全 文 ：【方药研究】
紫丹饮含药血清对子宫内膜细胞HOXA10基因的影响
林佳静 1 ,金　哲 2■ ,黄文玲2 ,李　玲1
(1.北京中医药大学 ,北京　100029;2.北京中医药大学东方医院　妇科 ,北京　100078)
　　摘要:目的:观察紫丹饮含药血清对 HOXA10基因表达的影响 ,以探讨紫丹饮是否是通过调
节 HOXA10基因的表达来影响子宫内膜容受性 。方法:人子宫内膜组织来自手术病人 ,通过原代
培养分离子宫内膜腺上皮细胞及间质细胞 ,以不同浓度含药血清培养液分别作用于二者 ,并设立胎
牛血清 、空白血清及西药阳性药血清为对照 ,用 Realtime-PCR法检测紫丹饮对正常妇女子宫内膜
腺上皮细胞及间质细胞 HOXA10基因表达的影响。结果:紫丹饮含药血清可显著促进子宫内膜腺
上皮细胞及间质细胞 HOXA10基因的表达 。结论:中药紫丹饮可能通过增强子宫内膜 HOXA10基
因的表达 ,来改善子宫内膜容受性的作用 。
　　关键词:紫丹饮含药血清;子宫内膜容受性;HOXA10基因
　　中图分类号:R285.5　　文献标识码:B　　文章编号:1006-3250(2010)01-0066-03
RegulationofZidanDecoction-containingSerumontheExpressionof
HOXA10 inGlandularEpithelialandStromalCelsinVitroCulture
LINJia-jing1 , JINZhe2 , HUANGWen-ling2 , LILing1
(1.BeijingUniversityofChineseMedicine, Beijing100029, China;
2.DepartmentofGynecology, DongfangHospital, BeijingUniversityofChineseMedicine,
Beijing100078 , China)
　　Abstract:ObjectiveToinvestigatetheefectandmechanismofZidanDecoction-containingSerum
(ZDD)onendometrialreceptivitybyassessthechangeofHOXA10 invitroculture.MethodsHuman
endometriumtissuesampleswereobtainedbysurgery.Highlypurifiedhumanendometria1 glandular
epithelialandstromalcelswereobtainedbyprinaryculture.Theglandularepithelialandstromalcels
wereculturedinmediawithserumcontainingdiferentconcentrationsofZDDandFBSaswelasblank
serumandserumcontainingasprinaspositivecontrol.TheexpressionofHOXA10inculturedglandular
epithelialandstromalcelswasassayedbyRealtime-PCR.ResultsZidanDecoction-containingSerum
significantlyincreasedtheexpressionofHOXA10 inculturedglandularepithelialandstromalcels.
ConclusionZidanDecoctionmightincreasedendometrialreceptivitybyincreasedtheexpressionof
HOXA10 ofendometrium.
　　Keywords:ZidanDecoction-containingSerum;endometrialreceptivity;HOXA10
　　据统计 ,我国约有 10%的育龄夫妇存在着生殖
障碍 ,并有逐渐增加的趋势 [ 1] 。体外授精 -胚胎移植
(invitrofertilizationandembryotransfer, IVF-ET)的
应用为千万不孕不育夫妇带来了希望 。但近 10年
IVF-ET临床妊娠率一直徘徊在 30% ～ 40%,难以继
续提高 [ 2] 。据文献报道 ,卵子受精率与胚胎形成率
分别达到 80%和 90%左右 ,可供移植胚胎的质量显
著提高 。然而相比之下 ,种植率还停留在低水平 ,仍
有 75%左右的移植胚胎种植失败 [ 3] 。体外受精 -胚
胎移植(IVF-ET)着床失败的病例中由于子宫内膜
容受性原因导致的约有 2/3[ 4] 。目前 ,临床尚无改
善子宫内膜容受性的有效方法 。近年来 ,中医药渗
透入辅助生殖的各个环节 ,在提高子宫内膜容受性 、
提高妊娠率并有效降低西药毒副作用等方面有了长
足的发展 ,但是其机制尚待明确 。为此 ,我们利用体
外培养的子宫内膜细胞 ,从基因水平研究中药紫丹
饮对子宫内膜容受性相关基因表达的影响 ,现将结
果报告如下。
1　材料与方法
1.1　材料
1.1.1　标本来源　(1)选择在北京中医药大
学东方医院妇科因单纯子宫肌瘤行全子宫切除的患
者 6例 ,年龄 38岁 ～ 49岁 ,术前 3个月未使用任何
性激素;(2)所有标本均经病理检查证实未发现子
宫内膜存在病变;(3)内膜于无菌状态下从子宫底
刮下 ,立即投入含 10万 U/L青霉索 、100mg/L链霉
素的无 Ca+、Mg+的Hank s平衡盐溶液中 ,低温条件
下迅速转移到实验室进行分离培养 。
1.1.2　受试药物　中药紫丹饮:主要成分由紫
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河车 、丹参 、熟地等 8味药组成 ,购自北京同仁堂药
店 ,西药阳性对照药阿司匹林由德国拜耳公司生产 。
1.1.3　试剂 　D-MEM/F-12培养基 、胎牛血
清 、胶原酶 Ⅰ 、胰蛋白酶 、Trizol(美国 Invitrogen公
司);Hepes(Amresco公司);Hanks(北京优博奥生物
技术有限公司);青 、链霉素(华北制药厂);细胞角
蛋白 、波形蛋白 、通用二步法免疫组化试剂盒(北京
中杉金桥生物技术有限公司);PCR引物(北京三博
远志生物技术有限公司);DEPC水(美国 Sigma公
司);反转录酶(Promega公司);SYBRmix(Bio-rad
公司);TaqE和 dNTP(大连宝生物生物技术有限公
司);DNAMarker(全式金生物技术有限公司);琼脂
糖(深圳晶美公司),其余试剂均为国产分析纯 。
1.2　方法
1.2.1　含药血清的制备
药物制备:受试药紫丹饮生药加 10倍量水 ,煎
煮 3次 ,每次 1h,合并煎液 、过滤 ,放置 24h浓缩 ,药
物浓度为 0.9g生药 /ml,药液 4℃冰箱保存 ,使用前
升温至室温;对照药阿司匹林 ,用 5‰CMC配成浓度
为 1mg/ml的阿司匹林溶液。
动物:健康性成熟的雌性 SD大鼠 15只 ,体重
220g±10g,按拉丁方法随机分为 3组 ,每组 5只:空
白血清组 、阿司匹林含药血清组 、紫丹饮含药血清
组 。
含药血清的制备:按李仪奎法制备含药血
清 [ 5] 。依据千克体重剂量换算公式 Db=Da×Rab
Rab=(ka/kb)×(Wa/Wb)1 /3计算 ,大鼠等剂量的
给药量为临床成人每公斤体重用药量的 6倍。计算
后紫丹饮含药血清组给药剂量为 9g/(kg·d),阿司
匹林含药血清组给药剂量为 10mg/(kg· d)。每
100g大鼠灌胃 1ml,每天 1次 ,共 5d。于最后 1次灌
胃后 1h腹主动脉无菌采血 , 3000rpm离心 20min,取
上清混匀 , 56℃ 30min灭活处理 ,分装于 1ml无菌
EP管中置于 -80℃冰箱冷藏备用。
1.2.2　子宫内膜细胞原代培养　参照 Ryan的
方法并作改进 [ 6] 。间质细胞 、腺上皮细胞以 1 ×
10
5 /mL接种于 6孔板为检测 、细胞爬片等做细胞准
备 。
子宫内膜腺上皮细胞及间质细胞纯度鉴定:采
用免疫组化法 ,将无菌盖玻片用多聚赖氨酸预处理 ,
接种细胞 ,倒置显微镜观察细胞爬满盖玻片后取出 。
4%多聚甲醛固定 30min后 ,以细胞角蛋白和波形蛋
白为一抗(PBS作为空白对照)分别鉴定上皮细胞
和间质细胞。具体操作按说明书进行 , DAB显色 ,
苏木精复染 ,光镜观察 。以细胞质棕黄染色为阳性
结果 ,未着色为阴性结果 ,以百分率表示纯度。
细胞分组:共分对照组 、10%空白血清组 、5%紫
丹饮含药血清组 、10%紫丹饮含药血清组 、15%紫丹
饮含药血清组和 10%阿司匹林含药血清组 6组 。
对照组采用基础培养基(含 2.5%FBSD-MEM/F-12
培养基)培养细胞 ,其余各组培养基均在基础培养
基中加入不同浓度的含药血清或空白血清 。
1.3　HOXA10基因表达的测定
HOXA10表达比较采用 Realtime-PCR法定量测
定取进入对数生长期的细胞 ,以不同含药血清培养
液作用 48h后提取细胞 ,总 RNA提取用 Trizol法 。
引物序列:内参 GAPDH上游引物:5′-CAACTCCCT
CAAGATTGTCAGCAA-3′;下游引物:5′-GGCATG
GAC TGT GGT CATGA-3′;产 物长 度 128bp。
HOXA10上游引物:5′-GGAAATGCCTGTGGA
GTTCT-3′;下游引物:5′-ACTGGCCAGGTTTAC
TGCTC-3′引物;产物长度 101bp。提取 3μl总 RNA
逆转录后行 PCR反应 , 扩增条件为:94℃预变性
15min, 94℃ 15s、58℃ 15s、72℃ 20s、72℃ 10min, 45
个循环。
1.4　统计学处理
实验所得数据使用 SAS8.2统计分析软件进行
单因素方差分析(ANOVA),比较各组间的差异 , P
<0.05为有统计学意义 。
2　结果
2.1　子宫内膜细胞培养
培养瓶中的子宫内膜间质细胞 12h～ 24h全部
贴壁 , 72h长满瓶底 。培养瓶中的子宫内膜腺上皮
细胞 24h～ 48h全部贴壁 , 5d长满瓶底。
2.2　子宫内膜细胞纯度
采用免疫组化法进行测定 ,原代培养的子宫内
膜腺上皮细胞为角蛋白染色阳性 、波形蛋白阴性;原
代培养的子宫内膜间质细胞为波形蛋白阳性 、角蛋
白染色阴性。采用百分率表示细胞的纯度。原代细
胞培养 72h后的贴壁细胞中子宫内膜腺上皮与间质
细胞纯度为 80% ～ 90%以上 。
2.3　Realtime-PCR检测结果
将预试验的 PCR产物(mRNA表达比较高的)
按照浓度梯度进行稀释 ,选择 1/5、1/10、1 /20、1/40
浓度的稀释产物作为标准品模板 ,进行荧光定量
PCR反应。通过这 4个标准品生成的反应数据 ,软
件 Rotor-Gene6.0根据反应的荧光实时监控数据和
标准品的浓度关系 ,生成标准曲线 。以对照组表达
量为标准 ,其他各组表达量均为对照组的相对表达
量。
本研究结果显示 , HOXA10mRNA主要表达在
在腺上皮细胞中 ,其中紫丹饮各含药血清组及阿司
匹林含药血清组的 HOXA10mRNA表达较对照组及
空白血清组显著升高(P>0.05),其中阿司匹林含
药血清组中腺上皮细胞 HOXA10mRNA的表达量最
高。
表 1显示 ,在间质细胞中 ,紫丹饮 10%、15%含
药血清组及阿司匹林含药血清组的 HOXA10mRNA
表达较对照组及空白血清组显著升高(P>0.05),
其中 阿 司 匹 林 含 药 血 清 组 中 间 质 细 胞
HOXA10mRNA的表达量最高。 HOXA10mRNA在
紫丹饮 5%含药血清组中的表达较空白血清组显著
升高 。
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表 1　各组子宫内膜细胞 HOXA10mRNA
表达结果比较( x±s, n=3)
组 别 腺上皮细胞 间质细胞
对 照 组 1.00±0.00 1.00±0.00
空 白 血 清 组 0.81±0.05 0.98±0.10
5%紫丹饮含药血清组 1.47±0.12＊# 1.20±0.08#
10%紫丹饮含药血清组 1.97±0.09＊# 1.32±0.07＊#
15%紫丹饮含药血清组 3.07±0.11＊# 1.78±0.03＊#
阿司匹林含药血清组 3.31±0.08＊# 2.08±0.15＊#
注:与对照组组比较:＊P<0.05;与空白血清组比较:#P<0.05
3　讨论
HOXA10是一种同源框转录调节因子 ,在调节
胚胎着床过程中起重要作用 ,是胚胎着床和子宫内
膜蜕膜化必不可少的基因 ,在整个月经周期的子宫
内膜均有表达。增生期 、分泌早期表达较低 ,腺体 、
间质间无明显差异;分泌中晚期高表达 ,间质高于腺
体 ,与人类的植入窗开放同步 [ 7] 。 EunKwon[ 8]发
现 ,正常女性种植窗子宫内膜 HOXA-10基因表达上
调 。分析整合素 β 3转录起始位点 5区域 ,发现此
区域有 7个一致性 AbdB型 HOX结合位点 ,其中 5
区域的 1个 41bp片段与 HOXA-10的亲和力最高 ,
HOXA-10通过与 41bp5调节元件结合直接上调整
合素 β 3。目前还发现 ,它调节下游分子 P57(可能
在蜕膜化过程中对子宫内膜基质细胞的分化起重要
作用)和 FKBP52(孕 5d时于着床位点周围的蜕膜
化基质细胞集中表达)。实验证明 ,当 HOXA10表
达降低时 ,整合素 β 3mRNA表达也随之降低。可
见 , HOXA10基因通过诱导其下游基因的激活或抑
制而发挥作用 。 HOXA-10通过与辅因子相结合而
促进特异性基因转录和表达 ,参与调节子宫内膜间
质细胞及腺上皮周期性的增殖与分化 ,最终使子宫
内膜进入容受状态 ,并参与子宫内膜的蜕膜化 ,从而
维持妊娠状态。
目前 ,现代医学主要通过改善子宫内膜血流来
改善子宫内膜容受性 。文献报道临床上主要用阿司
匹林 、雌激素等进行治疗 。小剂量阿司匹林 (low-
doseaspirin, LDA)是乙酸水杨酸类药物 ,作用于前
列腺素合成过程中的环氧化酶 ,抑制 PGI2和 TXA2
的合成 。 LDA可抑制血小板活性 ,预防微血栓形
成 ,改善局部血循环 。此外 , LDA通过免疫调节作
用抑制炎症介质对全身和生殖系统局部的不良影
响 ,进而抑制子宫 、卵巢血管收缩和血小板聚集 ,改
善局部血液供应 [ 9] 。但阿司匹林可能有潜在的减
低生育力的作用 ,因为前列腺素可影响排卵 、授精和
种植 ,雌激素可帮助子宫内膜发育不良者建立内膜 。
在克罗米芬(CC)诱导的排卵周期中 ,添加雌激素能
改善子宫内膜发育 ,增加内膜厚度 ,对血流影响不
大 。但是目前二者的治疗剂量和用药方法并不统
一 ,应用的安全性尚在探索阶段 [ 10] 。
中医药是我国的一大瑰宝 ,在中医妇科肾气 -天
癸 -冲任-胞宫理论指导下 ,中医药治疗不孕症积累
了丰富的经验。近年来 ,中医药渗透入辅助生殖的
各个环节 ,在提高子宫内膜容受性和妊娠率 ,并有效
低西药毒副作用等方面有了长足的发展 ,但是其机
制尚待明确。我们在总结以往治疗经验的基础上 ,
查阅了大量相关文献 ,依据中医 “肾主生殖 ”、“女子
以血为本 ”等理论为指导 ,认为临床上子宫内膜容
受性低下患者与肾虚血瘀有着密切关系 ,研制出的
紫丹饮主要由紫河车 、丹参 、熟地等 8味药组成。紫
河车味甘 、咸 ,性温 ,入肝 、肾 、肺经;熟地味甘 ,性温 ,
入肝 、肾经;二者能补肾 、益精血 ,为君药;其中紫河
车兼有补阳作用 ,系血肉有情之品 ,熟地培补肾阴 ,
二药阴阳并补 ,共奏补肾填精之功 。丹参味苦 ,微
寒 ,归心 、肝经 ,功能活血化瘀 ,善调妇女经水 ,为臣
药 ,有静中求动之意 ,诸药合用 ,补肾填精 、养血活
血。本研究从基因水平对紫丹饮改善子宫内膜容受
性的机理进行研究 ,从而为中医药治疗改善子宫内
膜容受性提供有利的证据 ,充分发挥中医药整体调
节的优势 ,扬长避短 ,寻找中西医结合切入点 ,为中
医药配合辅助生殖技术提高孕育成功率的研究提供
了新视角 、新思路。
本研究显示 ,紫丹饮与阿司匹林均能促使子宫
内膜腺上皮细胞及间质细胞 HOXA10基因表达升
高。中药紫丹饮可能通过增强子宫内膜 HOXA10
基因的表达 ,来改善子宫内膜容受性的作用 。
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及辅助生殖技术学习班:2007.9.
收稿日期:2009-06-16
■通讯作者:金哲(1954-),教授 ,博士研究生导
师 ,从事妇科内分泌等方面的研究与治疗。 E-mail:
jinzhe1954@sohu.com。
作者简介:林佳静 (1981-), 北京中医药大学
2007级在读博士 ,从事妇科内分泌等方面的研究 。
E-mail:hotsummerwind@126.com。
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