全 文 ：1卯8 年第 2期 (总第4 9期 )贵 州 茶 叶
茱叶中与醉类春气形成有关的俘一扭草幼戒. 的分离与特性
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,
K e nj i O g a’ W a
,
K az 叮 0 Y
amu
e h i等
绝大多数茶叶香气组分在鲜叶中不存在
或含量极低 。 业已证明 , 茶叶制造过程中香气
形成机理是氧化 (母一 紫萝酮及其进一步氧化
产物 ) 、 过氧化 (叶醇等 ) 、 热降解 (氨基酸形成
醛 )及酶性水解 (醇类香气 ) 。 单菇烯及芳香醇
的酶促是形成茶叶花香的原因 , 近年来已引起
重视 , 但这种机理的分子基础还不甚清楚 。 从
鲜叶中已分离出`香气前体的香叶醇 、 芳樟醇 、
苯甲醇 、 2 一 苯乙醇 、 ( z) 一 3 一 已烯醇 、 水杨酸
甲醇 、 芳樟醇氧化物 I 一 W 的糖昔 。 我们已报
道了蔽北种鲜叶中的主要糖贰酶 一 樱草糖贰
酶的初步纯化及特征 , 这里将详细报道该酶的
纯化和特征 。
材料与方法
茶鲜叶 蔽北种鲜叶采回后贮于冰箱中 ,
然后在室温 ( 25 ℃左右 ) 下摊放 4 一 5小时 (萎
凋 ) ,最后贮于 一 20 ℃下备用 。
糖普香气前体溶液制备 茶鲜叶 (数北
种 ) 的热水抽提液用 九闹阮 r l let XAD 一 2 柱色谱
得到糖昔部分 (含 40 一 60 % 甲醇 ) , 用活性炭柱
色谱处理 、浓缩 ,用作糖昔香气前体混合液 。
香气前体酶促反应条件的确定 水解香
气前体的酶活性用鲜叶制备的粗酶 (丙酮粉 )
经一系列试验测定 [在 5伪 IM 柠檬酸 (PH S . 0) 、
5加抓 乙酸 (PH S . 0 ) 或 5伍” 州叹h s 一 H e l ( PH 7 . 3 )
缓冲液中 ] 最佳条件为 5伍1说 柠檬酸缓冲液
( PH S
.
0) 与约 0 . 19 丙酮粉 (从 0 . 飞鲜叶中制
得 )作用 1小时 。
酶对对硝基苯 ( p Np )糖昔的水解活性的测
定 从 CM 一 手万叩ealr
.
65 0M 柱分离得到的每
一区带 (见下面 ) , 均测定其对硝基苯单糖昔
(俘一 D 一 葡糖基 一 毗喃糖昔 、 p 一 D 一 甘露基
一 毗喃糖昔 、 p 一 D 一 牛乳糖毗喃糖昔 、 a -
L 一 阿拉伯糖毗喃糖昔 )的酶活性 , 每区带酶样
品液 ( 30 一 10 拼 l) 与对硝基 单糖昔 水溶液
(《 刃拜 l) 及 2 0n 说 柠檬酸缓冲液 (PH 6 . O , 70 -
7 70 拼 l ) 混合 , 于 37℃下反应 一5 分钟 , 加 I M
N兔 C伪 ( 50 川 , 总体积为 1 . 5而 ) 终止反应 , 在
4 05 mn 处测定消光值 。
从鲜叶中纯化樱草糖普酶 操作过程如
图 l 。 蔽北种鲜叶 ( 1 一 4 叶 )按传统丙酮粉制备
法制备丙酮粉 。 丙酮粉于 0 . IM 柠檬酸缓冲液
( P H S
.
0 ) 中在 4℃ 下 搅 拌 3 小 时 , 4℃ 下 ,
3 5X( X) x g 离心 2 0 分钟 , 于缓 冲液抽提液中加
入丙酮到 50 % , 溶液在 4℃ 下搅拌 , 并过夜 。
4℃下 , 35 〔洲〕X g 离心 20 分钟得沉淀 , 沉淀溶
解于 0 . I M 柠檬酸缓冲液 (PH 6 . 0) 中 , 然后用
传统的硫酸按沉淀法沉淀 。
用 4 0 一 80 %硫酸铁沉淀 、 分离 , 得到的酶
溶于 3肠n l 0 . I M 柠檬酸缓冲液 ( PH 6 . 0) 中 , 并
在 4℃下用 2加讨 柠檬酸缓 冲液透析 19 小时 ,
透析后的酶的一部份 ( 5飞 当量丙酮粉 )置于已
用 2场刘M 柠檬酸缓冲液 (PH 6 . 0) 平衡的 CM -
肠 y o ep alr 6 5 0] M柱 (小3 0 x 15 5m
,
12 5而 ) , 然
后洗脱 。
醇类香气的释放与 尽一 葡糖 贰酶活性密
切相关 ,酶的进一步纯化按 日一葡糖贰酶活性
为指导 。 从 CM 一 肠y o eP alr 柱得到 的糖贰酶一
1 区带浓缩 , 并用 iD川。 膜在 4℃下超滤脱盐 ,
然后用经 2加砚 柠檬酸缓冲液 ( PH 6 . 0) 平衡后
的 M o n o 5 HR S / 5离子交换柱 ( 小5 x 5伪刀11 )进
行快速蛋白质层析 ( FP LC ) , 得 C ls 一 n a 和 n
b
,
G l一 n a 用 M~ S 柱再层析以进一步纯
化。
G l 一 l a 的凝胶过滤色谱分析 糖贰酶 1
a 用 Su拌记e x 75 柱 〔争10 x 3 0压mn , 2仓俪M 柠檬酸
贵 州 茶 叶 l卯8 年第 2期 (总第 9 4期 )
缓冲液 (H P 6
.
0 )
, 流速 0 . s ml / 分 ]进行 凝胶过
滤层析 , 并以传统方式与 砰 LG 系统相连 , 用
细胞色素 C 、 肌红蛋白 (马 ) 、 清蛋白 (鸡蛋 ) 、 过
氧化氢酶 (牛 ) 等作为标准蛋白质 , 测得 G l -
n a 为 以水刀 a 。 纯化糖贰酶 G l 一 n a 的 SD S -
P AGE 分析 : 高度纯化的 C l 一 n a 在常规的还
原及非还原条件下用 SDS 一 P AGE 分析 , 此分
析在 义b 1A 下进行 3 小时 , 凝胶 片用 0 . 1 5%
考马斯亮蓝 R 一 乃0 染色 , 测得 G l 一 n a 为
6 l KD a
o
结果与分析
在乌龙茶鲜叶 中分离出来的绝大部分醇
类香气前体为樱草糖昔 , 这表明在鲜叶中不仅
有 p 一 葡糖贰酶 , 还有另外的糖贰酶 (樱草糖
贰酶 )水解香气前体 。
分离出的香叶醇 、 ( s ) 芳樟醇的 日一 樱草
糖贰混合物作为香气前体 , 用 p 一 葡糖昔酶 、
袖皮昔酶 、 从鲜叶中制备的酶及丙酮粉分别处
理 。 丙酮粉对两种糖昔均表现 出高活性 , 而
p 一 葡糖昔酶和袖皮昔酶对香叶基樱草糖昔表
现出一定程度的水解活性 , 但对 ( s ) 一 芳樟醇
的樱草糖昔的水解活力极低 , p 一 葡糖昔酶的
活性特别低 , 这也强有力地说明在茶叶醇类香
气分子形成过程中存在其它特定的酶 。
酶的纯化过程见图 1。 从数北种制备的酶
丙酮粉中抽提的粗酶液 , 经过丙酮沉淀和硫酸
按沉淀 , 然后用 CM 一 手万。详肛 1柱层析 ,每一区
带均测定其对硝基苯 p Np 的单糖昔 [p 一 D -
葡糖昔 ( G玫 ) , 乒一 D 一 木糖昔 (勒 l) , p 一 D 一 半
乳糖昔 (aG l) , a 一 L 一 阿拉伯糖昔 ( Ala ) 的活
性 , 然后 按活性表现将其分为 7 个组 (A -
G )
。
茶鲜叶 (获北种 )
f 添加丙酮到 50 % , 4℃下搅拌并过夜
几 17 仪众 p n l , 4℃下 离心 2众` n
沉淀
l 溶解于 10压。 M 柠檬酸缓冲液 (PH 6 . 0) 中
(哪玉沁沁 到 40 % 一 80%饱和度
17 X( h仙 , 4℃下 离心 2加血
沉淀
! 透析
贬CM : 肠 yo pe ar l 65 0 M
糖替酶 一 I
( 2压nM 柠稼酸缓冲液 PH 6 . 0)
nI
M咖 S 】扭 ( 2众n M 柠样酸缓冲液 , PH 6 . 0)
丙酮中均质 ( 一 20 ℃ )
用丙酮洗涤 ( 一 20 ℃ )
丙酮粉
`加 10压刀M 柠禅酸缓冲液 ( PH 6 . 0) , 搅拌 3 小时
1175 仪冲m , 4℃离心 2腼 n
缓冲液抽提物
糖替酶 一 n a n b
( p 一 樱草精武踌 )
图 .l 茶叶中樱草精普酶的纯化
每一组用从鲜叶中制备的粗香气前体溶液
处理 ,从 E 和 F 组中产生了如香叶醇 , 2 一 苯甲
醇 , 苯乙醇 、芳樟醇等醇类香气分子 , 这两组也
分别表现对 pNP 一 Xy l 和 pNP 一 lcG 的水解活
性 。 由于 F 组表现出主要释放香气的活性 , 对
这 区带酶的进 一搜步纯化由其对 pN p 一 lG c 的活
性来评价 。
从 CM 一 予叮件犯留1 6 5 0M 柱层析的糖昔酶
的三个活性区带 lG 一 I 一 n 一 1 用从鲜叶中
分离出的几种 p 一 樱草糖昔处理 , 每一区带酶
样对每一种 日一 樱草糖昔的水解活性表示为
对香叶基 p 一 樱草搪昔的相对活力 。 虽然这些
糖基昔有相同的糖基 , 但水解速率很不相同 。
所有 lG 区带酶样表 现 出很高的配糖基特异
性 。 香叶基 乒一 樱草糖昔能有效地被所有酶样
水解 , 当香叶基 p 一 樱草糖昔被 10 %水解时 ,
( s) 琳哪基 p 一樱草糖昔仅能被 lG 区带水解约
60 %
。
lG 一 n 的主要部分对所测试的几种樱草
糖昔的水解活性均最高。 并对每种樱草糖昔的
水解活性也与丙酮粉十分相似 ,表明 lG 一 1含
有释放茶叶醇类香气的主要酶 。
为了评价 G l 一 工 、 一 n 、 一 m各区带对
p
一 樱草糖昔和 p 一 葡糖昔基质的特异性 , 用
苯甲醇和香叶醇的 p 一 樱草糖昔及 p 一 葡糖
昔 , 作为底物分别进行水解试验 。 每一区带酶
对香叶基 一 月一 D一 葡糖昔的水解速率均明显
低于对 尽“ 樱草糖普 , 对苯基糖昔 , lG 一 I 和
n 区带分别表现出对 p 一 葡糖昔和 乒一 樱草糖
昔的特异性 , 而 lG 一 班却没有显著差异 , 这表
明 lG 一 1 区带含 有茶 叶中醇类香气形 成的
p
一 樱草糖昔酶 。
已有报道表明 , 植物中 p 一 糖昔酶对特定
植物糖昔能很好地适应 , 并且对糖昔的糖昔配
基及糖基部分具有很窄的特异性 。 G l 一 I 、 -
n 和 一 1 酶活性的差异可以提供一些香气形
成机理的信息 , 可以认为涉及到多种酶 , 主要
的酶是 p 一樱草糖昔酶 。
为 了检验 lG 一 n 区带对 p 一 樱草糖昔的
水解机理 , 将香叶醇 、 芳樟醇 、 2 一 苯乙醇 、苯 甲
醇的 队 樱草糖昔的混合物与 lG 一 n 区带作用 , 然后用纤维素板薄层层析 (正丁醇 : 毗咤 :
凡O 二 6 : 4 : 3) , 检测从 俘一 樱草糖昔上释放出
的糖 , 用邻苯二甲酸苯氨检测出与蔗糖 ( fR 二
0
.
29 )及麦芽糖 ( 0 . 23 )相近处有一斑点 ( 0 . 27 ) ,
而不是葡糖 ( 0 . 34 )或木糖 (0 . 43 ) 。 将另一层析
板上与该斑点相应的位置刮下 , 用水抽提 , 抽
提物用 FABM S (负 )分析 , 在 m/ Z 3 1 1 ( [M 一 H ] 一 )
处观察到一峰 , 这些结果 证实 lG 一 n 区带在
糖配 一 基搪昔键水解 p 一 樱草糖昔 , 确切表明
cl 一 n 区带含有樱 p 一 草糖昔酶 。
lG 一 1 区带用 M o on 5 H R 柱进一步层析 ,
得到两个活性区带 : G l 一 l a 和 一 n b , 对
lG 一 n a( 主要酶 )用 uS 琳 dr e x 7 5 柱进行快速蛋
白质液相色谱分析 , 在约印KD a 处表现出一活
性峰 。
对高度纯化的 lG 一 n a 在还原及非还原条
件 下进行 SDS 一 PAG E 分析 , 在 l6 KD a 处出现
一条谱带 。 SDS 一奴G E 与凝胶过滤色谱一致的
结果表 明 , lG 一 l a 的是 一 l6 KD a 的单体蛋
白 ,等电聚焦分析表明 , lG 一 l a 的 IP 为 9 . 40
用 p Np 一 G LC 测定悦 一 n a( 樱草糖昔酶 )
的性质 , lG 一 n a 在 45 一 50 ℃ 表现 出最高活
性 ,在 45 ℃ 以下稳定 。 对 p N P 一 G玫 的最适 PH
为 5 左右 、 在 PH S 一 7 范围内稳定 ( > 90 % ) 。
王云译自 iB osc i . B i o t ec h . B ioc h e m ,印 ( 1 1)
一8 10一 5 14 , 19 6 娜东海 校
(上接第 35 页 ) 市场将会更大 , 我国近几年出
现的名茶机械制茶热也很能说明问题 。 比如杭
州地区 , 1995 年 一 19 6 年推广名茶多用机达
43 8 台 , 茶叶产值上升到科23 万元 , 共生产加
工了 69 . 5 吨茶 , 杭州名优茶投人产出比为 1 :
3
, 江苏为 1 : 3 . 3 , 原来杭州地区手工炒龙井成
本为 13 元 / 吻 , 机制为 6 . 01 元 / kg , 节约成本
50 %
, 还有杭州桐庐地区机制成本为 n 元 /
掩 ,平均为 8 . 65 元 ,而手工炒 2 元 / 叻 , 平均为
23 元 , 仅成本就节省 59 . 5% , 从工效看 , 手工
为 1 . 5吻 /小时 ,机制为 6钩 , 提高 3倍 , 这样的
效益 , 有利于结构调整 ,有利于资源重组 , 有利
于上规模及质量统一 , 提高了茶叶产业化和市
场竞争能力 。
5
、 树立大市场与现代营销相统一 , 现代科
技与传统方法相结合的观点与方法 。 茶业工程
要发展 , 必然要走高科技 , 多投人 , 深提练 , 集
团化营销的路子 , 否则 , 我们就难于参与国际
大循环竞争 , 比如我国机制炒青茶每 50 叻需要
2 一 3 个工 , 而 日本加工 5 k0 g蒸青茶则需 0 . 1 -
0
.
3个工 , 印度加工 50 均小℃毛茶则需 0 . 15 个
工 , 肯尼亚则需 0 . 25 个工 , 在机械方面 , 台湾
省还应用了 AB S 缓冲机构 , 立足于继承传统 ,
不盲 目仿造 , 但要提升品度 。 加快开发新产品
速度 , 降低技术与操作难度 , 节约能源与节省
成本 , 还要考虑环保和国际标准化 。 企业的体
制 ,经营机制适应市场竞争环境 。
中国的茶业工程在经济体制改革的推动
下 , 在一大群有识之士的努力下 , 必然会走出
低谷走向辉煌 , 这也是我们茶界同仁的 自信 ,
也是必然能达到的 目的 。