全 文 ：新疆小叶桦及其新变种的 ISSR 分析1
有祥亮 1，崔心红 1，朱义 1，何小丽 1，王健 2
（1.上海市园林科学规划研究院，上海 200232；2.新疆阿勒泰地区林业科学研究所，新疆 阿
勒泰 836500）
摘 要：用ISSR(Inter-simple sequence repeat)技术对60份小叶桦(Betula microphylla Bunge)及
变种进行了系统进化分析；从100个引物中筛选出8个可以扩增出多态、重复性好的引物；用
该8个引物对全部供试材料的DNA多态性进行检测，共扩增出3029条谱带，其中多态性条带为
2525条，多态性比率为83.4％。聚类分析结果表明，供试材料相似系数介于0.84-0.90之间，
平均相似系数为0.85。取相似系数0.847可将供试材料分为6个类群。小叶桦及其变种在DNA
水平上的遗传多样性与形态学特征较一致。该研究为小叶桦类群间的鉴别和优良类群确定及
杂交育种等提供了重要的理论依据。
关键词：小叶桦；变种；ISSR；遗传多样性；形态学特征
中图分类号：S687.3 文献标识码：A
ISSR Analysis of Betula microphylla Bunge and New
Varieties in Xinjiang
YOU Xiang-liang1, CUI Xin-hong1, ZHU Yi1, HE Xiao-li1, WANG Jian2
(1.Shanghai Academy of Landscape Architecture Science and Planning, Shanghai 200232,China；
2.Xinjiang Altay Forestry Research Institute, Altay 836500, China)
Abstract: Sixty Betula microphylla and their variety samples were analyzed by ISSR
(Inter-simple sequence repeat) technique to study their taxonomic and phylogenetic relationships.
Eight polymorphic and reproducible primers were screened from100 primers. A total of 3029
ISSR bands were amplified, A total of 3029 bands were amplified, of which 2525 were
polymorphic bands, and the polymorphic rate was 83.4%. According to ISSR-PCR results, a
cluster analysis (UPGMA) was conducted to generate a dendrogram. The results showed that the
similarity coefficient of the tested materials were between 0.84-0.90, the average similarity

收稿日期：2016-07-20
1 基金项目：国家林业公益性行业科研专项（201404119）
作者简介：有祥亮（1965-），博士，高级工程师，研究方向：抗逆性园林绿化植物繁育与应用。
E-mail:youxiangliang@sina.com
网络出版时间：2016-12-26 15:56:41
网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/31.1837.S.20161226.1556.022.html
coefficient was 0.85. The test materials were divided into 6 groups at the level of 0.847. The
genetic diversity and morphological characteristics of Betula microphylla and its varieties at the
DNA level were more consistent. The study provided an important theoretical basis for the
identification of the different taxa and confirmation of excellent taxa and cross breeding in Betula
microphylla.
Key words: Betula microphylla; variety; ISSR; genetic diversity; morphological characteristics
新疆幅员辽阔，桦木属（Betula L.）植物种类丰富。进入新世纪以来，新变种和新纪录
种相继被发现和命名。据杨昌友等（2006年）研究，新疆桦木属新增1新亚组即桦木亚组
（Subsect.II-Microphyllae C.Y.Yang et J. Wang Subsect. nov.），小叶桦（Betula microphylla
Bunge）5个新变种即宽苞小叶桦(B. microphylla Bunge var. latibracteata C. Y. Yang var. nov.)、
哈纳斯小叶桦(B. microphylla Bunge var. harasiica C. Y. Yang var. nov.)、沼泽小叶桦(B.
microphylla Bunge var. paludosa C. Y. Yang et J. Wang var. nov.)、土曼特小叶桦(B.
microphylla Bunge var. tumantica C. Y. Yang et J. Wang var. nov.)和艾比湖小叶桦(B.
microphylla Bunge var. ebinurica C. Y. Yang et W. H. Li var. nov.)和一个新纪录种即列氏桦(B.
Rezniczenkoana)[1]。
因地域条件差异而形成的众多小叶桦变种具有不同的抗逆性能。其中，以沼泽小叶桦
的耐水湿、耐盐碱性能引起了较多的关注[2]。上海作为东部沿海城市，绿化造林区域中低湿、
盐碱立地占有较大比重。为丰富该类区域的绿化造林树种，上海市园林科学规划研究院一直
致力于沼泽小叶桦的引种试验研究[3]。从引种后的形态特征观察，沼泽小叶桦作为小叶桦的
一个变种，与原变种小叶桦之间以及与其他变种之间有许多形态上的相似之处，甚至有种与
变种之间、变种与变种之间的过渡形态。为了更好地鉴别和区分沼泽小叶桦与原种小叶桦以
及其他变种，本研究从新疆小叶桦的主要地理分布区-阿勒泰山区引进300余株来自不同居群
的小叶桦及其变种3年生实生苗种植于上海园科院邬桥试验基地。2014年6月从旺盛生长的植
株上，根据径、枝、叶、果的不同形态特征选取60个叶样进行ISSR分析，以期为不同的形
态特征寻找遗传基础的差异性，进而为小叶桦及其不同变种的形态分类提供遗传学依据。
1 材料与方法
1.1 材料
材料来源：新疆阿勒泰地区林业科学研究所试验苗圃的3年生小叶桦播种苗。种源分别
来自阿勒泰山林缘（小叶桦）、山地河谷（宽苞叶小叶桦、哈纳斯小叶桦），吉木乃县荒漠
沼泽地（沼泽小叶桦）、荒漠灌木草原（吐曼特小叶桦），精河县潜水沼泽地（艾比湖小叶
桦）。
供试的60份材料皆为2014年夏季取自上海市园林科学规划研究院邬桥基地。选取完整
新鲜的嫩叶用液氮速冻处理后于-70℃冰箱中贮藏备用。
1.2 方法
DNA提取与检测：采用改进的CTAB法提取叶片DNA[4]，使用0.8％琼脂糖凝胶电泳检
测其完整性，-20℃保存备用。
ISSR-PCR扩增体系：选择加拿大英属哥伦比亚大学（University of British Columbia）
公布的100个（Set No.9, No.801-900）引物作为本试验的备选引物，由北京鼎国昌盛生物技
术有限责任公司提供。ISSR-PCR反应体系为：基因组DNA 2μl，引物0.5μl，dNTPs 0.5μl，
Taq DNA聚合酶0.5μl、10×PCR Buffer 2.5μl、19μl ddH2O。扩增程序为：95℃预变性5min；
95℃变性30s，在最适退火温度下退火30s，72℃延伸120s，45个循环；72℃延伸10min后4℃
保存。每条选中引物对每一个样品重复试验3次。
试剂和仪器：PCR相关试剂：Taq DNA聚合酶(2U/μL)、dNTP(10μmol/L)、引物(10
μmol/L)、DGL2000 Marker、B002-1Marker。相关仪器：DG-3D大型水平电泳槽、DG-III
双稳数显电泳仪、美国9600型PCR扩增仪、美国Sigma公司3K18型低温冷冻离心机等。仪器
和试剂皆由北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司提供。
1.3 数据分析
用GENESCAN3.1软件打开由自动测序仪377扫描得到的胶图，进行数据提取，并将结
果保存为XLS格式。将EXCEL表内的数值不为0转换为1（数值为0的不转换），从而生成由
“l”和“0”组成的原始矩阵。用NTSYSpc-2.11F软件进行数据分析。对原始矩阵用SimQual程序
计算SM相似系数，并获得相似系数矩阵。再用 SHAN程序中的 UPGMA（Unweighted
Pair-group Method Arithmetic Average非加权成组算术平均数）方法进行聚类分析，并通过
Tree plot模块生成聚类图。
2 结果与分析
2.1 小叶桦样品多态性分析
本试验从100个引物中，筛选出8个多态性丰富、重复性好的引物。用筛选的8个引物对
60份小叶桦样品的DNA多态性检测，共扩增出3029条谱带，其中多态性谱带为2525条，多
态性比率为83.4％(见表1)。其中扩增位点最多的是UBC810，位点数为430；扩增位点最少的
是UBC881，位点数为303。利用引物UBC810对不同小叶桦样品的ISSR扩增图谱见图1。







图 1 引物UBC810在不同小叶桦变种中的ISSR-PCR扩增
（M：Marker ；编号1~60泳道中的样品分别是60个小叶桦叶样）
Fig．1 The ISSR-PCR gel patterns of UBC810 in different varieties of Betula microphylla
（M:Marker; No. 1~60 lanes were 60 samples of Betula microphylla）

表 1 ISSR引物序列及扩增结果统计
Tab. 1 ISSR primer sequences and amplification result statistics
引物编号
Primer
number
引物序列（5’to 3’）
primer sequences（5’to 3’）
扩增位点数
Number of
loci
多态位点数
Number of
polymorphic
loci
多态位点比/%
Ratio of
polymorphic
loci
UBC808 AGA GAG AGA GAG AGA GC 364±4.36 290±4.04 79.7
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30
M 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60
UBC809 AGA GAG AGA GAG AGA GG 316±3.61 265±5.03 83.9
UBC810 GAG AGA GAG AGA GAG AT 430±4.58 361±4.16 84.0
UBC835 AGAGAGAGAGAGAGA GYC 410±2.00 356±4.04 86.8
UBC836 AGAGAGAGAGAG AGA GYA 420±5.57 364±4.00 86.7
UBC840 GAGAGAGAGAGA GAG AYT 416±3.51 347±5.03 83.4
UBC881 GGG TGG GGT GGG GTG 303±3.61 240±3.06 79.2
UBC886 VDV CTC TCT CTC TCT CT 370±6.24 302±4.51 81.6
总 计
Total

3029±29.30 2525±33.53 83.4
平 均
Average

379±3.21 316±4.04

注：表中数据为平均值±标准差。
Notes: Data in the table are mean±SD.

2.2 小叶桦样品的ISSR标记聚类分析
利用NTSYSpc-2.1数据统计分析软件构建基于全部材料ISSR数据的UPGMA树状图(图
2)。所有材料的相似系数分布在0.84-0.90之间。平均相似系数为0.85。这说明供试的60份小
叶桦样品间的亲缘关系较近。
在所有供试材料中相似系数最大的是31#和36#，为0.8971，说明它们之间的亲缘关系最
近。相似系数最小的是88#和106#，为0.8192，说明它们之间的亲缘关系最远。
从聚类图上可以看出：当在相似系数0.847水平处作切割线L时，60份小叶桦材料可分为
I、II、III、IV、V、VI 6类。I类只有183#样品，II类只有122#样品，III类包括了12个样品，
IV类包括了16个样品，V类只有88#样品，VI类包括了29个样品（图 2）。
I类从形态特征上为小叶桦变种之一宽苞叶小叶桦，II类从形态特征上为小叶桦变种之一
吐曼特小叶桦，III类群为哈纳斯小叶桦，IV类群为小叶桦，V类为艾比湖小叶桦，VI类为沼
泽小叶桦（表 2）。

表 2 供试小叶桦及其变种主要形态特征
Tab.2 The main morphological characteristics of Betula microphylla and its variants
类群
Groups
样品号
Sample number
植物名称
Plant name
主要形态特征
Main morphological
characteristics
I 183 宽苞叶小叶桦
树皮棕红色；叶卵形，近无毛；果
苞楔形，有宽裂片，小坚果倒卵形。
II 122 吐曼特小叶桦
树皮灰褐色；幼枝密被短绒毛；叶
菱状卵圆形，叶背面沿脉疏生柔
毛；果苞楔形，小坚果倒卵形。
III
98、99、109、112、115、
119、128、133、134、139、
184、192
哈纳斯小叶桦
树皮棕栗色或棕红色；叶菱形、菱
状卵圆形，叶柄淡紫色；果苞匙形，
小坚果椭圆形或倒卵形。
IV
94、97、104、106、111、
120、129、135、138、151、
155、163、177、181、186、
252
小叶桦
树皮灰白色或棕红色；幼枝被短柔
毛；叶菱形、菱状倒卵形，近无毛；
果苞匙形或楔形，小坚果倒卵状长
圆形。
V 88 艾比湖小叶桦
树皮灰白色；叶卵形，背面疏被短
绒毛；果苞楔形，小坚果倒卵形。
VI
1、2、3、4、5、6、11、
19、24、29、31、36、38、
40、41、48、50、64、65、
70、73、78、79、82、83、
86、89、92、93
沼泽小叶桦
树皮灰白色；小枝被疏绒毛至无
毛；叶菱状卵圆形，无毛；果苞匙
形，小坚果倒卵形。

图 2 60份小叶桦样品ISSR分析聚类树状图
Fig. 2 Dendrogram of ISSR analysis of 60 Betula microphylla samples
3 讨论与结论
3.1 小叶桦的遗传多样性分析
遗传多样性是一个居群生存、发展和进化的基础，是生物携带遗传信息的总和[5]。遗传
多样性最直接的表达方式就是遗传变异的大小和分布格局，即居群的遗传结构[6][7]。在本试
验中，8个引物共扩增出多态性条带有2525条，多态性比率为83.4％。这表明筛选并采用的8
个引物，可以表现出供试样品间的遗传多样性。
小叶桦样品ISSR标记的分析结果表明，样品间遗传相似性较高，相似系数分布在
0.84-0.90之间，平均相似系数为0.85。这表明，供试小叶桦样品的遗传多样性不太丰富，小
叶桦内部的种质资源交流较多，小叶桦及其变种之间的遗传差异较小。从具体样品的多态性
来看，亲缘关系最近的31#样品和36#样品多态位点比为39.33%（以扩增位点最多的引物
UBC810为例），而亲缘关系最远的183#样品和122#样品多态位点比仅为5.19%。
3.2 小叶桦的遗传分类和亲缘关系分析
60份小叶桦种质材料分为I-VI 6大类，涵盖了小叶桦及其5个变种，即：宽苞叶小叶桦、
吐曼特小叶桦、哈纳斯小叶桦、艾比湖小叶桦和沼泽小叶桦。
从形态特征来看，树皮颜色、叶形、果苞和小坚果形状，以及枝叶被毛情况成为区分不
同类群的主要特征（表 2），这也是小叶桦及其变种划分的主要形态依据[1]。例如，以树皮
颜色来看，树皮灰白（褐）色类群II（吐曼特小叶桦）、V（艾比湖小叶桦）、VI（沼泽小
叶桦）与树皮棕红或棕栗色类群I（宽苞叶小叶桦）、III（哈纳斯小叶桦）分类明显。树皮
同为灰白色的种质材料，根据枝叶被毛情况（无、疏、密）、叶形、果苞及小坚果形状，也
可区分出IV（小叶桦）、V（艾比湖小叶桦）、VI（沼泽小叶桦）。
从UPGMA树状聚类图(图2)可以看出不同类群亲缘关系的远近。总体来看，以类群V、
VI亲缘关系最近，其次是类群IV；其与类群II、III亲缘关系较远；与类群I关系最远。结合
形态学分类来看，沼泽小叶桦与艾比湖小叶桦亲缘关系较近，且沼泽地的原生境也是相似的。
并且属于VI类群的78#、89#兼具V类群的部分形状，如78#叶片为卵形、89#果苞楔形等。这
表明，不但VI类群和V类群亲缘关系较近，且出现了兼具两个类群形态特征的中间形态，也
表明小叶桦变种之间在形态特征变化上存在渐变的现象。这说明亲缘关系较近的类群间存在
杂交现象，进而产生杂交后代的可能性。V类群和IV类群即艾比湖小叶桦和小叶桦的亲缘关
系也较近，艾比湖小叶桦是阿勒泰山的小叶桦，在冰期后从阿勒泰山经过萨乌尔山-塔尔巴
卡台山-阿拉套山-天山的迁移路线南下后，由于环境变异而产生的新类群[1]。从上不难看出，
具有相似形态特征的种群亲缘关系较近[8]。而形态特征差异较大的种群则亲缘关系较远，如
类群V、VI与类群II、III亲缘关系较远，与类群I关系最远。从形态特征上看，前者树皮灰白
色，后者棕红色、灰褐色，后者还具有前者不具备的宽苞片（宽苞叶小叶桦）、密柔毛（吐
曼特小叶桦）、淡紫色叶柄（哈纳斯小叶桦）等（表2）。
从同一类群内出现不同的分支来看，分支之间还是有一些差异，表现在形态上就是在小
叶桦或其部分变种的分类主特征之外的部分形态的差异，如小叶桦树皮由灰白色到棕红色、
叶菱形到菱状倒卵形、果苞匙形到楔形等；哈纳斯小叶桦的叶菱形到菱状倒卵形，小坚果的
椭圆形到倒卵形等。
聚类分析显示了小叶桦及其变种在DNA水平上的遗传多样性与形态学特征是较一致
的，如31#样品和36#样品在聚类图上相似系数高达0.8971，在形态特征上也十分接近。小叶
桦作为阿勒泰山的古老土著种，这种多态性是有遗传基础的。因此，本研究的结果可以为小
叶桦不同类群的鉴别和优良类群的选择、杂交育种等，提供分子水平的理论依据。
致谢：在试验过程和论文撰写中得到了张冬梅、唐罗忠的帮助，在此致谢。
参考文献：
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