全 文 ：应用与环境生物学报　1998 , 4(4):335～ 339 　 　
Chin.J.Appl.Environ.Biol. 　 1998-12-25
　
收稿日期:1997-11-17　　接受日期:1998-03-31
＊通迅联系人 Author for correspondence
紫羊茅根中铜结合肽的分离和纯化
黄玉山＊　　邱国华
(＊香港九龙城市大学生物及化学系　香港)
(中山大学生物工程研究中心　广州　510275)
摘　要　利用 1次 Sephadex G-50凝胶过滤和 2次 QAE Sephadex A-25离子交换层析的方法 , 从最后 6 d用
CuCl2 处理(ρ=20 mg/ L)、20 d 龄的紫羊茅(Festuca rubra cv.M erlin)根中分离纯化了 1个铜结合肽(CuBP-
2a), 该肽在 Superdex Peptide HR 10/ 30预装柱的 FPLC凝胶过滤中在λ254nm 处只出现一个峰 , 经分子量标
准曲线估计 , 其 M r约为 1 400 , 在 Delta-Pak C18的反相HPLC中 , 在 λ254 nm 处也只有 1个紫外吸收峰值 ,
这都说明该肽已经达到了较高的的纯度.通过光谱分析 , 发现该肽的最大紫外吸收值在 248.1 nm 处.对 Cu结
合物在植物体内的存在状态进行了讨论.
关键词　紫羊茅;铜诱导;铜结合肽;分离和纯化
中图法分类号　Q945.14 + Q514.3 ∶ O614.121
ISOLATION AND PURIFICATION OF METAL-BINDING
PEPTIDE FROM COPPER-TREATED
FESTUCA RUBRA cv.MERLIN ROOTS
WONG Yuk-Shan＊ &QIU Guohua
(＊ Department of B iology and Chemist ry , City Universi ty of Hong Kong , Kow loon , Hong Kong)
(Biotechnology Research Center , Zhongshan Un iversity , Guangzhou　510275)
Abstract　Through a gel filtration chromatography on Sephadex G-50 and twice on FPLC ion ex-
change chromatography on QAE Sephadex A-25 , a metal-binding peptide(CuBP-2a)w as purified from
20-day-old F.rubra roots trea ted by copper (supplied with CuCl2) at the concentration of 20 mg/ L
during the last 6 days.CuBP-2a show ed a sing le peak at 254 nm and w as about 1 400 doltons after the
calibration by standard molecular w eight markers in FPLC gel filtration on pre-packed Superdex Peptide
HR 10/ 30 column.Its purity w as judged by the single peak at 254 nm in the elution profile of reversed
phase HPLC on Delta-Pak C18.By UV absorbance spectrum analysis , the peptide showed the maximal
absorbance at 248.1nm.The metal-binding peptides in plant cells are also disscussed.
Key words　Festuca rubra cv.Merlin;copper treatment;copper-binding peptide;isolation and purifi-
cation
当植物处于过量的重金属如 Cd2+, Cu2+或 Zn2+的环境中时 , 会产生植物螯合肽(Phy tochelatin , PC)以
结合进入细胞的金属 , 并参与金属的解毒.最初发现的 PC 的结构为(γGlu-Cys)n Gly[ 1 , 2] , 广泛存在于大多
数的高等植物 、藻类和一些酵母中;后来在一些豆科植物中还发现有同型 PC(γGluCys)n βAla[ 3 , 4] ;而羟甲基
PC 则在一些禾本科植物中产生[ 5] .在重金属的诱导下 , 植物体内激活的 PC 合成酶迅速合成 PC[ 6 , 7] .
紫羊茅对Zn、Pb[ 8]和 Cu 、Cd[ 9]具有较高的抗性 , 但尚未从紫羊茅中分离出对重金属抗性起作用的物质.
为了进一步研究紫羊茅对重金属抗性的机制 , 本文利用凝胶过滤和离子交换的方法 , 从铜处理的紫羊茅根
中纯化了铜结合肽.
植物重金属结合物的提取 , 一般先将粗提液进行凝胶过滤层析 , 收取其中的金属结合物再进行离子交
换层析;也有的方法是先用离子交换后用凝胶过滤层析[ 10] .
1　材料和方法
1.1　实验材料
紫羊茅(Festuca rubra)重金属抗性品种 Merlin 种子的获得 、发芽及培养见文献[ 9] .Sephadex G-50 , QAE
Sephadex A-25 、Superdex Peptide HR 10/ 30 预装柱和凝胶过滤层析所用的分子量标准试剂盒都购自瑞典
Pharmacia LKB 公司;反相(RP)HPLC 所用的 Delta-Pak C18 柱(d =30 nm , 2 mm×150 mm)购自美国Waters
公司;超滤所用的装置及 YM1 滤膜 , 由美国 Amicon 公司生产.
1.2　铜结合复合物的提取
20 d 龄(最后 6 d 用 20 mg/ L的 CuCl2 处理)的紫羊茅根 , 先置于研钵中加液氮研磨成粉 , 然后按 2 mL/g
的量用预冷至 4℃含 10 mmol/ L 巯基乙醇的 50 mmol/ L PB(磷酸缓冲液 , pH 7.4)抽提 , 接着用 4 层纱布过
滤 , 滤液在 4℃ 12 000 r/ min 离心 15 min , 上清液再用冷冻干燥浓缩.
1.3　铜结合肽的纯化
紫羊茅根的蛋白质粗提浓缩液用膜孔径为 0.45μm 的滤膜过滤.Sephadex G-50 柱先用 10 mmol/ L的 PB
(pH 7.4)平衡 , 蛋白质粗提浓缩液上柱 , 用相同的缓冲液洗脱 , 流速 v 约为 0.5 m L/min.收集的样品直接
进行原子吸收光谱和λ254 nm 、280 nm 的紫外吸收分析.用已知 M r 的标准蛋白复合物制备该 G-50 柱的 M r
标准曲线:碳酸酐酶(M r=29 000), 细胞色素 C(M r=12 400), 抑肽酶(M r=6 500)和维生素 B12(M r=1
355).
合并含铜的洗脱组分 , 并冻干浓缩 , 浓缩样品在 FPLC 层析系统的 QAE Sephadex A-25 阳离子交换柱上
进行纯化 , 洗脱缓冲液为 10 mmol/ L PB(pH 7.4), 洗脱 v=2 m L/min , 盐线性梯度为 0 ～ 2 mol/ L 的 NaCl.
洗脱时监测 254 nm 的紫外吸收值(D254 nm).收集洗脱液 , 并用原子吸收光谱仪测定含铜量.含铜组分按此方
法在 QAE Sephadex A-25 上再纯化 1次.
1.4　铜结合肽的脱盐和浓缩
最后纯化的样品用超滤进行脱盐及浓缩 , 使用的滤膜为 YMI , 可以除去 M r<1 000 的分子.当超滤瓶中
剩余少量溶液时 , 就终止过滤.收集保存样品.
1.5　铜含量的测定
所有样品的铜含量都在原子吸收光谱仪(Z-8200 Polarized Zeeman , Hitachi , Japan)上测定 , 火焰(Flame)
方式和石墨(Graphite)方式分别用于测定ρ(Cu)/ mg·L-1和 ρ(Cu)/μg·L-1级的铜含量.稀释铜参考标准(1
000 μg/m L , VWR Scientific Company , USA), 用于制作标准曲线.
1.6　蛋白质含量的测定
使用 Bio-Rad Protein Assay KitⅡ试剂盒 , 按其说明书上的方法进行 , 在样品和试剂混合后的 5 ～ 60 min
的范围内测定 595 nm 的吸收值.牛血清白蛋白(BSA)作为对照(CK).
1.7　铜结合多肽的一些特性
1.7.1　M r 的估算　　将纯化的铜结合肽在预装柱 Superdex Peptide HR10/30上进行 FPLC 的凝胶过滤 , 用
10 mmol/ L PB(pH 7.4)洗脱 , v 为 1 mL/ min , 并用已知 M r的蛋白质(细胞色素 , 抑肽酶 , 维生素 B12)作为
标准.
1.7.2 　光谱分析　　铜结合肽在 Delta-Pak C18 上进行反相 HPLC 时 , Pho todiode Assay Detector (Waters
996 , USA)用于监测该肽在 200 ～ 600 nm 范围的吸收值.反相 HPLC 的洗脱缓冲液:Ⅰ :(A)10 mmol/ L PB ,
pH 7.4;(B)80%乙腈+20% 10mmol/ L PB(pH 7.4).Ⅱ:(A)0.05%(φ)TFA(三氟乙酸)的 Milli-Q 水 ,
(B)0.05%(φ)TFA 的乙腈.洗脱 v=0.5 mL/ min , 线性梯度:0～ 15%B , 洗脱 15min.
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2　结果
2.1　凝胶过滤层析
铜处理的 FD 紫羊茅根 105 g , 在液氮中研磨成粉 , 加入 210 mL PB 抽提.经纱布过滤 、离心后 , 用冷冻
干燥机浓缩成 26 mL 粗提液 , 用膜孔径为 0.45μm 滤膜过滤后 , 分 3次在 Sephadex G-50 上进行凝胶过滤层
析 , 3 次层析的结果相同 ,见图 1A , 主要有3 个蛋白质峰 , 经检测 , 其中最小的一个峰含有很高的铜 , 定名为
CuBP.合并这些含铜量高的组分 , 用冻干机进行浓缩.用相同的方法 , 将 M r 标准物在 G-50 上进行凝胶过
滤 , 按该产品的说明书 , 制成标准曲线 , 如图 1B.经比较 , M r(CuBP)≈20 000.
图 1　蛋白质粗提液的 S ephadex G-50凝胶过滤层析(A)及其 M r标准曲线(B)
Fig.1　Gel filt ration of protein crude ext ract on S ephadex G-50(A)and i ts molecular calibration curve(B)
2.2　离子交换层析
经冻干浓缩 、透析脱盐的 CuBP 样品 , 放在FPLC 系统上进行 QAE A-25的离子交换层析 , 洗脱出CuBP-
1 、CuBP-2、CuBP-3 三个蛋白质峰 , 经原子吸收光谱分析 , 几乎所有的铜都集中在 CuBP-2 上 , 其它则不含(如
图 2A).合并 CaBP-2 洗脱组分 , 浓缩脱盐后再在 QAE A-25 上作一次离子交换层析 , 结果 , 仍洗脱出两个蛋
白峰(如图 2B), 经铜含量分析 , 只是 CuBP-2a含有铜.收集合并含此峰的组分.CuBP-2a的纯化步骤见表 1.
图 2　CuBP(A)和 CuBP-2(B)在 QAE Sephadex A-25柱上 FPLC离子交换层析
Fig.2　FPLC ion exchange ch romatography of CuBP(A)and CuBP-2a(B)on QAE Sephadex A-25 column
3374期 黄玉山等:紫羊茅根中铜结合肽的分离和纯化 　　
表 1　CuBP-2a的提纯结果
Table 1　Purification of CuBP-2a
处理
Treatment
V/mL
总 铜
T otal copper
(m/μg)
总蛋白
Total protein
(m/mg)
铜/蛋白
Copper/ protein
(w/ 10-3)
回收率
Recovery
(w/ %)
纯化倍数
Purif ication
粗提液 Crude ext ract 26 3900 872.206 4.471 100 1
凝胶过滤 G-50 Gel f ilt ration 10 720 60.884 11.826 18.46 2.645
离子交换(I)QAE ion exchange(I) 10 480 15.287 31.399 12.31 7.022
离子交换(Ⅱ)QAE ion exchange(Ⅱ) 10 440 0.761 525.624 10.25 117.552
将纯化的 CuBP-2a在 Superdex Peptide HR 10/ 30 预装柱上进行 FPLC 凝胶过滤层析 , 结果如图 3A;用
相同的方法将 M r 标准进行层析 , 制成标准曲线如图 3B , 经计算 , CuBP-2a 的 M r≈1 400.根据此结果 , 将
CuBP-2a 用超滤进行浓缩和脱盐 , 选用能滤去 M r<1 000 的分子的 YMI 滤膜.
图 3　CuBP-2a的 Superdex Peptide HR 10/ 30 FPLC凝胶过滤层析(A)及其 M r标准曲线(B)
Fig.3　FPLC Gel f ilt ration of CuBP-2a on Superdex Peptide HR 10/ 30 column(A)and i ts m olecular calibration curve(B)
2.4　反相 HPLC和光谱分析
纯化的CuBP-2a在Delta-Pak C18 反相柱上 , 用 A、B 两种不同的溶剂系统来洗脱 , 在 254 nm 处均只出现
1 个吸收峰(如图 4a);根据 Pho todiode Assay De tecto r所作的光谱分析表明 , CuBP-2a在两种不同的溶剂系统
下均是在λ248.1 nm 处表现出最大的吸收值(如图 4b).
图 4　CuBP-2a的 Delta-Pak C18 RP-HPLC(a)及光谱分析(b)
Fig.4　Elution profile of RP-HPLC on Delta-Pak C18(a)and spect rum analysis(b)of CuBP-2a
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3　讨论
紫羊茅 Mer lin 对锌 、铅[ 8]和铜 、镉[ 9]的抗性及其一些生理生化[ 11 ～ 13] 的研究已有报道 , 但仍无从 Merlin
中分离出其中对重金属抗性起作用的物质.本文利用 1 次 Sephadex G-50 凝胶过滤层析和 2 次 QAE Sephadex
A-25 离子交换层析的方法 , 从铜处理的 Merlin 根中分离纯化了 1 个 M r≈1 400 的铜结合肽 CuBP-2a , 该肽
在反相 HPLC 的两个溶剂系统和凝胶过滤层析中均在 λ254 nm 处只出现一个紫外吸收峰值 , 说明该物质达
到了较高的纯度 , 经光谱分析测得 CuBP-2a 在环境 pH 为 7.4 时的最大紫外吸收值在 λ248.1 nm.
在本实验中 , Merlin根的蛋白质粗提液进行 Sephadex G-50 凝胶过滤层析时 , 经分子量标准估算 , 其金
属结合物(CuBP)的 M r≈20 000 , 而最后纯化所得的 M r(CuBP-2a)则只有 1 400.造成这种金属结合物 M r 大
小不同的原因 , 有可能在植物体内 , 金属(Cu)结合蛋白(多肽)可能以一种 M r较大的复合体的形式存在 , 如
本实验中 M r 20 000 的 CuBP , 这种复合体由大小可能不同的多个单体或亚基组成 , 这些单体(亚基)之间依
靠一种较弱的结合力如非共价键结合在一起 , 其中的一个或几个单体(亚基)是直接与金属(Cu)结合的 , 如
本实验中 M r 1 400 的 CuBP-2a.这些单体在实验刚开始时仍以复合体的形式存在 , 随着实验的进行 , 它们之
间的结合被解离 , 而我们在实验中只收集含有金属(Cu)的组分 , 也就是直接结合金属(Cu)的一个单体 , 其
它的单体就被放弃了.因为这些单体之间的结合力较弱 , 它们可能因为溶液中离子强度的改变或实验中一些
机械的力量而导致解离.以前的研究也表明[ 1 , 14 , 15] , 分离金属结合物时不同的离子强度 , 会引起金属结合物
M r 的变化;离子强度增加 , 会引起 M r减少 , 在 0.4 mol/ L 或更高的 c(KCl)时 M r达到最小 , 一般在 1 700
～ 3 700 之间;低离子强度时 , 在 8 000 ～ 13 000 之间.
鸣谢　本实验在香港科技大学研究中心进行期间 , 得到杨美财先生和其他同事的大力帮助 , 特此致谢.
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