全 文 ：收稿日期:2014-10-13
基金项目:宁夏科技攻关宁陕合作项目(2002190102);宁夏医科大学校级项目(XQ201202)
* 通讯作者:陈靖，E-mail:chenjing2005@ 126. com。
正交设计优化老瓜头活性成分 7-脱甲氧基
娃儿藤碱提取工艺研究
万清玉1，高晓娟1，2，吴秀丽1，2，付雪艳1，2，卢 杰1，陈 靖1，2*
(1. 宁夏医科大学药学院，宁夏 银川 750004;2. 宁夏回药现代化工程技术研究中心，宁夏 银川 750004)
摘要 目的:优选老瓜头中镇痛抗炎活性成分 7-脱甲氧基娃儿藤碱的提取工艺。方法:以 7-脱甲氧基娃儿藤
碱含量为评价指标，采用正交设计 L9(3
4)结合方差分析对甲醇浓度、料液比和超声提取时间 3 个因素进行优选。
结果:7-脱甲氧基娃儿藤碱的最佳提取工艺条件为:80%甲醇，料液比为 1∶ 10，超声提取时间 30 min。验证试验表
明 7-脱甲氧基娃儿藤碱的提取率为 308. 17 ± 2. 3 μg /g(ＲSD = 0. 7%，n = 3)。结论:该实验优化的 7-脱甲氧基娃儿
藤碱最佳提取工艺稳定、可靠。
关键词 正交设计;老瓜头;7-脱甲氧基娃儿藤碱;提取工艺
中图分类号:Ｒ286. 2 文献标识码:A 文章编号:1001-4454(2015)06-1303-03
DOI:10. 13863 / j. issn1001-4454. 2015. 06. 048
老瓜头 Cynanchum komarovii Al . Iljinski系萝摩
科鹅绒藤属植物，别名牛心草、芦芯草、黑心脖子等，
为多年生灌木，广泛分布于次生沙漠中的半固定沙
丘和荒漠流沙区，在我国内蒙古、宁夏、甘肃等省
(区)资源丰富〔1〕。老瓜头所含化学成分种类繁多，
主要包括菲骈吲哚里西啶类生物碱〔2，3〕、黄酮类、糖
类、脂肪酸及其酯类、甾体类化合物〔4〕等。全株有
毒，总生物碱具有镇痛、抗炎、增强免疫、祛痰、止咳
等药理活性〔5，6〕，其中 7-脱甲氧基娃儿藤碱在老瓜
头生物碱中含量最高，有研究〔7-9〕表明 7-脱甲氧基
娃儿藤碱对多种病菌具有显著的抑菌活性，还有除
草和抗肿瘤等作用，为老瓜头镇痛抗炎活性成分之
一。故本实验以 7-脱甲氧基娃儿藤碱提取率为评
价指标，优化老瓜头提取工艺中甲醇浓度、料液比和
提取时间 3 个因素的最佳水平，以期为老瓜头的开
发利用奠定基础。
1 仪器与材料
1. 1 仪器 AL204 电子天平(梅特勒-托利多仪器
(上海)有限公司)，KQ-500E型超声波清洗器(昆山
市超声仪器有限公司);pH计 FE20(梅特勒-托利多
仪器(上海)有限公司);日立 D-2000 液相色谱仪
(日立公司)。
1. 2 材料 2010 年 5 月在宁夏古窑子采集野生老
瓜头全株 10 kg，阴干备用。由宁夏医科大学杨卫东
副教授鉴定为萝摩科鹅绒藤属植物老瓜头 Cynan-
chum komarovi Al. Iljinski 的干燥全株。甲醇(分析
纯，天津市大茂化学试剂厂)，超纯水，甲醇、乙腈
(色谱纯，美国 Fisher 公司)，磷酸二氢钾(分析纯，
瑞金特化学品有限公司)，三乙胺、磷酸(分析纯，天
津市大茂化学试剂厂)。7-脱甲氧基娃儿藤碱对照
品由本实验室从老瓜头中提取，质量分数≥95%，无
色针晶，mp 210 ～ 212 ℃，TLC硅胶板上紫外灯下显
蓝色荧光，经1H-MNＲ、13 C-NMＲ 和 2D-NMＲ 数据，
结合文献〔4〕确定为 7-脱甲氧基娃儿藤碱。
2 方法与结果
2. 1 含量测定方法的建立
2. 1. 1 色谱条件:色谱柱为 Packed Column 3 C18-
EB(250 mm × 4. 6 mm，3 μm);流动相为乙腈(A):
0. 05 mol /L磷酸二氢钾缓冲液(pH 6. 00，含 0. 1%
三乙胺)(B)= 1∶ 1;柱温 35℃;进样体积 20 μL;流
速 0. 8 mL /min;检测波长 260 nm。
2. 1. 2 对照品溶液的制备:精密称取 7-脱甲氧基
娃儿藤碱对照品 8. 8 mg，甲醇加热溶解并定容至 10
mL，制得对照品储备液(0. 88 mg /mL)，备用。
2. 1. 3 供试品溶液的制备:精密称取过 65 目筛的
老瓜头药材粉末 1 g，加甲醇 10 mL超声(500 W，40
kHz)提取 30 min，放冷补重，过滤，取滤液 4 mL 定
容于 10 mL量瓶中，过 0. 45 μm微孔滤膜，即得。
2. 1. 4 专属性试验:取对照品储备液加甲醇稀释
得对照品溶液，按“2. 1. 3”项下方法制备供试品溶
液，将对照品和供试品溶液分别进样测定，计算 7-
脱甲氧基娃儿藤碱与相邻杂质峰分离度大于 1. 5，
理论板数按 7-脱甲氧基娃儿藤碱计算大于 3 000，表
明其他组分对 7-脱甲氧基娃儿藤碱的测定没有干
扰。
2. 1. 5 标准曲线的绘制:精密移取适量对照品储
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备液，加甲醇稀释制成浓度分别为 0. 11、1. 1、2. 2、
4. 4、8. 8、17. 6、35. 2、52. 8、70. 4 μg /mL 的对照品溶
液，进样测定峰面积，以峰面积对浓度进行线性回
归，得回归方程 Y = 93649X － 20052，r = 0. 9999，表
明 7-脱甲氧基娃儿藤碱在 0. 11 ～ 70. 4 μg /mL 浓度
范围内与峰面积线性关系良好。
2. 1. 6 日内、日间精密度:取 2. 2、4. 4、8. 8 μg /mL
三个不同浓度的对照品溶液，分别于 0、1、2、4、8、12
h进行测定，计算 ＲSD值，得日内精密度;分别于 1、
2、3、4 d进行测定，得日间精密度。结果见表 1，日
内、日间精密度均符合要求。
表 1 日内、日间精密度结果
对照品溶液 /
(μg /mL)
日内精密度
ＲSD /%
日间精密度
ＲSD /%
2. 2 3. 8 0. 6
4. 4 0. 5 0. 2
8. 8 0. 4 0. 5
2. 1. 7 稳定性试验:按“2. 1. 3”项下方法制备供试
品溶液，分别于 0、2、4、8、12、24 h 进样测定，ＲSD 值
为 0. 4%，表明供试品溶液在 24 h内稳定。
2. 1. 8 重复性试验:按“2. 1. 3”项下方法制备供试
品溶液 6 份，随行 8. 8、35. 2 μg /mL 两个浓度对照
品，进样测定，外标两点法计算 7-脱甲氧基娃儿藤
碱的提取率为 301. 19 ± 2. 2 μg /g(n = 6)，ＲSD 为
0. 7%。
2. 1. 9 加样回收率试验:精密称取适量已知含量
的供试品 9 份(低、中、高浓度各 3 份)，低、中、高浓
度样品分别精密加入 0. 88 mg /mL 对照品溶液
0. 16、0. 20、0. 24 mL，按“2. 1. 3”项下方法制备供试
品，进样测定，计算加样回收率。结果平均加样回收
率为(96. 7 ± 0. 05)%，ＲSD为 5. 4%。
2. 2 提取工艺 精密称取过 65 目筛的老瓜头药
材粉末 1 g，根据正交设计进行提取试验，提取液放
冷补重后过滤，取滤液 4 mL 定容至 10 mL，用前过
0. 45 μm微孔滤膜，即得。
2. 3 正交设计试验 根据文献〔10-12〕与单因素试验
结果，选取甲醇浓度(A)、超声提取时间(B)、料液
比(C)为考察因素，设计 4 因素 3 水平正交试验 L9
(34)，如表 2 所示，根据正交设计(表 3)，按“2. 2”
项下提取工艺提取 9 份试验样品，进样测定，根据外
标两点法计算 7-脱甲氧基娃儿藤碱提取率，正交试
验结果及方差分析见表 3、4。
由表 3 中 Ｒ值可以看出，对 7-脱甲氧基娃儿藤
碱提取率的影响大小顺序依次为 A ＞ B ＞ C，结合各
因素Ｒ值直观比较，得出理论上最佳工艺条件是
表 2 因素与水平
水平
A甲醇
浓度 /%
B超声提
取时间 /min
C料液比 /
(g /mL)
1 60 30 1∶ 10
2 80 45 1∶ 12
3 100 60 1∶ 15
表 3 正交设计试验结果
试验号 A B C D(误差)
7-脱甲氧基
娃儿藤碱提
取率 /(μg /g)
1 1 1 1 1 184. 495
2 1 2 2 2 194. 945
3 1 3 3 3 216. 382
4 2 1 2 3 316. 859
5 2 2 3 1 341. 649
6 2 3 1 2 342. 093
7 3 1 3 2 310. 296
8 3 2 1 3 313. 377
9 3 3 2 1 342. 305
K1 595. 822 811. 650 839. 964 868. 449
K2 1000. 601 849. 971 854. 109 847. 334
K3 965. 978 900. 779 868. 327 846. 618
Ｒ 134. 926 29. 710 9. 454 7. 277
A2B3C3，即 80%甲醇，料液比为 1 ∶ 15，超声提取 60
min。但由表 4 方差分析结果可以看出，因素 A 的
影响非常显著(P ＜ 0. 01)，因素 B 和 C 的影响均不
显著(P ＞ 0. 05)。故从实际考虑，选取 A2B1C1 为最
佳工艺条件，即 80%甲醇，料液比1∶ 10，超声提取 30
min，保证较高提取率的同时，尽量减少甲醇用量，节
省提取时间。
表 4 正交试验方差分析
方差来源 平方和 自由度 均方和 F P
A 11187. 4 2 5593. 7 327. 287 ＜ 0. 01
B 444. 219 2 222. 110 12. 996 ＞ 0. 05
C 44. 693 2 22. 346 1. 307 ＞ 0. 05
D(误差) 34. 182 2 17. 091
注:F0. 01(2，2)= 99. 00，F0. 05(2，2)= 19. 00
2. 4 验证试验 用优选出的工艺条件进行验证试
验(n = 3)，测得 7-脱甲氧基娃儿藤碱的提取率为
308. 17 ± 2. 3 μg /g，ＲSD 为 0. 7%，说明正交试验优
选出的工艺是可信的。
3 讨论
3. 1 7-脱甲氧基娃儿藤碱是老瓜头中含量最高的
生物碱(含量约为 0. 03%)，也是老瓜头主要的镇痛
抗炎活性成分，因此可作为老瓜头重要的药效指标
之一。
生物碱是植物体内存在的一类大多具有生理活
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性显弱碱性的物质，根据其特性，实验前期尝试了用
酸醇液进行提取，原因在于使其成盐后更易于提取，
如郭金玲等〔13〕发现酸性工业酒精对总生物碱的提
取率显著优于酸性水，pH为 1 ～ 2 时提取率最高，但
本文预试验结果发现酸性甲醇与甲醇相比并未显著
提高含量，且方法重现性较差，可能与酸的种类和
pH值有关，后期仍需进一步优化。米海莉等〔14〕也
发现乙醇热回流比酸水的总生物碱提取量高，且
60%乙醇比 80%的高，但 60%乙醇的提取液极性
大，杂质多，给下一步的浓缩、精制带来困难。本文
以 4 因素 3 水平正交试验设计为优化方法，首次优
选了 7-脱甲氧基娃儿藤碱的提取工艺条件，该方法
简便可靠，更利于单体化合物的进一步精制纯化。
3. 2 本文建立了 7-脱甲氧基娃儿藤碱 HPLC-UV
含量测定方法，该方法简便、可靠、灵敏度高(LLOQ
=110 ng /mL，LLOD = 33. 3 ng /mL)，流动相经试验
发现磷酸二氢钾缓冲液分离效果比磷酸二氢钠好，
且浓度为 0. 05 mol /L 时效果最好，流动相的 pH 在
6 左右时，对分离影响很明显，加入三乙胺后可防止
生物碱拖尾，使目标化合物与干扰组分达到最好的
分离效果，本法为改善生物碱类化合物的色谱行为
提供了参考。
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