全 文 ：收稿日期： 2012-06-19； 修回日期： 2012-10-04
基金项目： 国家引进国际先进农业科学技术计划（“948”计划）项目（2009-4-02）
作者简介： 武冲， 博士研究生， 从事林木种质资源与遗传多样性研究。 E-mail： wuchongge@163.com。 通信作
者： 仲崇禄， 研究员， 博士， 从事林木遗传育种等研究。 E-mail： zclritf@gmail.com
浙 江 农 林 大 学 学 报， 2013， 30（4）： 620 - 626
Journal of Zhejiang A＆ F University
麻楝 ISSR-PCR反应体系的建立及优化
武 冲， 仲崇禄， 张 勇， 姜清彬， 陈 羽， 陈 珍
（中国林业科学研究院 热带林业研究所， 广东 广州 510520）
摘要： 模板 DNA、 引物、 三磷酸碱基脱氧核苷酸（dNTPs）， 镁离子（Mg2+）浓度、 Taq DNA 聚合酶的用量以及退火温
度是影响简单序列重复区间扩增-聚合酶链式反应 （ISSR-PCR）的主要因素。 以麻楝 Chukrasia tabularis 叶片基因组
DNA为试验材料， 系统地测试这 6 个因素对麻楝 ISSR-PCR 反应结果的影响。 结果表明： 最优的反应体系为 20 μL
反应体系中含 30 ng 模板 DNA， 1.00 μmol·L－1 随机引物， 0.15 mmol·L-1dNTPs， 2.50 mmol·L－1 Mg2+， 2.50 × 16.67
nkat Taq DNA聚合酶。 最佳退火温度为 56 ℃， ISSR-PCR反应程序为 94 ℃预变性 5.0 min， 94 ℃变性 45 s， 56 ℃退
火 45 s， 72 ℃延伸 1.5 min， 40个循环； 72 ℃再延伸 7.0 min， 4 ℃保存。 应用优化的 ISSR-PCR 反应体系对 24 份麻
楝个体材料进行扩增， 均能扩增出丰富稳定的条带。 图 8表 1参 27
关键词： 林木育种学； 麻楝； ISSR； PCR条件； 优化
中图分类号： S722.3 文献标志码： A 文章编号： 2095-0756（2012）04-0620-07
Establishment and optimization of an ISSR-PCR system
for Chukrasia tabularis
WU Chong， ZHONG Chonglu， ZHANG Yong， JIANG Qingbin， CHEN Yu， CHEN Zhen
（Research Institute of Tropical Forestry， Chinese Academy of Forestry， Guangzhou 510520， Guangdong， China）
Abstract: The genomic DNA from twenty-four varieties of germplasm material for Chukrasia tabularis leaves was
systematically analyzed for template DNA， primer， dNTPs， Mg2 + concentration， dosage of Taq DNA
polymerase， and annealing temperature with an inter simple sequence repeat（ISSR）-polymerase chain reaction
（PCR）. Results showed that the optimal reaction system for the ISSR was a 20 μL system containing 30 ng
template DNA， 1.00 μmol·L －1 random primers, 0.15 mmol·L －1 dNTPs， 2.50 mmol·L －1 Mg2+， and 2.50 ×
16.67 nkat Taq DNA polymerase. The optimal annealing temperature was 56 ℃ with the PCR procedure pre-
denaturized at 94 ℃ for 5.0 min, denaturized at 94 ℃ for 45 s, and annealed at 56 ℃ for 45 s with an
extension at 72 ℃ for 1.5 min， a reaction of 40 cycles， and re-extension at 72 ℃ for 7 min. These products
were then stored at 4 ℃. Results indicated that stable bands could be amplified. ［Ch， 8 fig. 1 tab. 27 ref.］
Key words: forest tree breeding； Chukrasia tabularis； inter simple sequence repeat （ISSR）； polymerase chain
reaction （PCR） conditions； optimization
麻楝 Chukrasia tabularis 是中国热带和南亚热带珍贵乡土速生用材树种。 麻楝木材纹理交错， 结构细
且均匀， 质量及硬度属中等， 干燥状况良好， 干燥后木材稳定， 耐腐蚀， 易加工， 切面光泽性强， 用途
广泛， 径面刨切单板花纹鲜艳夺目， 为胶合板材的优良贴面材料， 也是名贵高档家具、 房屋建筑、 室内
装修、 音箱、 钢琴壳、 雕刻、 仪器箱盒等用途的高档木材 ［1］。 仲崇禄等［2］初步分析了麻楝在中国华南地
区的发展潜力， 建议在广东和福建种植麻楝人工林。 此外， 麻楝还是一种药用树种［3］， 近年来对麻楝挥
发油成分研究较多 ［4－6］。 目前， 对麻楝人工经营技术了解甚少， 同时世界上对麻楝遗传改良工作也刚刚
第 30 卷第 4 期
开始， 还不了解麻楝种源变异规律以及人工林的生长特点等。 因此， 了解麻楝的遗传变异结构， 开展麻
楝种源筛选及有效繁殖技术以提高麻楝人工林产量等研究是亟待解决的重要问题。 因此， 利用简单序列
重复区间扩增（ISSR）标记技术探讨麻楝种质资源的遗传多样性， 对麻楝的开发和利用具有重要意
义 。 ISSR（inter-simple sequence repeat）是 1994 年 Zietkiewicz 等［7］在简单重复序列（SSR）的基础上， 基于
聚合酶链式反应（PCR）创建的一种新的分子标记技术， 现已在遗传图谱构建［8－9］、 基因定位［10］、 遗传多样
性分析［11］、 种质资源鉴定［12］等方面得到广泛应用。 该标记具有模板需求量少， 操作简单， 成本低， 多态
性丰富， 重复性好且稳定等优点［13］。 本研究以麻楝叶片基因组 DNA为模板， 分析了模板 DNA 用量、 引
物浓度、 三磷酸碱基脱氧核苷酸（dNTPs）、 镁离子（Mg2+）浓度、 Taq DNA 聚合酶用量及退火温度对 ISSR-
PCR扩增结果的影响， 建立了适合麻楝 ISSR分析的反应体系， 旨在为 ISSR分子标记技术应用于麻楝的
遗传变异分析、 分子辅助育种、 系统进化等研究奠定基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料
麻楝幼叶于 2012 年 2 月采自广州中国林业科学研究院热带林业研究所珍贵树种育苗基地（2011 年 6
月播种）半年生的麻楝幼苗。 建立 ISSR-PCR反应体系的试材基因组 DNA 为来自老挝（LAOS）种源的 2 个
单株， 分别记为 L1和 L2。
1.2 主要试剂和仪器
用于 ISSR-PCR 反应的 Taq DNA 聚合酶、 dNTPs、 Mg2+均购自上海生工生物技术有限公司， 引物序
列由上海生工生物技术有限责任公司合成。 DNA 浓度和纯度检测使用 NanoDrop 2000 紫外分光光度计
（Thermo Fisher）。 PCR反应在 Applied Biosystem PCR 仪上进行。
1.3 试验方法
1.3.1 麻楝基因组 DNA的提取 麻楝基因组 DNA提取是以十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）法［14］为基础，
结合其他多种提取方法进行优化［15－16］。 DNA 纯度及浓度用紫外分光光度计检测， 用 EB 染色后， 12.0 g·
kg－1的琼脂糖凝胶电泳检测 DNA质量。
1.3.2 ISSR-PCR 反应体系的优化 ISSR 基本反应体系为 20.0 μL 的反应体系， 其基本组成为 2.0 μL
10×缓冲液（buffer）［三羟甲基氨基烷-盐酸（Tris-HCl）100.0 mmol·L－1 （pH 9.0）， 氯化钾（KCl）100 mmol·L－1，
表面活性剂 NP-40 5.0 g·kg－1， 硫酸铵（NH4）2SO4 ）80.0 mmol·L－1］， 1.00×16.67 nkat Taq DNA 聚合酶， 0.1
mmol·L－1 dNTPs， 1.0 mmol·L－1 Mg2+， 0.4 μmol·L－1ISSR引物， 20.0 ng 模板 DNA， 最后补加双蒸水至 20.0
μL。 ISSR-PCR 基本扩增程序为 94 ℃预变性 5.0 min， 94 ℃变性 30 s， 55 ℃退火 45 s， 72 ℃延伸 90 s，
40 次循环， 最后 72 ℃再延伸 7.0 min， 4 ℃保存。 取 PCR 扩增产物 10.0 μL 加入 2.0 μL 的溴酚蓝染料
混匀， 于 18.0 g·kg－1的琼脂糖凝胶上电泳， 然后在 UVP 型凝胶成像分析系统成相保存。 根据预实验结
果， 选定引物 807（AGA GAG AGA GAG AGA GT）为 ISSR体系优化引物。 反应体系的优化参数及各参数
的优化梯度见表 1， 逐一优化每个参数， 优化后的参数保持不变， 再进行下一个参数的优化。
梯度 模板 DNA/ng 引物浓度/（μmol·L－1） dNTPs/（mmol·L－1） 镁离子/（mmol·L－1） Taq DNA聚合酶/nkat 温度/℃
1 5 0.20 0.05 0 0.25×16.67 50
2 10 0.40 0.10 1.00 0.50×16.67 52
3 20 0.60 0.15 150 1.00×16.67 54
4 30 0.80 0.20 2.00 1.25×16.67 56
5 40 1.00 0.25 2.50 1.75×16.67 58
6 50 1.20 0.30 3.00 2.00×16.67 60
表 1 影响 ISSR-PCR扩增的主要参数
Table 1 Primary parameters influencing amplification of ISSR-PCR
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2 结果与分析
2.1 基因组 DNA纯度及浓度测定
本试验提取的麻楝叶片基因组 DNA 呈无色絮状沉淀， 真空干燥后加 200.0 μL 1×TE 缓冲液溶解，
之后在紫外分光光度计上检测 DNA纯度和浓度。 结果表明： 麻楝基因组 DNA 的纯度 R 值 （R=D（λ）260/
D（λ）280）均为 1.8~1.9， 说明样品 DNA 中蛋白质、 多糖等杂质含量较少， DNA 纯度高。 DNA 电泳检测结
果条带清晰， 质量较好（图 1）。说明用改良 CTAB法提取的麻楝 DNA可以满足后续的 ISSR-PCR优化试验。
图 1 20个样品的基因组电泳图
Figure 1 Electrophoresis pattern of genomic DNA from 20 samples
2.2 模板 DNA浓度对 ISSR-PCR的影响
模板 DNA质量和用量是影响 ISSR-PCR 扩增能否实现的重要因素 ［17］。 低浓度的模板 DNA 扩增产物
不稳定甚至无法扩增出目的产物， 而高浓度的模板 DNA 又会导致非特异性扩增 ［18］。 如图 2 所示， 当模
板 DNA 为 5.0 ng 时， 扩增出的条带少且模糊； 模板 DNA 为 50.0 ng 时， 扩增条带模糊有阴影； 模板
DNA为 20.0～40.0 ng 时， ISSR-PCR扩增带型基本一致， 其中以模板为 30.0 ng 时条带明亮清晰， 扩增效
率最高。 因此， 20.0 μL反应体系中模板 DNA用量为 30.0 ng 对 ISSR-PCR扩增较适合。
2.3 引物浓度对 ISSR-PCR的影响
引物质量与浓度是 PCR扩增特异性反应的关键， PCR 扩增产物的特异性取决于引物与模板 DNA 的
互补程度［19－20］。 由图 3 知： 引物浓度为 0.2~1.2 μmol·L－1时均能扩增出条带， 当引物浓度为 0.2 μmol·L－1
图 2 模版浓度对 ISSR扩增的影响
Figure 2 Effects of template DNA concentrations on ISSR
results
图 3 引物浓度对 ISSR扩增的影响
Figure 3 Effects of primer concentrations on ISSR results
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第 30 卷第 4 期
时， 扩增条带少且模糊； 当引物浓度为 1.2 μmol·L－1时， 扩增条带有阴影； 引物浓度为 1.0 μmol·L－1时，
扩增条带清晰、 稳定。 因此确定引物浓度为 1.0 μmol·L－1时是 ISSR-PCR反应体系的最适引物浓度。
2.4 Taq DNA聚合酶浓度对 ISSR-PCR的影响
Taq DNA聚合酶是 PCR反应中最关键因素， 其质量与用量关系到扩增能否正常进行 ［21］， Taq DNA
聚合酶含量低使 PCR 反应扩增不出目的产物， Taq DNA 聚合酶用量过高也会产生非特异性扩增， 造成
假阳性 ［22］。 本试验设置了 6 个 Taq DNA 聚合酶浓度梯度进行优化反应。 在 20.0 μL 反应体系中加 0.25×
16.67 nkat Taq DNA聚合酶时， 扩增产物条带较少， 且不清晰； （0.50~1.00）×16.67 nkat 时， 条带虽然清
晰， 但是没有扩增出小于 500 bp的条带； （2~3）×16.67 nkat 时， 条带清晰， 扩增效率较高（图 4）。 因此，
综合比较本试验选择 2.50×16.67 nkat Taq DNA聚合酶浓度为 20 μL反应体系的最适浓度。
2.5 镁离子（Mg2+）浓度对 ISSR-PCR的影响
Mg2+浓度是 ISSR-PCR反应的一个主要变化因素 ［23］。 Mg2+作为 Taq DNA聚合酶的辅助因子， Mg2+不
仅可以影响 Taq DNA 聚合酶的活性， 还可以与反应体系中的 dNTPs， 模板 DNA 及引物结合， 从而影响
引物与模板的结合效率和模板与 PCR 产物的解链温度以及产物的特异性以及引物二聚体的形成 ［24］。 本
试验设置了 6 个 Mg2+浓度梯度进行优化反应。 结果显示： Mg2+浓度为 0~3.0 mmol·L－1时， 均可以扩增出
条带； 虽然在对比反应体系中未加 Mg2+， 但也可以扩增出条带产物， 这是因为缓冲液中含 Mg2+， 但其含
量不足以满足 PCR反应所需用量， 所以扩增出的条带少且不清晰。 综合比较， 当 Mg2+浓度为 2.5 mmol·
L－1时， 条带最清晰， 主次分明（图5）。 因此， 确定 2.5 mmol·L－1为 ISSR-PCR反应的最适 Mg2+浓度。
图 4 Taq DNA聚合酶对 ISSR-PCR的影响
Figure 4 Effects of Taq DNA polymerase concentrations on
ISSR results
图 5 Mg2+浓度对 ISSR-PCR的影响
Figure 5 Effects of Mg2+ concentrations on ISSR results
2.6 dNTPs浓度对 ISSR-PCR的影响
dNTPs在 PCR反应体系中为 DNA序列扩增提供原料， 它的质量和浓度与 PCR 扩增效率有密切的关
系 ［25］。 本试验设置了 6 个dNTPs 浓度梯度进行优化反应。 结果显示： dNTPs 浓度在 0.05~0.30 mmol·L－1
时均可以扩增出条带， 而以 dNTPs浓度为 0.15 mmol·L－1时， 扩增效率最高， 条带最清晰， 且主次分明；
当 dNTPs 浓度小于 0.15 mmol·L－1时， 扩增条带少， 条带很弱， 不清晰； 当 dNTPs 浓度大于 0.15 mmol·
L－1 时， 扩增条带出现阴影不清晰（图 6）。 因此， 本试验采用 0.15 mmol·L－1 的 dNTPs 浓度为最适
反应浓度。
2.7 退火温度对 ISSR-PCR的影响
退火温度影响 ISSR-PCR 反应扩增条带的式样， 不同引物具有不同的最适退火温度（Tm）［26］。 本试验
根据 ISSR 引物 807 的理论 Tm值， 设置了 6 个温度梯度， 分别为 50， 52， 54， 56， 58 和 60 ℃。 由图 7
知： 退火温度在 50~60 ℃之间都可以扩增出条带， 但是在退火温度为 50 ℃和 52 ℃时， 扩增条带少， 且
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条带模糊； 当退火温度为 60 ℃时， 扩增产物明显降低， 且条带很弱； 最终根据扩增产物的条带的多少
和条带的清晰度， 确定 56 ℃为引物 807的最适退火温度（图 7）。
图 6 dNTPs对 ISSR-PCR的影响
Figure 6 Effects of dNTPs concentrations on ISSR results
图 7 温度对 ISSR-PCR的影响
Figure 7 Effects of temperature on ISSR results
3 结论与讨论
采用 ISSR 分子标记技术对麻楝种质资源进行遗传多样性研究， 必须以高质量的 DNA 为材料基础，
因此， DNA 的提取就显得尤为重要。 试验证明： 以改良十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）法可以提取高质
量的麻楝基因组 DNA。
ISSR标记技术所使用的引物较长， 退火温度较高， 对 PCR 反应的敏感性较低， 但基于 PCR 的分子
标记受诸如退火温度、 Taq DNA酶用量、 引物浓度、 dNTPs 浓度以及 Mg2+浓度等因素的影响 ［27］。 为了
得到具有较高的稳定性、 可重复性和可靠的试验结果， 我们对影响因子 Taq DNA 酶用量、 Mg2+浓度、
dNTPs浓度、 引物浓度进行了梯度试验， 以 807（AGA GAG AGA GAG AGA GT）为引物， 筛选出的麻楝
最适宜 ISSR-PCR反应体系（20 μL）含 30 ng 模板 DNA， 1.00 μmol·L－1随机引物， 0.15 mmol·L－1dNTPs，
2.50 mmol·L－1Mg2+， 2.50×16.67 nkat Taq DNA 聚合酶， 最佳退火温度为 56 ℃； ISSR-PCR 反应程序为 94
℃预变性 5.0 min， 94 ℃变性 45 s， 56 ℃退火 45 s， 72 ℃延伸 1.5 min， 40 个循环， 72 ℃再延伸 7.0
min， 4 ℃保存。 图 8为 24个样本的扩增效果图。
图 8 24个样本扩增效果
Figure 8 24 samples’amplification results
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