全 文 ：中国园艺文摘 2012年第3期
抗逆转ABP9基因马尼拉草和紫羊茅植株的鉴定
戴琪鹏，顾沈明
(浙江海洋学院 数理与信息学院，浙江 舟山 316000)
摘 要：选取马尼拉草(Zoysiamatrela)以及紫羊茅(FestucarubraL.)‘追寻者’品系作为相应的受体材料，采用实验
室克隆的玉米(Zeamays)抗逆相关转录因子ABP9通过农杆菌介导和基因枪轰击2种方法进行遗传转化，获得再生植
株；并对再生植株进行PCR、Southern和No thern杂交分子检测以及抗逆性鉴定。试验结果表明，成功获得ABP9在基因
组中整合并表达，且抗逆性得到显著提高的转基因马尼拉草和紫羊茅植株。
关键词：马尼拉草；紫羊茅；转基因；ABP9；抗逆性；转录因子
紫羊茅(FestucarubraL.)是畜牧业中的重要饲料，它
含有丰富的矿物质、蛋白质及多种维生素，是奶牛饲养的
重要草种；作为草坪草具有建坪速度快、抗病虫害能力强
等优点，但其耐旱性较弱。而马尼拉草(Zoysiamatrela)常
用于城市草坪绿化及沿海防护堤，具有耐酸、耐践踏等优
良特性，是城市绿化的主力军，但其耐盐能力不强。因此
培育耐逆性强的马尼拉草和紫羊茅品种已成为草业生产的
重大需求。
干旱、寒冷、盐渍等逆境信号经过一系列的传导后，
最终通过转录因子来调控逆境相关基因的表达。这些年来，
相继有调控低温、干旱及盐渍相关基因表达的转录因子从
高等植物中得到分离。经研究表明，这些转录因子能显著
提高植物抗非生物逆境的能力，而且这些转录因子能调控
一系列抗逆相关功能基因的表达，因此可以综合地改良植
物的抗逆性。随着生物技术的不断成熟，使得在分子水平
上进行草坪草和牧草抗渗透胁迫新品系培育成为可能。
中科院生物技术研究所实验室经过酵母单杂交克隆得
到玉米(Zeamays)抗逆相关bZIP类转录因子ABP9基因，该
基因编码蛋白与玉米过氧化氢酶Catl基因启动子中的ABA
应答元件ABRE特异性结合后具有转录激活功能。ABP9基
因的表达受高盐、干旱等非生物逆境诱导，在拟南芥(A
rabidopsithali-ana)中过量表达能够提高转基因植株耐受
高温和干旱的能力。
该研究构建了玉米bZIP类转录因子ABP9的植物表达载
体，并采用农杆菌介导和基因枪2种方法遗传转化马尼拉草
(‘Barti’和‘Telstar’)和紫羊茅(‘追寻者’)，获得抗逆性
明显增强的转ABP9基因植株，为我国草业育种改良提供了
重要的种质资源。
1 材料与方法
1.1材料和培养条件
遗传转化受体材料：野生型马尼拉草、紫羊茅(‘追寻
者’)的成熟种子。
逆境处理材料的培养：采用分蘖拆分方法从马尼拉草、
紫羊茅野生型和转基因植株分蘖簇中分出长势基本一致的
分蘖枝移栽到盛有等量土样(泥炭土∶蛭石∶草炭灰为
1∶1∶1)的花盆中于日光温室内进行无性繁殖，培养一定
时间(马尼拉草14 d，紫羊茅30 d)后开始逆境处理。温室光
照强度为50 000～70 000 lx，温度为20～30℃，空气相对
湿度30%～40%。
1.2基因建构和遗传转化
建构分别由组成型表达启动子(Ubi、35S)和ABA诱导
犁启动子驱动ABP9表达的植物表达载体，采用农杆菌介导
和基因枪轰击2种方法以bar作抗性选择标记基因对马尼拉
草和紫羊茅材料进行遗传转化并再生植株。
1.3转化再生植株的PCR鉴定
以转ABP9基因植株的总DNA为模板，质粒DNA为阳
性对照，野生型植株作为阴性对照，用基因特异性引物对
转基因植株进行PCR扩增(见附表)。
1.4 Southern杂交检测
马尼拉草和紫羊茅的基因组DNA提取采用CTAB法。
DNA浓度和纯度的测定、酶切、电泳、转膜、探针制备、
杂交和洗膜参考Sambrook和David的方法。
1.5 Northern杂交分析
马尼拉草和紫羊茅总RNA用TRIzol试剂提取。RNA的
变性、电泳、转膜、探针制备、杂交和洗膜参考Sambrook
第一作者简介：戴琪鹏( 1981－)，男，农艺师；从事农业新技
术试验、示范、推广工作。
附表 引物和PCR扩增条件
类项
正向引物
反向引物
扩增条件
马尼拉草(Zoysiamatrela)
5 TGATATGGCGTCGGAGACGA 3
5 CAATCCTCCGTTCTCACCTGT3
94℃ 2 min； 94℃ 30 s，62℃ 30 s，72℃ 1 min，
35个循坏；72℃ 5 min，4℃终止
紫羊茅(FestucarubraL.)
5 AA GAAAAA GAA GCTGGA GAA G 3
5 TGCGGGACTCTAA TCA TAAAAACC 3
94℃ 5 min； 94℃ 1 min，58℃ 40 s，72℃ 1 min，
35个循坏； 72℃ 10 min，4℃终止
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CHINESE HORTICULTURE ABSTRACTS
等的方法。
1.6干旱处理和统计方法
采用人工控水的方法进行。将准备好的材料浇1次饱和
水后，停止浇水。当野生型植株大多数出现整株严重失水
时，立即恢复浇水。复水生长14 d后，以植株恢复生长为
标准统计存活率，3次重复试验。
存活率(%)=(存活植株/试验总植株)×100
1.7盐处理和统计方法
向长有试验样品的盆土中浇灌NaCl溶液，以每日
50 mmol/ L的增幅递增盐浓度至550 mmol/ L。10 d后，
进行脱盐处理(将材料在清水中浸泡10 min，重复3次洗掉
残余盐分)，恢复14 d后以植株恢复生长为标准统计存活
率，3次重复试验。
2 结果与分析
2.1马尼拉草和紫羊茅转化再生植株的PCR鉴定
马尼拉草和紫羊茅野生型用ABP9基因建构遗传转化，
经草胺磷筛选获得大量抗性再生植株。对这些植株进行
PCR鉴定，如图l、2所示，马尼拉草和紫羊茅转化植株分
别在358和570bp的位置上出现了预期大小的目标DNA条
带，初步证明已将ABP9基因导入马尼拉草和紫羊茅获得转
基因植株。
2.2马尼拉草和紫羊茅PCR阳性转化再生植株的
Southern杂交鉴定
为了进一步证实ABP9在基因组中的整合和拷贝数，对
上述马尼拉草和紫羊茅PCR阳性植株进行Southern杂交鉴
定。用在ABP9内部无酶切位点的Hind III对基因组DNA进
行单酶切，以32P同位素标记的ABP9特异序列DNA为探针
进行Southern杂交。
如图3所示，紫羊茅转化植株14#和16#的基因组
DNA中都出现了区别于野生型的杂交带，推测14#植株中
至少存在1个ABP9拷贝，而16#至少含有2～3个拷贝。
如图4所示，马尼拉草转化植株2# A、2# B和2# A5都
出现了区别于野生型的杂交信号，推测，2# B和2# A5各
至少含有1个ABP9拷贝，而2# A中至少存在3个拷贝。图1 紫羊茅转化再生植株的PCR检测
注：1为水空白；2～11为紫羊茅转化再生植株；12为野
生型对照；13为阳性对照；M为100 bp DNA Ladder
图2 马尼拉草转化再生植株的PCR检测
注：1～10为马尼拉草转化再生植株；11为阳性对照；12为野生型对照；
13为水空白；M为100 bp Ladder
图3 转ABP9马尼拉草Southern杂交检测
注：1为再生株系16#；2为再生株系14#；3为马尼拉草野生型；
P为质粒DNA阳性对照。
图4 转ABP9紫羊茅Southern杂交检测
注：1为再生株系2# B：2为再生株系2# A；3为紫羊茅野生型；4为马尼拉
草野生型；5为再生植株2# A5；P为质粒DNA阳性对照。
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中国园艺文摘 2012年第3期
2.3转ABP9马尼拉草和紫羊茅植株中ABP9表达的
Northern杂交分析
提取植株总RNA，用与Southern杂交相同的探针进行
Northern杂交检测，分析转基因植株中ABP9的表达。
如图5所示，野生型对照都无杂交带，而转基因马尼拉
草和紫羊茅植株均有杂交信号，说明ABP9在转基因植株中
得到表达。并且，在转基因马尼拉草中2# A植株表达最
强，2# B、2# A5表达较弱；转基因紫羊茅中14#表达较
强，16#较弱。
以上结果进一步证实，获得了ABP9整合到基因组中的
转基因马尼拉草与紫羊茅植株。
2.4转ABP9马尼拉草和紫羊茅植株的抗逆性鉴定
2.4.1转基因马尼拉草的耐早鉴定 从转基因马尼拉草植
株和野生型对照植株分蘖簇中拆分分蘖枝，在土中生长14
d后开始耐旱试验。当控水处理至第20 d时，全部野生型植
株出现明显的叶片枯萎现象，而转基因植株只是部分出现
叶片轻度萎蔫；控水处理第35 d时，绝大部分野生型植株
表现整株干枯，而大多数转基因植株仍保持一定数目的绿
色叶片。恢复浇水后14 d(见图6)观察，马尼拉并以恢复生
长为标准统计存活率，转ABP9基因马尼拉草旱后存活率达
76%，而野生型对照只有29%。
2.4.2转基因紫羊茅的耐盐鉴定 从转基因紫羊茅植株和
野生型对照植株分蘖簇中拆分分蘖枝，在土中生长30 d后
开始耐盐试验。向长有材料的花盆土中浇灌NaCl溶液，以
每天50 mmol的增幅递增盐浓度至400 mmol/ L后，野生型
植株的叶片出现较为明显的叶而卷曲、失绿表型，而转基
因植株只部分叶片出现轻微卷曲。当盐浓度到达550 mmol
时，持续10 d，发现绝大多数野生型植株表现整株干枯，
而大部分转基因植株仍维持一定数目的绿色叶片。此时进
行脱盐并恢复浇水，2周后(见图7)观察，并以恢复生长为标
准统计存活率，转ABP9基因紫羊茅盐后存活率达100%，
而野生型对照只有57%。
抗逆试验结果表明：与野生型相比，转ABP9基因马尼拉
草的耐早性和转ABP9基因紫羊茅的耐盐性都有很大提高。
3 讨论
通过PCR检测、Southern和Northern杂交等分子生物
学技术分析表明：ABP9基因已整合到马尼拉草和紫羊茅植
株基因组rli，并获得表达。抗逆生理分析显示：转ABP9基
因马尼拉草和紫羊茅再生植株在干旱和盐渍胁迫过程中，
叶片的卷曲程度以及解除逆境后的植株成活率较野生型植
株都有了很大幅度地改善，成功获得耐逆性显著提高的转
ABP9基因马尼拉草和紫羊茅植株。
中国农业科学院生物技术研究所实验室早期研究表明，
从玉米幼胚中克隆得到的bZIP类转录因子ABP9可以与过氧
化氢酶基因Catl启动子ABRE元件特异性结合并具有转录激
活功能，其在ABP9转基因拟南芥植株中过量表达能显著提
高植株对干旱、高温的耐受性。该研究结果与上述试验结
果一致，并再次证明，通过操作在ABA途径发挥作用的
ABP9基因的表达可以提高转基因植物对多种非生物逆境的
耐受能力。
中国是草地大国，草地面积占国土面积的40%以上，但
同时也是一个水资源相对贫乏、土地盐碱化日益严重的国
家，普通草坪正常生长需水量大，盐碱地环境下生长不良
的缺点早已不符合我国的国情。因此，选育耐逆性能强的
优良草坪，改良我国草种资源成为近年来亟待解决的课题。
该研究所获得的转ABP9基因耐早马尼拉草和耐盐紫羊茅，
将在牧草和草坪草改良中具有潜在的重要应用价值和经济
价值。
注：1为转基因紫羊茅16#；2为转基因紫羊茅14#；3为转基因马尼拉草2# A5；
4为转基因马尼拉草2# B；5为转基因马尼拉草2# A；6为紫羊茅野生型；
7为马尼拉草野生型。
图5 转ABP9基因植株的Northern杂交分析
注：1为马尼拉草野生型；2为转ABP9基因马尼拉草
图6 转ABP9基因马尼拉草的抗旱试验
图7 转ABP9基因紫羊茅的抗盐试验
注：1为转ABP9基因紫羊茅16#：2为转ABP9基因
紫羊茅14#；3为紫羊茅野生型
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