全 文 ：麦类作物学报　２０１６，３６（６）：７２１－７２７
Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｔｒｉｔｉｃｅａｅ　Ｃｒｏｐｓ　 ｄｏｉ：１０．７６０６／ｊ．ｉｓｓｎ．１００９－１０４１．２０１６．０６．０６
网络出版时间：２０１６－０５－３０
网络出版地址：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｎｋｉ．ｎｅｔ／ｋｃｍｓ／ｄｅｔａｉｌ／６１．１３５９．Ｓ．２０１６０５３０．１５３５．０１０．ｈｔｍｌ
野生一粒小麦根干旱响应蛋白的筛选与鉴定
收稿日期：２０１５－１２－２６　　　修回日期：２０１６－０３－２３
基金项目：陕西省科技厅科技攻关项目（２０１３Ｋ０１－１６）；榆林市产学研项目（２０１４ＣＸＹ－１１－１１）
第一作者Ｅ－ｍａｉｌ：ｌｘｈｕａ０３２１＠１２６．ｃｏｍ
通讯作者：刘永华（Ｅ－ｍａｉｌ：ｌｉｕｙｏｎｇｈｕａａ＠１２６．ｃｏｍ）
李鲜花１，刘永华１，刘 辉２，刘翠英１
（１．榆林学院生命科学学院，陕西榆林７１９０００；２．贵州省农业科学院生物技术研究所，贵州贵阳５５０００６）
摘　要：为解析野生一粒小麦根响应干旱胁迫的调控网络，用２０％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ６０００处理两叶一心期野
生一粒小麦，通过对小麦根蛋白质的分离和鉴定，分析了干旱胁迫下野生一粒小麦根中的蛋白质变化。结果
共分离、鉴定得到８５个表达差异倍数在１．５以上的蛋白质。这些差异蛋白主要涉及碳代谢（２７％）、氨基酸代
谢（１５％）、解毒与防御（１１％）、分子伴侣（８％）、能量代谢（８％）、信号传导（６％）、蛋白质代谢（５％）、脂代谢
（４％）、转录与翻译（４％）、核苷酸代谢（２％）以及骨架蛋白（１％）。对这些表达差异蛋白进行进一步的功能分
析，发现大部分信号传导相关蛋白上调表达；碳代谢途径中的糖酵解相关蛋白下调表达，而磷酸戊糖途径相关
蛋白上调表达。同时下调表达的还包括蛋白质代谢相关蛋白。大部分氨基酸代谢相关蛋白质下调表达，但是
谷氨酸脱羧酶及甲硫氨酸合酶含量上升。结果表明，干旱胁迫增强了野生一粒小麦根中信号传导与磷酸戊糖
途径代谢，促进了谷氨酸与甲硫氨酸的生物合成，降低了糖酵解与蛋白质代谢等过程。研究结果丰富了野生
一粒小麦根响应干旱胁迫机制信息。
关键词：干旱胁迫；野生一粒小麦；蛋白质组学；双向电泳
中图分类号：Ｓ５１２．１；Ｓ３１２　　　　文献标识码：Ａ　　　　文章编号：１００９－１０４１（２０１６）０６－０７２１－０７
Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ　ａｎｄ　Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　Ｒｅｌａｔｅｄ　ｔｏ
Ｄｒｏｕｇｈｔ　ｉｎ　Ｒｏｏｔ　ｏｆ　Ｔ．ｂｏｅｏｔｉｃｕｍ
ＬＩ　Ｘｉａｎｈｕａ１，ＬＩＵ　Ｙｏｎｇｈｕａ１，ＬＩＵ　Ｈｕｉ　２，ＬＩＵ　Ｃｕｉｙｉｎｇ１
（１．Ｃｏｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｃｏｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｙｕｌｉｎ，Ｙｕｌｉｎ，Ｓｈａａｎｘｉ　７１９０００，Ｃｈｉｎａ；２．Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，
Ｇｕｉｚｈｏｕ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｇｕｉｙａｎｇ，Ｇｕｉｚｈｏｕ　５５０００６，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｏ　ｕｎｃｏｖｅｒ　ｔｈｅ　ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ　ｎｅｔｗｏｒｋ　ｏｆ　Ｔｒｉｔｉｃｕｍ　ｂｏｅｏｔｉｃｕｍｕｎｄｅｒ　ｄｒｏｕｇｈｔ　ｓｔｒｅｓｓ，ａｐｒｏｔｅｏｍｉｃ
ａｐｐｒｏａｃｈ　ｗａｓ　ａｐｐｌｉｅｄ　ｔｏ　ｉｄｅｎｔｉｆｙ　ｔｈｅ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｒｅｌａｔｉｖｅ　ｔｏ　ｄｒｏｕｇｈｔ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ　ｉｎ　ｒｏｏｔ　ｏｆ　Ｔｒｉｔｉｃｕｍ　ｂｏｅｏｔｉｃ－
ｕｍ．Ａｂｏｕｔ　ｔｗｏ－ｗｅｅｋ　ｏｌｄ　ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ　ｏｆ　Ｔｒｉｔｉｃｕｍ　ｂｏｅｏｔｉｃｕｍ（ａｔ　ｔｈｒｅｅ　ｌｅａｖｅｓ　ｓｔａｇｅ）ｗｅｒｅ　ｔｒｅａｔｅｄ　ｗｉｔｈ
２０％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ６０００．Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｉｎ　ｒｏｏｔ　ｗｅｒｅ　ｉｓｏｌａｔｅｄ　ｔｈｒｏｕｇｈ　ｔｗｏ　ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ　ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ　ａｎｄ　ｉｎ－
ｄｅｎｔｉｆｉｅｄ　ｂｙ　ｍａｓｓ　ｓｐｅｃｔｒｕｍ．Ｅｉｇｈｔｙ－ｆｉｖｅ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ　ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ（ＤＥＰｓ）ｗｉｔｈ　ａｔ　ｌｅａｓｔ　１．５－ｆｏｌｄ
ｃｈａｎｇｅ　ｉｎ　ａｂｕｎｄａｎｃｅ　ｗｅｒｅ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ　ｏｎ　ｔｈｅ　２－ＤＥ　ｇｅｌｓ．Ｔｈｅｓｅ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｗｅｒｅ　ｍａｉｎｌｙ　ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｃａｒ－
ｂｏｎ　ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ（２７％），ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ　ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ（１５％），ｄｅｔｏｘｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｄｅｆｅｎｓｅ（１１％），ｃｈａｐｅｒｏｎｅｓ
（８％），ｅｎｅｒｇｙ　ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ（８％），ｓｉｇｎａｌ　ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ（６％），ｐｒｏｔｅｉｎ　ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ（５％），ｌｉｐｉｄ　ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ
（４％），ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（４％），ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ（２％），ａｎｄ　ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎ　ａｎｄ　ｃｙｔｏｋｉｎｅ－
ｓｉｓ（１％）．Ｆｕｒｔｈｅｒ　ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｒｅｖｅａｌｅｄ　ｔｈａｔ　ｓｉｇｎａｌ　ｓｅｎｓｉｎｇ　ａｎｄ　ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ
ｗｅｒｅ　ｇｒｅａｔｌｙ　ｕｐ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｒｏｏｔ．Ｇｌｙｃｏｌｙｓｉｓ　ｗａｓ　ｄｏｗｎ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄ　ｂｕｔ　ＰＰＰ　ｐａｔｈｗａｙ　ｅｎｈａｎｃｅｄ　ｉｎ
ｔｈｅ　ｒｏｏｔ，ｒｅｓｕｌｔｉｎｇ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅ　ｏｆ　ｃｏｍｐｌｅｘ　ｃｈａｎｇｅｓ　ｉｎ　ｅｎｅｒｇｙ　ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ．Ｐｒｏｔｅｉｎ　ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ　ｗａｓ
ｄｏｗｎ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｒｏｏｔ，ａｓ　ｗｅｌ　ａｓ　ｍｏｓｔ　ｏｆ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ　ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ　ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｈｏｗｅｖｅｒ，
ｔｈｅ　ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ　ｏｆ　ｇｌｕｔａｍａｔｅ　ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ　ａｎｄ　ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ　ｓｙｎｔｈａｓｅ　ｗａｓ　ｉｎｃｒｅａｓｅｄ　ａｆｔｅｒ　ｄｒｏｕｇｈｔ　ｓｔｒｅｓｓ．
Ｔｈｅｓｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｗｏｕｌｄ　ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｅｘｉｓｔｉｎｇ　ｋｎｏｗｌｅｄｇｅ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙ　ｏｆ　ｒｏｏｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｃｈａｎｇｅｓ
ｔｈａｔ　ｏｃｃｕｒ　ｉｎ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ　ｔｏ　ｄｒｏｕｇｈｔ．
Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ｄｒｏｕｇｈｔ　ｓｔｒｅｓｓ；Ｔ．ｂｏｅｏｔｉｃｕｍ；Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ；２－ＤＥ
　　作为世界主要粮食作物之一，小麦的生产很
容易受到全球气候变化与水分亏缺环境的影
响［１］。干旱是导致农作物减产最主要的非生物逆
境胁迫因子［２］，而全球气候变暖，更加深了干旱对
农作物产量的影响［３］。因此，有必要从分子水平
揭示小麦响应干旱胁迫的机制，为干旱耐受新品
种的培育提供理论依据和技术指导。
植物配备有复杂而精细的响应机制以适应干
旱缺水环境，这种复杂的响应机制是由植物感应
干旱胁迫信号引起的转录翻译机制而起始，继而
导致解剖结构、生理生化状态的改变，如气孔关
闭、渗透调节物质与抗氧化剂的合成等［１－２］。普通
小麦的祖先有很多具优良的耐旱性，如山羊草
（Ａｅｇｉｌｏｐｓ　ｔａｕｓｃｈｉｉ）、乌拉尔图（Ｔ．ｕｒａｒｔｕ）、野生
一粒小麦（Ｔ．ｂｏｅｏｔｉｃｕｍ）［４－６］，这些小麦近源物种
是改良普通小麦耐旱性的重要基因库。野生一粒
小麦可以耐受各种环境胁迫因子，包括盐胁迫、病
虫害等［７］，其耐旱性显著强于野生二粒小麦、普通
小麦［６］，是当前改善小麦品种耐旱性有效、重要的
潜在基因库。
通过比较转录组学技术，在野生二粒小麦中，
多种胁迫耐受基因的筛选与鉴定获得成功［８］。然
而，由于基因转录、翻译成蛋白质需要经历复杂的
转录、翻译后修饰，使得基因与蛋白质之间的关联
性较低，而蛋白质是胁迫信号感应、转录调控、解
毒防御、生物大分子结构保护等的直接作用因子，
因此，比较蛋白质组学是揭示植物响应干旱胁迫
强有力的研究技术［９］。已经有研究通过蛋白质组
学技术，分析了野生小麦与普通小麦叶片在干旱
胁迫下的蛋白质变化［１０］。在小麦根蛋白质组学
方面，Ｎａｓｓｅｒ等［１１］分别比较了在较高和较低氮营
养水平下两个小麦品种蛋白质表达的变化，结果
显示硝酸还原酶和谷氨酸脱氢酶相关蛋白与氮营
养水平正相关。Ｋｏｎｇ等［１２］利用凝胶和ＬＣ－ＭＳ－
ＭＳ生物质谱法鉴定了水涝胁迫下小麦根系细胞
壁的蛋白质组，推测小麦幼苗通过限制细胞生长
来应对水涝胁迫，以避免能量消耗。然而，对干旱
胁迫下野生一粒小麦根中蛋白质组变化的研究较
少，目前只有一篇文献有报导［１３］，野生一粒小麦
根的干旱响应机制仍然不明确。
为揭示耐寒性较强的野生一粒小麦响应干旱
胁迫的分子机制，本研究采用２－ＤＥ和 ＭＡＬＤＩ－
ＴＯＦ－ＴＯＦ－ＭＳ生物质谱鉴定法对２０％ＰＥＧ６０００
处理２４ｈ、４８ｈ的野生一粒小麦根蛋白质组进行
分析，以明确表达差异蛋白质与野生一粒小麦抗
旱性的相关性，并对其功能与代谢途径进行进一
步分析，以期从蛋白质组水平揭示野生一粒小麦
响应干旱胁迫的分子机制。
１　材料与方法
１．１　材料与干旱处理
试验材料为野生一粒小麦（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ　ｂｏｅｔｉｃ－
ｕｍ），由西北农林科技大学小麦改良中心提供。
种子在室温黑暗条件下于湿润滤纸上发芽后，在
光／暗比１６ｈ／８ｈ、温度２３～２５ ℃、相对湿度
６５％～７５％条件下培养；两叶期时转移到１／４
Ｈｏａｇｌａｎｄ培养液中，每３ｄ更换一次培养液；三
叶期用２０％ ＰＥＧ６０００分别处理２４ｈ、４８ｈ后收
集根，于－８０℃下冷冻。３个重复。
１．２　蛋白质提取
根蛋白样品制备参照Ｌｉｕ等［１３］的方法，稍有
修改。将冷冻根在液氮中用预冷的研钵研磨成粉
末。取粉末５００ｍｇ，加入１０ｍＬ含有１０％柠檬
酸和 ０．０７％β－巯基乙醇沉淀蛋白的冷丙酮，
－２０℃过夜后于４℃、１９　０００ｒ·ｍｉｎ－１离心１ｈ，
沉淀用含有０．０７％β－巯基乙醇沉淀蛋白的冷丙
酮清洗三次。将沉淀冻干以除去残留的丙酮，即
为提取蛋白。
将提取蛋白溶解于１ｍＬ 裂解缓冲液（７
ｍｏｌ·Ｌ－１尿素，２ｍｏｌ·Ｌ－１硫脲，４％ＣＨＡＰＳ，６５
ｍｍｏｌ·Ｌ－１　Ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ（ＤＴＴ），微量蛋白质抑
制剂）中，４℃静置１．５ｈ；４℃、１９　０００ｒ·ｍｉｎ－１离
心 １ ｈ，上 清 液 即 为 蛋 白 样 品。 以 ＢＳＡ
（１ｍｇ·ｍＬ－１）为标准，用２－Ｄ　Ｑｕａｎｔ　Ｋｉｔ定量试
剂盒（ＧＥ公司）测定样品浓度，并于－８０℃保存
备用。
·２２７· 麦　类　作　物　学　报　　　　　　　　　　　　　　　　　　第３６卷
１．３　双向电泳、图像分析与 ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＴＯＦ
生物质谱分析
双向电泳操作参考 Ｌｉｕ等［１３］的方法进行。
采用１７ｃｍ　ＩＰＧ胶条（ｐＨ　４～７），上样量为２５０
μｇ。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳在１１．２５％聚丙稀酰胺凝胶
上进行。蛋白点用银染显色。
图像分析采用ＰＤＱｕｅｓｔ　８．０．１软件（Ｂｉｏ－Ｒａｄ
公司，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）。以未胁迫处理为对照样
品，自动检测匹配和归一化后，人工进行进一步处
理。表达差异倍数在１．５以上、Ｐ≤０．０１的蛋白
点为差异蛋白。
从２－ＤＥ胶中把差异蛋白点切出，胶内酶解
及 Ｚｉｐｔｉｐ 脱盐，然后进行 ４８００Ｐｌｕｓ　ＭＡＬＤＩ－
ＴＯＦ－ＴＯＦ－ＭＳ（ＡＢ　ＳＣＩＥＸ，ＵＳＡ）质谱分析，所
得数据在ＮＣＢＩ非冗余蛋白质数据库进行搜索，
详细步骤及各种参数设置参照Ｌｉｕ等［１３］的方法。
蛋白质评分Ｃ．Ｉ．％超过９５％的蛋白质认定为鉴
定成功的蛋白。
２　结果与分析
２．１　干旱胁迫下野生一粒小麦蛋白质组的总体
变化
从图１可以看出 ，处理间的胶图重复性较
好，表明２－ＤＥ结果的准确性和可靠性较高。通
过双向电泳和 ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＴＯＦ生物质谱分析
共鉴定出了８５个差异蛋白，其中有５组蛋白质点
确定为相同的蛋白质（图２）。８５个差异蛋白中有
４９个下调表达，３６个上调表达。其中，有４０个差
异蛋白点在２４ｈ和４８ｈ两个处理中均下调表
达，３０个蛋白点均上调表达。处理２４ｈ的根蛋
白表达水平的变化显著强于４８ｈ处理，表明２４ｈ
处理的野生一粒小麦根系对干旱胁迫的响应比
４８ｈ更严重，可能受干旱胁迫２４ｈ后野生一粒小
麦开启了适应机制。
２．２　干旱胁迫下野生一粒小麦差异蛋白质的
ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＴＯＦ质谱鉴定及功能分类
对已鉴定的８５个差异蛋白质按功能分类，其
中７７个功能确定蛋白分别为碳代谢（２７％）、氨基
酸代谢（１５％）、解毒与防御（１１％）、分子伴侣
（８％）、能量代谢（８％）、信号传导（６％）、蛋白质代
谢（５％）、脂代谢（４％）、转录与翻译（４％）、核苷酸
代谢（２％）以及骨架蛋白（１％），大约有一半以上
蛋白质参与碳代谢、氨基酸代谢和解毒防御。结
果表明，干旱胁迫主要影响了野生一粒小麦根的
解毒和防御、碳代谢及氨基酸代谢等过程。
为了获得８个未知差异蛋白的更多信息，应
用ＢＬＡＳＴＰ工具（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．
ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／），利用未知蛋白质序列作为供体序
列，查询其同源蛋白。结果表明有５个未知蛋白
的氨基酸序列与已知蛋白的相似度达到９０％以
上，表明它们可能具有相似的功能；３个蛋白质的
功能有待进一步研究验证（表１）。
２．３　干旱胁迫下野生一粒小麦根信号传导相关
蛋白的变化
通过２－ＤＥ及 ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＴＯＦ分离鉴定，
在干旱胁迫下的野生一粒小麦根中，共发现５个
　　Ａ：对照样品的２－ＤＥ图谱；Ｂ：２０％ＰＥＧ６０００处理２４ｈ的２－ＤＥ图谱；Ｃ：２０％ＰＥＧ６０００处理４８ｈ的２－ＤＥ图谱
Ａ：２－ＤＥ　ｇｅｌ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｓａｍｐｌｅ；Ｂ：２－ＤＥ　ｇｅｌ　ｏｆ　ｓａｍｐｌｅ　ｔｒｅａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　２０％ ＰＥＧ６０００ｆｏｒ　２４ｈ；Ｃ：２－ＤＥ　ｇｅｌ　ｏｆ　ｓａｍｐｌｅ　ｔｒｅａｔｅｄ　ｗｉｔｈ
２０％ＰＥＧ６０００ｆｏｒ　４８ｈ
图１　干旱胁迫下野生一粒小麦根蛋白质２－ＤＥ图谱
Ｆｉｇ．１　Ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｅ　２－ＤＥ　ｇｅｌｓ　ｏｆ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｉｎ　ｒｏｏｔ　ｏｆ　Ｔ．ｂｏｅｏｔｉｃｕｍｗｉｔｈ　ｄｒｏｕｇｈｔ
·３２７·第６期 李鲜花等：野生一粒小麦根干旱响应蛋白的筛选与鉴定
信号相关的差异蛋白，其中有３个在干旱处理２４
ｈ、４８ｈ均上调表达，２个在２４ｈ、４８ｈ均下调表
达。上调表达的蛋白质为ｐｙｒａｂａｃｔｉｎ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　１
（Ｒ６２）、１４－３－３－ｌｉｋｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ＧＦ１４－Ｂ－ｌｉｋｅ（Ｒ６３）、
ｒｏｂａｂｌｅ　ｃａｌｃｉｕｍ－ｂｉｎｄｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ＣＭＬ２８－ｌｉｋｅ
（Ｒ６４），均是植物体内信号传导相关的关键蛋白。
２个下调蛋白质中包含有ＲＡＢ－ＧＤＰ解离抑制因
子（Ｒ６１），可抑制 ＧＴＰ的合成，对细胞感应逆境
信号起负调控作用。结果表明，干旱胁迫可促进
野生一粒小麦根的信号传导能力。
２．４　干旱胁迫下野生一粒小麦根抗氧化和防御
相关蛋白的变化
通过蛋白质组学分析，共有９个差异蛋白参
与野生一粒小麦根抗氧化与防御过程，其中有８
个在干旱胁迫２４ｈ、４８ｈ后均上调表达，以过氧
化物酶和谷胱甘肽合成相关酶为主，这些蛋白质
是去除过量活性氧过程中的关键酶；只有１个蛋
白在干旱处理２４ｈ、４８ｈ后下调表达。综合结果
表明，干旱胁迫处理野生一粒小麦可促使根的解
毒和防御能力增强。
２．５　干旱胁迫下野生一粒小麦根碳代谢和能量
代谢相关蛋白的变化
通过比较干旱胁迫与对照组中的野生一粒小
麦根中的差异蛋白质组变化，发现有２３个差异蛋
白涉及碳代谢过程，其中有１９个是糖酵解过程中
的关键蛋白；１６个蛋白质在干旱胁迫２４ｈ、４８ｈ
后下调表达，包括葡萄糖磷酸变位酶、烯醇酶等；１
个蛋白在干旱处理２４ｈ、４８ｈ后均上调表达，１个
蛋白质在干旱处理２４ｈ变化不大，而在干旱胁迫
４８ｈ后上调表达。说明干旱胁迫抑制了野生一
粒小麦根的糖酵解过程。有２个蛋白是磷酸戊糖
途径相关蛋白，在干旱处理２４ｈ、４８ｈ后均上调
表达，这些蛋白质丰度的上调，可增强干旱胁迫下
野生一粒小麦根的磷酸戊糖途径。没有发现
ＴＣＡ循环相关蛋白。
在糖酵解、ＴＣＡ循环、磷酸戊糖途径等过程
中，通常伴随着能量的消耗或产生。对７个能量
代谢相关蛋白进行分析，发现３个蛋白在干旱胁
迫２４ｈ、４８ｈ后均上调表达，４个下调表达，他们
在各自的代谢途径中起主要作用，表明干旱胁迫
导致根中能量代谢较为复杂的变化。
综合上述结果，可以推测，在干旱胁迫下的野
生一粒小麦根中，可能主要通过磷酸戊糖途径供
应野生一粒小麦根生长所需的物质和还原力。
　　Ａ和Ｂ为干旱处理０ｈ和２４ｈ后根蛋白图。有５组共１０个明显变化的蛋白点
Ａ　ａｎｄ　Ｂ，ｒｏｏｔ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ａｆｔｅｒ　０ａｎｄ　２４ｈｏｆ　ｄｒｏｕｇｈｔ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ．Ａ　ｔｏｔａｌ　ｏｆ　１０ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｙ　ｃｈａｎｇｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｓｐｏｔｓ　ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ　ｔｏ　５ｕ－
ｎｉｑｕｅ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ａｒｅ　ｓｈｏｗｎ
图２　干旱胁迫下２－ＤＥ法检测野生一粒小麦根蛋白的同源异构体蛋白点
Ｆｉｇ．２　Ｃｌｏｓｅ－ｕｐ　ｏｆ　ｐｏｓｓｉｂｌｅ　ｉｓｏｆｏｒｍｓ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ　ｂｙ　２－ＤＥ　ｏｆ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｉｎ　ｒｏｏｔ　ｏｆ　Ｔ．ｂｏｅｏｔｉｃｕｍｕｎｄｅｒ　ｄｒｏｕｇｈｔ　ｓｔｒｅｓｓ
·４２７· 麦　类　作　物　学　报　　　　　　　　　　　　　　　　　　第３６卷
２．６　干旱胁迫下野生一粒小麦根氨基酸、蛋白质
代谢相关蛋白的变化
干旱胁迫野生一粒小麦根中，共发现１３个与
氨基酸和氮代谢相关的差异蛋白质，其中有８个
蛋白质在干旱处理２４ｈ、４８ｈ后下调表达，包括
谷氨氨酰胺合酶、精氨酸合酶等，只有５个在干旱
处理２４ｈ、４８ｈ后上调表达，包括甲硫氨酸合酶
与谷氨酸脱羧酶等。表明干旱胁迫降低了野生一
粒小麦根中的谷氨酰胺、精氨酸的合成，而增强了
甲硫氨酸、谷氨酸的合成。
表１　未知蛋白的同源ｂｌａｓｔ分析结果
Ｔａｂｌｅ　１　Ｈｏｍｏｌｏｇｕｅｓ　ｏｆ　ｕｎｋｎｏｗｎ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ
未知蛋白 Ｕｎｋｎｏｗｎ　ｐｒｏｔｅｉｎ
点编号
Ｎｕｍｂｅｒ
登录号
Ｇｅｎｂａｎｋ　Ｎｏ．
同源蛋白 Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ　ｐｒｏｔｅｉｎ
登录号
Ｇｅｎｂａｎｋ　Ｎｏ．
蛋白类型
Ｐｒｏｔｅｉｎ　ｔｙｐｅ
物种
Ｓｐｅｃｉｅｓ
相似度
Ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ／％
Ｒ８３ ｇｉ｜２４２０９１２３７ ｇｂ｜ＡＦＷ７８９２５．１｜ ＴＣＰ－１
／ｃｐｎ６０分子伴侣蛋白
ＴＣＰ－１／ｃｐｎ６０ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｃｈａｐｅｒｏｎｅ
玉米
Ｃｏｒｎ ９７
Ｒ７９ ｇｉ｜２４２０４９７７４ ＮＰ＿００１１４９８５０．１｜ ３－
磷酸核糖异构酶
３－ｒｉｂｏｓｅ　ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｉｓｏｍｅｒａｓｅ
玉米
Ｃｏｒｎ ９９
Ｒ８４ ｇｉ｜２５５０８１５７４ ｇｉ｜７８７０８１３５ Ｔｙ３－ｇｙｐｓｙ
转座子蛋白
Ｔｙ３－ｇｙｐｓｙ　ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎｓ
水稻
Ｒｉｃｅ ５０
Ｒ８５ ｇｉ｜５１９６９８８６ ＸＰ＿００２８７０１２４．１｜
转录因子
Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒ
拟南芥
Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ９５
Ｒ７８ ｇｉ｜１４５３４９３２０ ＥＨＲ７６２４０．１
硫酯酶
Ｔｈｉｏｅｓｔｅｒａｓｅ
海藻
Ａｌｇａ ３０
Ｒ８０ ｇｉ｜３０２７６２６０７ ｇｂ｜ＡＤＥ８８１５２．１｜ ｃａｆｆｅｙｌ　５－
羟基乙醇酶
Ｃａｆｆｅｙｌ　５－ｈｙｄｒｏｘｙｌ　ａｌｃｏｈｏｌａｓｅ
卷柏 Ｓｅｌａｇｉｎｅｌ－
ｌａ　ｔａｍａｒｉｓｃｉｎａ ９９
Ｒ８１ ｇｉ｜２４２０６６４５２ ｇｂ｜ＡＣＧ４５４６５．１｜
谷胱甘肽磷脂酶
Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ　ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ
玉米
Ｃｏｒｎ ９２
Ｒ８２ ｇｉ｜１２５５４７１３９ ｄｂｊ｜ＢＡＪ９９３４４．１｜
染色体蛋白
Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｉｎ
大麦
Ｂａｒｌｙ ３７
　　蛋白质代谢通常包括蛋白质的生物合成、蛋
白质折叠与蛋白质降解等过程。本研究共发现有
５个差异蛋白与蛋白质生物合成相关，其中３个
蛋白在干旱处理２４ｈ、４８ｈ后上调表达，２个下调
表达，表明干旱胁迫导致小麦根蛋白质生物合成
受到较大的干扰。分子伴侣蛋白与蛋白质折叠相
关，研究发现有７个分子伴侣蛋白，其中６个在
干旱处理２４ｈ、４８ｈ后下调表达，只有１个上调
表达，表明干旱胁迫导致野生一粒小麦根的蛋白
质折叠过程受到抑制。干旱胁迫下，有５个差异
蛋白参与野生一粒小麦根的蛋白质降解过程，
其中只有１个蛋白质在干旱处理２４ｈ、４８ｈ后上
调表达，另外４个下调表达。综合结果表明，干旱
胁迫降低了野生一粒小麦根中氨基酸和氮代谢、
蛋白质生物合成、蛋白质折叠、蛋白质降解等
过程。
３　讨 论
３．１　差异蛋白质的２－ＤＥ与 ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＴＯＦ
鉴定结果的比较
总的来说，在第二向ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳后，蛋
白点分子量实测值与理论值的误差大约为±
１０％。发现两个蛋白点（点编号为 Ｒ７２，Ｒ８４）的
分子量比理论值明显偏小，表明这些蛋白质可能
是完整蛋白质的部分降解产物。５组蛋白质（点
编号为 Ｒ４８和 Ｒ４９，Ｒ１０和 Ｒ１４，Ｒ１１和 Ｒ１６，
Ｒ３０和 Ｒ３６，Ｒ２０和 Ｒ２３）确定为相同蛋白质，但
是在双向电泳中显示不同的位点，这可能是由于
转录后修饰等原因，如磷酸化和糖基化等。盐胁
迫下的盐生草中有类似的发现［１４］，表明胁迫因子
可能影响植物体内蛋白质磷酸化与糖基化水平，
以适应外界环境的变化。
３．２　信号转导相关蛋白
植物通常通过激活信号转导网络开始干旱胁
迫响应，通过改变信号转导相关蛋白含量来适应
水分胁迫。本试验中获得的ｐｙｒａｂａｃｔｉｎ　ｒｅｓｉｓｔ－
ａｎｃｅ　１（ＰＹＲ１）蛋白可与 ２Ｃ 型蛋白磷酸酶
（ＰＰ２Ｃｓ）相互作用，降低 ＡＢＡ通路中ＰＰ２Ｃｓ磷
酸酶的活性，对 ＡＢＡ 信号通路进行负调节［１５］。
蛋白点Ｒ６２属于ＰＹＲ／ＰＹＬｓ，它的丰度上升使得
野生一粒小麦根具有较高的抗旱性。
　　蛋白点 Ｒ６１是 ＲＡＢ－ＧＤＰ解离抑制因子
（ＲＡＢ－ＧＤＩ），在ＲＡＢ／ＹＰＴ蛋白的ＧＴＰ酶循环
中有重要作用，可将ＧＤＰ与ＲＡＢｓ绑定，通过抑
制ＧＤＰ释放，维持ＧＤＰ键的非活性状态 ［１６］。这
种蛋白可下调通过ＧＤＰ释放引起新一轮ＧＴＰ酶
循环，使野生一粒小麦根系在干旱胁迫下触发了
不同的跨膜信号传导系统。
·５２７·第６期 李鲜花等：野生一粒小麦根干旱响应蛋白的筛选与鉴定
两种钙结合蛋白（点编号 Ｒ６０，Ｒ６４）则表现
出相反的表达模式，Ｒ６４蛋白上调，Ｒ６０蛋白下
调。当使用钙调蛋白拮抗剂后，非生物胁迫中钙
调蛋白或类钙调蛋白直接导致了胁迫阻力下降和
基因的表达［１７］。钙调蛋白或类钙调蛋白与Ｃａ２＋
在ＥＦ－手形结构域结合，改变了与靶蛋白相互作
用的构象，导致靶蛋白的激活或失活［１８］。Ｒ６０和
Ｒ６４分 别 被 确 定 为 类 钙 调 蛋 白 ４９ 亚 型 １
（ＣＭＬ４９－ｌｉｋｅ　ｉｓｏｆｏｒｍ　１）和 类 钙 调 蛋 白 ２８
（ＣＭＬ２８－ｌｉｋｅ），它们在干旱胁迫下钙通道内的功
能仍不能确定。由于Ｒ６０蛋白丰度下调，Ｒ６４蛋
白丰度上调，其功能可能是使蛋白表达激活。
野生一粒小麦根系在干旱胁迫２４ｈ和４８ｈ
后均诱导出了 １４－３－３ 蛋白，它与 ＧＦ１４－Ｂ－ｌｉｋｅ
（Ｒ５０）相类似。１４－３－３蛋白可以结合大量的功能
不同的蛋白质，包括激酶、磷酸酶和跨膜受体等，
从而使１４－３－３蛋白在诸如信号转导调控、细胞凋
亡、细胞周期调控等许多重要调节过程中起重要
作用［１９］。当植物受到非生物胁迫时，这些蛋白还
通过调节ＡＴＰ酶保持细胞离子平衡［２０］。在水稻
的细胞外基质蛋白质组中也观察到类似的蛋白质
ＧＦ１４－Ｃ和ＧＦ１４－Ｂ［２１］。
总之，ＧＦ１４－Ｂ－ｌｉｋｅ蛋白 和ＣＭＬ２８－ｌｉｋｅ蛋白
的丰度上调，ＰＹＲ１，ＲＡＢ－ＧＤＩ和 ＣＭＬ４９－ｌｉｋｅ
ｉｓｏｆｏｒｍ　１蛋白丰度下调，增强了干旱胁迫下野生
一粒小麦根系的信号转导网络。
３．３　碳、能量、氨基酸和氮代谢相关蛋白
糖酵解可将葡萄糖转换成丙酮酸与质子
Ｈ＋，代谢过程所释放的自由能被转换成高能化
合物ＡＴＰ与ＮＡＤＰＨ。ＴＣＡ循环是细胞呼吸过
程中的第二阶段，可在有氧环境中将丙酮酸降解
成二氧化碳与水，并伴随着能量的产生以供植物
体正常生长所需，同时，ＴＣＡ循环过程中产生的
衍生物是氨基酸、次生代谢物等生物合成的底物，
而磷酸戊糖途径可以生成５－磷酸核糖与能量物
质ＮＡＤＰＨ，以供植物生长所需［２２］。大多数与碳
代谢相关的蛋白参与糖酵解，且多数在干旱胁迫
下下调表达。而磷酸戊糖途径相关蛋白（ＵＤＰ－葡
萄糖／ＧＤＰ－甘露糖脱氢酶、转酮醇酶、３－磷酸核糖
异构酶等）则在干旱处理２４ｈ、４８ｈ后上调表达，
表明干旱胁迫下野生一粒小麦根中形成了新的代
谢平衡，以减少能量消耗，增强能量形成，保证生
长所需，与Ｌｉｕ等［１３］的研究结果一致。
为了响应干旱胁迫，植物体内离子稳态会改
变，ＡＴＰ酶能帮助植物细胞维持其离子平衡。本
研究发现在干旱胁迫２４ｈ和４８ｈ后，有３个蛋白
点（Ｒ５３，Ｒ５４，Ｒ５５）丰度下调。Ｈｕｓｅｙｎｏｖａ等［２３］
发现干旱胁迫下２种小麦ｇｉｙｍａｔｌｉ－２／１７（干旱敏
感）和ａｚａｍａｔｌｉ－９５（耐旱）的ＡＴＰ合酶β亚基丰度
下调。氨基酸代谢是植物体内重要的代谢过程，
且极易受干旱胁迫影响。本研究发现，根中大部
分氨基酸代谢相关蛋白在干旱处理后下调表达，
部分蛋白的丰度在干旱处理后上升，如谷氨酸脱
羧酶（Ｒ６５），在γ－氨基丁酸（ＧＡＢＡ）的代谢过程
中发挥关键作用，对维持干旱胁迫下野生一粒小
麦根中碳氮平衡具有重要作用［２４］。
３．４　解毒和防御相关蛋白
植物主要采用两种机制来消除外界胁迫产生
的有害物质，一种是非酶抗氧化剂，包括抗坏血酸
和谷胱甘肽，另一种是酶途径，如超氧化物歧化
酶、抗坏血酸过氧化物酶、谷胱甘肽过氧化物酶和
过氧化氢酶［２５］。本研究发现有９种差异表达的
蛋白质（ＤＥＰＳ）与细胞防御相关，其中８种蛋白质
在干旱处理后２４ｈ、４８ｈ上调表达，只有１种蛋
白质下调表达，表明干旱胁迫导致野生一粒小麦
根的抗氧化和防御能力提升，与干旱胁迫下野生
一粒小麦叶片中抗氧化相关蛋白的变化模型一
致［１３］。
３．５　蛋白质的生物合成和代谢相关蛋白
本研究发现有３种差异蛋白质参与了转录和
翻译，分别为双链ＤＮＡ结合蛋白Ａｌｂａ（Ｒ７４），假
定的核酸酶 ＨＡＲＢＩ１－ｌｉｋｅ（Ｒ７５），肌苷单磷酸脱
氢酶（Ｒ７６）。这３种蛋白的过度表达，反映了对
核苷酸营养的更高需求，增强了干旱胁迫下小麦
根系基因的转录活性［２６］。
真核生物翻译起始因子３（ｅＩＦ３）的２个亚基
（Ｒ７２和 Ｒ７３）下调表达抑制了翻译过程，因为
ｅＩＦ３帮助 ｍＲＮＡ 与４０Ｓ核糖体亚基结合，使
ｅＩＦ２－ＧＴＰ－Ｍｅｔ－ｔＲＮＡｉＭｅｔ三元络合物与４０Ｓ
亚基更加稳定，另外，它还在扫描和识别ＡＵＧ起
始密码子中起作用［２７］。因此，它的下调表达增加
了野生一粒小麦根在干旱环境中错误蛋白质的合
成和折叠。
植物可以通过产生分子伴侣纠正错误折叠的
蛋白质。本试验结果显示，５个热休克蛋白（Ｒ４６，
Ｒ４７，Ｒ４８，Ｒ４９和Ｒ５１）和１个ＴＣＰ－１蛋白为重
要的分子伴侣，它们在干旱胁迫时显著下调。热
休克蛋白主要参与其他蛋白质的折叠和展开，在
·６２７· 麦　类　作　物　学　报　　　　　　　　　　　　　　　　　　第３６卷
植物遭受非生物逆境胁迫时一般含量增加，以重
建正常的蛋白质构象和保持植物细胞稳态，如干
旱胁迫下的普通小麦叶片［２８］与水稻根［２９］中，热休
克蛋白均上调表达。本试验中所检测的分子伴侣
蛋白大部分下调表达，与前人的研究结果不一致，
具体原因有待进一步研究。
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Ｄｒｏｕｇｈｔ－ｉｎｄｕｃｅｄ　ｌｅａｆ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ　ｉｎ　ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ　ａｎｄ　ｔｏｌ－
ｅｒａｎｔ　ｗｈｅａｔ　ｖａｒｉｅｔｉｅｓ［Ｊ］．Ｂｕｌｇａｒｉａｎ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓ－
ｉｏｌｏｇｙ，２００７，３４（１－２）：．
［２９］Ｍｅｈｄｉ　Ｍ，Ｎｅｄａ　Ｓ，Ｅｌｈａｍ　Ｓ，ｅｔ　ａｌ．Ｓｈｏｔｇｕｎ　ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ　ａｎａｌｙｓｉｓ
ｏｆ　ｌｏｎｇ－ｄｉｓｔａｎｃｅ　ｄｒｏｕｇｈｔ　ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　ｉｎ　ｒｉｃｅ　ｒｏｏｔｓ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ
ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｏｍｅ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０１１，１１（１）：３４８－３５８．
·７２７·第６期 李鲜花等：野生一粒小麦根干旱响应蛋白的筛选与鉴定