48%±0.19%ab
a为 P<0.05 ,与假手术组比较;b为 P<0.05 ,与高血压组比较。
图1.各组大鼠外周血白细胞内皮素 1 mRNA 表达的比较(×1 000)　　胞浆内深蓝着色为内皮素 1 mRNA杂交信号。A 为假手术组 ,
B为对照组 , C为 LCLA组 , D为卡托普利组。
2.3　各组大鼠主动脉内皮细胞内皮素阳性细胞率
的比较
假手术组内皮素阳性细胞率较低;高血压组内
皮素阳性细胞率显著增高(P <0.05);LCLA组内皮
素阳性细胞率与高血压组以及卡托普利组比较明显
降低(P<0.05)(表 2和图 2)。
图2.各组大鼠主动脉内皮细胞内皮素阳性细胞率的比较(×400)　　胞浆内棕黄色为内皮素阳性信号。A为假手术组 , B为对照组 ,
C为 LCLA组 , D为卡托普利组。
2.4　各组大鼠血浆内皮素浓度的比较
用药前 ,高血压组 、LCLA 组及卡托普利组血浆
内皮素含量均显著高于假手术组(P <0.05)。用药
8周后 ,LCLA组血浆内皮素浓度显著低于高血压组
和卡托普利组(P <0.05),但高于假手术组(P <0.
05);卡托普利组血浆内皮素含量高于假手术组 ,与
高血压组比较差异无显著性(P>0.05)(表 3)。
13CN 43-1262/R中国动脉硬化杂志 2007年第 15卷第 1期
表 3.各组大鼠血浆内皮素含量的比较(x±s , ng L)
分　组 用药前 用药后 8 w
假手术组 134.6±25.6 138.5±18.6
高血压组 174.2±35.6a 220.9±24.4a
LCLA组 167.3±27.5a 191.1±20.8abc
卡托普利组 179.4±24.8a 210.4±9.9a
　a 为 P<0.05, 与假手术组比较;b为 P<0.05 , 与高血压组比较;
c为 P<0.05, 与用药前 LCLA组比较。
3　讨 论
肾性高血压指各种肾脏疾患及肾动脉或其主要
分支狭窄所致的高血压 ,主要分为容量依赖性高血
压和肾素依赖性高血压两类。由肾实质性病变致肾
脏排泄钠 、水功能障碍 ,造成水 、钠潴留 ,可引起容量
依赖性高血压。肾动脉狭窄或少数肾实质病变的患
者 ,由于肾脏缺血导致肾素—血管紧张素—醛固酮
系统激活 ,则引起肾素依赖性高血压。本研究采用
的两肾一夹肾性高血压大鼠 ,为一接近肾素依赖性
高血压的动物模型。
有研究显示 ,肾性高血压大鼠除肾素—血管紧
张素系统激活外 ,血浆内皮素含量升高[ 3] ,提示内皮
素参与了肾性高血压的发病过程。肾素 —血管紧张
素系统中的主要缩血管效应分子 —血管紧张素 Ⅱ
(angiotensinⅡ Ang Ⅱ)与内皮素均为强效缩血管物
质 ,且二者缩血管的生物效应还可能存在协同作用 。
Rajagopalan等[ 6] 研究发现 ,内皮素可促进血浆中 Ang
Ⅰ转变为Ang Ⅱ ,Ang Ⅱ也能促进内皮细胞中内皮
素1的基因表达和蛋白释放 。
内皮素与自然界存在的某些生物毒素(例如蛇
毒 、蝎毒和蜂毒)有一定亲缘关系[ 7] 。蝰毒素(sarafo-
toxin ,SRTX)是从蛇毒中提取的一种毒素 , 可分为
SRTX-a(S6a)、SRTX-b(S6b)、SRTX-c(S6c)和 Btx
(S6c)4个亚型。对内皮素的 4种亚型进行氨基酸
序列分析发现 ,所有这些异构肽均包括 21个氨基
酸 ,其一级结构具有明显的同源性 ,至少有 60%～
80%氨基酸同源 , 而且有相同的 C-末端。研究证
实[ 8] ,内皮素的C-末端特别是Trp21 、两个二硫键 、氨
基和羧基端以及 Asp8 和 Glu10 的羧酸组对它的生
物学活性起重要的作用 ,构成了 SRTX和内皮素表
面的“共同和基本”的生物活性位点 。SRTX和内皮
素构成一组同源性异构肽家族 ,竞争性结合相同的
G蛋白偶联受体 ,通过 1 , 4 , 5-三磷酸肌醇(IP3)和
Ca
2+钙调蛋白激酶途径 ,引发各类生物学效应[ 9] 。
因此 ,从抗蛇毒中药中探寻防治动脉粥样硬化和高
血压等内皮素相关性疾病的方法是可行的[ 10] 。
本研究发现 ,高血压大鼠于肾动脉狭窄 4周时
动脉血压明显升高 ,至狭窄 12周时动脉血压进一步
升高 ,同时内皮素 1 mRNA及内皮素表达均较假手
术组明显增强 ,提示内皮素增加是其高血压形成和
维持的参与因素。应用半边莲生物碱 8周 ,体内内
皮素 1 mRNA表达 、蛋白合成和释放均显著低于高
血压组(P <0.05),显示半边莲生物碱能明显抑制
该肾性高血压大鼠的内皮素表达 。尽管半边莲生物
碱不能有效降低大鼠的动脉血压 ,但与高血压组比
较却能有效地抑制大鼠血压的继续升高。肾素 —血
管紧张素系统的激活可能参与本肾性高血压大鼠的
发病[ 11] ,半边莲生物碱的降压作用不如卡托普利明
显的结果也说明了这一点。本实验提示 ,内皮素表
达增强参与了肾性高血压的发病过程 ,应用半边莲
生物碱能拮抗内皮素的合成与释放 ,对肾性高血压
病程的进展有缓解作用 ,可能对阻止高血压造成的
血管内皮损伤及血管重塑和控制肾性高血压的程度
等有一定辅助治疗作用 ,为肾性高血压等心血管疾
病的治疗提供了新的实验依据。
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(此文编辑　朱雯霞)
14 ISSN 1007-3949 Chin J Arterioscler , Vol 15 , No 1