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狭叶崖爬藤对类风湿关节炎大鼠的免疫调节作用



全 文 :·风湿免疫性疾病用药专栏·
狭叶崖爬藤对类风湿关节炎大鼠的免疫调节作用*
姚文琴,王定瑜,刘元忠,党荣敏,王恒,谢洪书
(黔南民族医学高等专科学校,都匀 558003)
摘 要 目的 探讨狭叶崖爬藤在治疗类风湿关节炎中的免疫调节作用。方法 60 只 SD大鼠按随机数字法分为
正常对照组,模型对照组,狭叶崖爬藤大、中、小剂量组(200,100,50 mg·kg -1) ,雷公藤多苷组(给予雷公藤多苷) ,每组
10 只。除正常对照组外,其他 SD大鼠用牛Ⅱ型胶原蛋白(CⅡ)诱导建立胶原性关节炎(CIA)模型,观察对 CIA 模型大
鼠脏器指数、血清中白细胞介素(IL)-1β、IL-6、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和抗 CⅡ含量的影响。结果 狭叶崖爬藤小剂
量组、中剂量组肾脏指数与模型对照组比较均差异有统计学意义(P < 0. 05)。狭叶崖爬藤大剂量组脾脏指数与正常对
照组比较差异有统计学意义(P < 0. 05)。模型对照组 IL-1β、IL-6、TNF-α 和抗 CⅡ含量均显著高于正常对照组,而狭叶
崖爬藤中剂量组、大剂量组与模型对照组比较,血清中 IL-1β、IL-6、TNF-α 水平均降低,差异有统计学意义(P < 0. 01)。
狭叶崖爬藤小剂量组、中剂量组、大剂量组与模型对照组比较能显著降低抗 CⅡ抗体含量。结论 狭叶崖爬藤有免疫调
节作用,可用于治疗类风湿关节炎,具有开发利用价值。
关键词 狭叶崖爬藤;关节炎,类风湿;细胞因子;免疫调节作用
中图分类号 R282. 71;R593. 22 文献标识码 A 文章编号 1004 - 0781(2016)02 - 0141 - 03
DOI:10. 3870 / j. issn. 1004-0781. 2016. 02. 008
Immunomodulatory Effects of Tetrastigma Hypoglaucum Planch on Rats with
Rheumatoid Arthritis
YAO Wenqin,WANG Dinyu,LIU Yuanzhong,DANG Rongmin,WANG Hen,XIE Hongshu(Qiannan Medical
College for Nationalities,Duyun 558003,China)
ABSTRACT Objective To investigate the immunomodulatory effects of Tetrastigma hypoglaucum Planch in the treatment
of rheumatoid arthritis. Methods Sixty SD rats were ramdomly divided into normal control group,model control group,low-,
middle-and high-dose Tetrastigma hypoglaucum Planch groups (50,100 and 200 mg· kg -1,respectively) ,and tripterygium
glycosides tablet group. Except for normal control group,rheumatoid arthritis model was established by using bovine type Ⅱ
collagen in SD rats of the other groups. Organ index,plasma levels of IL-1β,IL-6,TNF-α and anti-CⅡ in rat rheumatoid arthritis
models were evaluated. Results The kidney index of the low-dose /middle-dose Tetrastigma hypoglaucum Planch groups were
significantly different from that of the model control group (P < 0. 05). Significant difference was also found in the spleen index
between the high-dose Tetrastigma hypoglaucum Planch group and the normal control group (P < 0. 05). The plasma levels of IL-
1β,IL-6,TNF-α and anti-CⅡ antibody were significantly higher in the model control group than in the normal control group.
Meanwhile,the plasma IL-1β,IL-6 and TNF-α levels of the middle-dose /high-dose Tetrastigma hypoglaucum Planch groups were
significantly lower than those of the model group (P < 0. 01). The levels of anti-CII antibody were significantly lower in the low-,
middle-and high-dose Tetrastigma hypoglaucum Planch groups than in the model control group. Conclusion It is worthwhile to
explore and develop Tetrastigma hypoglaucum Planch since it possesses immunomodulatory effects and may be applied in the
treatment of rheumatoid arthritis.
KEY WORDS Tetrastigma hypoglaucum Planch;Arthritis,rheumatoid;Cytokines;Immunomodulatory effect
狭叶崖爬藤为葡萄科植物崖爬藤(Tetrastigma
hypoglaucum Planch)的全株,药材名为五爪金龙,其性
温、味辛,归冷、热二经。主要功效为祛风除湿,活血通
络,接骨生肌,可用于治疗风寒湿痹、跌打损伤、瘀血内
收稿日期 2015 - 04 - 03 修回日期 2015 - 06 - 16
基金项目 * 黔南州科技局社会发展计划项目(黔南科合
社字 201324) ;黔南医专科研基金资助项目(QNYZ201321)
作者简介 姚文琴(1971 -) ,女,贵州石阡人,副教授,学
士,研究方向:病原生物学与免疫学教学与科研。电话: (0)
18385484880,E-mail:qnyzywq@ 163. com。
停等疾患,且药源广泛,无明显毒副作用[1]。贵州苗
族民间长期用该药治疗类风湿关节炎(rheumatoid
arthritis,RA) ,但相关实验研究笔者尚未见报道。RA
是严重影响人类健康的慢性病,受累关节疼痛、肿胀、
功能下降,病变呈持续、反复发作过程,属于中医“痹
证”范畴。药物治疗常通过抗炎、免疫调节及改善微
循环功能达到治疗效果,近年来寻求有效治疗 RA 的
民族药成为热门课题。笔者在本研究用牛Ⅱ型胶原蛋
白(collagen typeⅡ,CⅡ)诱发胶原性关节炎(collagen-
induced arthritic,CIA)模型观察狭叶崖爬藤对实验性
·141·医药导报 2016 年 2 月第 35 卷第 2 期
类风湿性关节炎大鼠的免疫调节作用,分析并探讨
RA可能的发病机制,为研发抗 RA新药奠定基础。
1 材料与方法
1. 1 材料
1. 1. 1 实验动物 无特定病原体(SPF)级 Sprague-
Dawley(SD)大鼠 60 只,雌雄各半,体质量 160 ~ 200
g,由第三军医大学实验动物中心提供,动物合格证编
号:002032,实验动物生产许可证号:SCXK(渝)2012-
0003。按每个大鼠笼 5 只大鼠雌雄分开饲养,自由进
食饮水,自然光照节律。饲料由重庆腾鑫生物技术有
限公司提供。
1. 1. 2 药物 狭叶崖爬藤采自贵州省三都县打渔乡,
经黔南民族医专药学系魏学军副教授鉴定为葡萄科植
物崖爬藤(Tetrastigma hypoglaucum Planch)的全株,药
物提取采用水提法:称取干燥狭叶崖爬藤粉末 50. 0 g,加
入纯化水1 000 mL,加热至沸腾,文火煎煮2 h,减压滤过,
将滤液稀释至 1 000 mL,分别取一定体积配制成浓度(相
当原药材)为 5. 0,2. 5,1. 25 mg·mL -1储备液备用。
1. 1. 3 试剂与仪器 卡介苗(Bacillus Calmette-Guerm,
BCG,上海生物制品研究所,批号:201112a072-1);CⅡ
(Sigma公司,批号:112D055);弗氏不完全佐剂(Freund's
adjuvant incomplete,FICA)由本实验室自制;雷公藤多苷
片(黄石飞云制药有限公司,规格:每片 10 mg,批号:
20130501),人日用量为 1. 0 ~ 1. 5 mg·kg -1·d -1,按人
60 kg体质量折算为大鼠等效剂量,用纯化水配制;白细胞
介素(IL)-1β、IL-6 、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和抗 CⅡ试
剂盒购自北京索莱宝科技有限公司,批号:201406;酶标仪
型号为mindrady MR-96A。
1. 2 方法
1. 2. 1 CⅡ诱导 CIA 模型的建立 无水羊毛脂与液
体石蜡按 1∶2 混合,高压灭菌后备用,制成 FICA。
BCG按 2 mg·mL -1逐滴加入 FICA 进行乳化得完全
弗氏佐剂(FCA)。CⅡ溶于 0. 1 mol·L -1醋酸中,使
终浓度为 2 mg·mL -1。将 CⅡ与 FCA 充分乳化后每
只大鼠右足掌、尾根部及背部皮内注射 0. 2 mL,7 d 后
加强一次[2]。根据大鼠关节红肿程度、范围及关节肿
大、变形情况,采用五级评分法[3]进行关节炎指数评
分,评分标准,0 分:无关节炎 ;1 分:轻微症状,但踝关
节或腕出现红肿等现象;2 分:踝关节或腕中度红肿现
象;3 分:整个爪包括趾(指)在内都严重红肿;4 分:关
节严重肿胀并伴有功能障碍。每间隔 4 d 用数显游标
卡尺测量大鼠双足跖部厚度,观察关节肿胀受累情况。
1. 2. 2 动物分组及给药 SD大鼠按体质量高、中、低
随机分为 6 组,即正常对照组,模型对照组,雷公藤多
苷组,狭叶崖爬藤大剂量组、中剂量组、小剂量组,每组
10 只(雌雄各 5 只)。除正常对照组外,其他组按
“1. 2. 1”项方法造模。正常对照组未造模的正常大鼠
灌胃给予等体积纯化水;模型对照组大鼠灌胃给予等
容量纯化水;狭叶崖爬藤大剂量组、中剂量组、小剂量
组分别给予狭叶崖爬藤生药 200,100,50 mg·kg -1;雷
公藤多苷组给予雷公藤多苷片溶液 6 mg·kg -1·
d -1。均灌胃给药,给药体积为 20 mL·kg -1。大鼠于
第 2 次免疫 7 d后即开始灌胃给药,连续给药 14 d。
1. 2. 3 大鼠脏器指数检测 最后 1 次给药后处死大
鼠,称定体质量,取出肝、脾、肾、胸腺等脏器称质量并
记录结果,计算脏器指数。脏器指数(%)=脏器湿质
量 /体质量 × 100%。
1. 2. 4 血清中 IL-1β、IL-6、TNF-α 和抗 CⅡ含量测
定 连续灌胃 2 周,造模第 28 天,大鼠股动脉取血离
心取上清液,在 - 20 ℃下保存待测。IL-1β、IL-6 、
TNF-α和抗 CⅡ采用酶联免疫吸附测定(ELISA)法按
试剂盒说明书操作。
1. 2. 5 统计学方法 采用 SPSS18. 0 版软件进行数
据统计。数据以均数 ±标准差(x ± s)表示,组间比较
用 t检验,以 P < 0. 05 为差异有统计学意义。
2 结果
2. 1 对 CIA大鼠脏器指数的影响 结果见表 1。狭
叶崖爬藤小剂量、中剂量组肾脏指数与模型对照组比
较均略有升高,差异有统计学意义(均 P < 0. 05) ;狭叶
崖爬藤大剂量组脾脏指数与正常对照组比较差异有统
计学意义(P < 0. 05) ,各组间肝脏指数及胸腺指数比
较差异无统计学意义。
2. 2 对 CIA大鼠血清中 IL-1β、IL-6、TNF-α和抗 CⅡ含
量的影响 结果见表2。模型对照组 IL-1β、IL-6、TNF-α
和抗 CⅡ含量均显著高于正常对照组,这些血清中大量
炎性因子出现结合关节指数评分及双足跖肿胀程度等,
提示造模成功;狭叶崖爬藤中、大剂量组与模型对照组
比较,血清中 IL-1β、IL-6、TNF-α 水平均降低,差异有统
计学意义(P <0. 01) ,与雷公藤多苷组比较其结果也是
如此;狭叶崖爬藤小剂量组、中剂量组、大剂量组与模型
对照组比较能显著降低抗 CⅡ抗体含量。
3 讨论
大量资料证实中药可干预 RA 患者体内细胞因子
水平,常用中药有雷公藤、白芍、青蒿、青风藤、川芎、昆
明山海棠、马钱子[4]等。王绍明[5]、司有奇等[6]用狭
叶崖爬藤治疗 RA 有效,但缺乏基础实验依据。刘东
等[7]利用各种色谱技术从狭叶崖爬藤地上部分分离
并鉴定 10 种化合物,分别为 β-谷甾醇、棕榈酸、正二
·241· Herald of Medicine Vol. 35 No. 2 February 2016
表 1 6 组大鼠脏器指数测定值
Tab. 1 Determination of organ indexes in six groups of
rats %,x ± s,n = 10
组别 肝 肾
正常对照组 2. 70 ± 1. 24 0. 69 ± 0. 33
模型对照组 3. 09 ± 0. 25 0. 78 ± 0. 06
雷公藤多苷组 3. 27 ± 0. 29 0. 84 ± 0. 12
狭叶崖爬藤
小剂量组 3. 13 ± 0. 30 0. 90 ± 0. 08* 1
中剂量组 3. 23 ± 0. 51 0. 85 ± 0. 06* 1
大剂量组 3. 36 ± 1. 13 0. 91 ± 0. 28
组别 脾脏 胸腺
正常对照组 0. 20 ± 0. 08 0. 14 ± 0. 08
模型对照组 0. 24 ± 0. 03 0. 20 ± 0. 04
雷公藤多苷组 0. 31 ± 0. 21 0. 19 ± 0. 06
狭叶崖爬藤
小剂量组 0. 26 ± 0. 05 0. 17 ± 0. 05
中剂量组 0. 23 ± 0. 02 0. 19 ± 0. 03
大剂量组 0. 30 ± 0. 08* 2 0. 15 ± 0. 07
与模型对照组比较,t = 3. 51,2. 61,* 1P < 0. 05;与正常对照
组比较,t = 2. 80,* 2P < 0. 05
Compared with model control group,t = 3. 51,2. 61,* 1P < 0.
05 ;compared with normal control group,t = 2. 80,* 2P < 0. 05
十五烷、胡萝卜苷、白藜芦醇、没食子酸、没食子酸乙
酯、儿茶素、7-氧-没食子酰基-儿茶素和 3,3-L-二甲氧
基鞣花酸-4-氧-葡萄糖苷,其中谷甾醇、白藜芦醇、没食
子酸、没食子酸乙酯、儿茶素等具有抗炎、免疫调节及
改善微循环功能。
本研究通过实验证实狭叶崖爬藤对 CIA 大鼠的
影响,胸腺和脾脏均为免疫器官,通过实验了解狭叶崖
爬藤对其质量影响一定程度上从不同层面可间接反映
其免疫调节作用。在 RA的发病研究中作为促炎因子
IL-1β、TNF-α可激活单核-巨噬细胞、内皮细胞、T细胞
并分泌趋化因子,诱导和募集更多的炎性细胞浸润,通
过多环节、多途径引起局部关节骨与软骨炎症破坏。
IL-6 有促进 B淋巴细胞分化并产生多克隆 IgG,从而
引起机体体液免疫调节紊乱,形成多种自身抗体,进一
步激活补体,破坏正常滑膜,引起损伤性效应并造成恶
性循环[8]。本实验结果初次证实狭叶崖爬藤用于治
疗 RA随用药剂量的增加能够有效抑制 CIA大鼠血清
中 IL-1β、IL-6、TNF-α 和抗 CⅡ抗体含量。分析其原
因可能是通过下调血清中这些细胞因子水平,在关节
局部能降低血管通透性,减少免疫复合物沉积,有效缓
解关节肿胀减轻病痛,可用于治疗 RA,但确切机制还
有待于进一步研究证实。
表 2 6 组大鼠血清中 IL-1β、IL-6、TNF-α和抗 CⅡ含量
的测定值
Tab. 2 Results of the serum level of IL-1β,IL-6,TNF-α
and anti-C Ⅱin six groups of rats x ± s,n = 10
组别
TNF-α IL-1β
(pg·mL -1)
正常对照组 108. 26 ± 10. 78 27. 17 ± 3. 89
模型对照组 224. 44 ± 2. 96 57. 72 ± 2. 47
雷公藤多苷组 249. 78 ± 13. 81* 1 55. 78 ± 9. 74
狭叶崖爬藤
小剂量组 227. 50 ± 15. 47 59. 44 ± 5. 03
中剂量组 199. 84 ± 17. 73* 1* 3 46. 74 ± 5. 64* 1* 3
大剂量组 144. 41 ± 12. 05* 1* 3 39. 03 ± 4. 63* 1* 3
组别
IL-6 /
(ng·L -1)
抗 CⅡ /
(ng·mL -1)
正常对照组 87. 69 ± 9. 76 23. 00 ± 1. 34
模型对照组 132. 14 ± 11. 85 41. 35 ± 2. 39
雷公藤多苷组 116. 72 ± 7. 78 39. 19 ± 1. 80* 2
狭叶崖爬藤
小剂量组 130. 82 ± 7. 27 37. 78 ± 2. 55* 1
中剂量组 108. 36 ± 5. 69* 1* 3 31. 83 ± 0. 86* 1* 3
大剂量组 94. 60 ± 12. 94* 1* 3 32. 61 ± 6. 12* 1* 3
与模型对照组比较,t = 5. 67,3. 15,4. 32,5. 64,5. 72,11.
87,20. 40,11. 27,6. 76,4. 20,* 1P < 0. 01,t = 2. 29,* 2P < 0. 05;
与雷公藤多苷组比较,t = 7. 03,2. 54,2. 74,11. 67,18. 18,4. 91,
4. 63,3. 26,* 3P < 0. 01
Compared with model control group,t =5. 67,3. 15,4. 32,5. 64,5.
72,11. 87,20. 40,11. 27,6. 76,4. 20,* 1P <0. 01,t =2. 29,* 2P <0. 05;
Compared with tripterygium glycosides group,* 3P <0. 01
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·341·医药导报 2016 年 2 月第 35 卷第 2 期