全 文 ：218
第 1 4 卷 第 3 期
2012 年 3 月
辽 宁 中 医 药 大 学 学 报
JOURNAL OF LIAONING UNIVERSITY OF TCM
Vol. 14 No. 3
Mar . ，2012
图 4 AMML 处理组 HL-60 细胞 Caspase-3 的表达
现 黄 芪 凝 集 素 在 体 外 对 HL-60 细 胞 有 一 毒 性
作 用，经 MTT 比 色 检 测 显 示，经 AMML 处 理 后
HL-60 细胞的增殖活性受到明显的影响。从细
胞形态学变化及流式细胞检测结果看，AMML 对
HL-60 细胞生长抑制作用与细胞周期阻滞及诱导
凋亡有关 [5-6]。Annexin-V/PI 可以检测早期凋亡，
AMML 诱导 HL-60 细胞发生凋亡的分子机制与下
调 Bcl-2 表达 [7] 和上调 Caspasc-3 表达有关 [8]。
本文研究表明 AMML 是一个有效的凋亡诱导
剂，为其在肿瘤防治中的应用提供重要依据。因
此，AMML 在抗肿瘤新药开发方面具有潜在的应
用价值 [9]。◆
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独角莲体外抗肿瘤实验研究
王世强 1，马丽红 2，杨玉红 1，王晓新 1，康宗利 1
（1.沈阳农业大学生物科学技术学院，辽宁 沈阳 110866 ；2.沈阳市第五人民医院妇产科，辽宁 沈阳 110023）
摘 要 ：为探讨独角莲的体外抗肿瘤作用，将独角莲根茎水提物分别处理人宫颈癌系细胞（HeLa）、人白血病细
胞（HL60）、人肺腺癌细胞（SPC）、人骨髓神经母细胞瘤细胞（SH-SY5Y）24、48h后，应用体外细胞培养技术、倒置
相差显微镜观察、Cell Counting Kit-8（CCK-8）细胞增殖和毒性实验检测独角莲根茎水提物对各肿瘤细胞的生长
抑制作用并筛选出对独角莲根茎水提物最敏感的肿瘤细胞株，运用AV/PI双染流式细胞术对该细胞株生长抑制机
理进行初步探讨。结果表明 ：独角莲根茎水提物对HeLa、HL60、SPC、SH-SY5Y细胞的生长具有抑制作用，与细胞
作用48h时的IC50 分别为2.575、16.054、2.077、0.862mg·mL-1，与细胞作用24h时的IC50 分别为4.303、21.674、3.114、
1.158mg·mL-1 ；倒置相差显微镜观察和流式细胞仪检测结果表明独角莲根茎水提物可能是通过诱导肿瘤细胞发生
凋亡来抑制其生长的。
关键词 ：独角莲 ；细胞抑制率 ；半数抑制浓度 ；CCK-8 ；流式细胞术
中图分类号 ：R273 文献标识码 ：A 文章编号 ：1673-842X (2012) 03- 0218- 04
收稿日期 ：2011-09-16
作者简介 ：王世强（1983-），男，辽宁沈阳人，2009 级硕士研究生，研究方向 ：植物资源及利用。
通讯作者 ：康宗利（1973-），男，辽宁葫芦岛人，副教授，博士，研究方向 ：植物资源及利用。
Anti-cancer Effect of Typhoniura giganteum EngL in Vitro
WANG Shi-qiang1，MA Li-hong2，YANG Yu-hong1，WANG Xiao-xin1，KANG Zong-li1
（1. Shenyang Agricultural University，Shenyang 110866，Liaoning，China ；
2. Shenyang No. 5 Peoples Hospital，Shenyang 110023，Liaoning，China）
Abstract ：To investigate the anti-cancer effect of the aqueous extract from dried powdered rhizomes
of Typhoniura giganteum EngL（AEoTGE） in vitro，several cell lines such as HeLa，HL60，SPC and SH-
SY5Y were respectively treated with AEoTGE at 24 and 48h. Then the cellular morphology was observed by
phase contrast microscopy，meanwhile the inhibition ratio was measured by CCK-8 assay. The aim was to
DOI：10.13194/j.jlunivtcm.2012.03.220.wangshq.084
219
1 4 卷 辽 宁 中 医 药 大 学 学 报
1 材料与方法
1.1 材料
供试独角莲主产于河南禹州市。将新鲜独
角莲根茎洗净、去皮，取 100g 切成厚度约 1cm 的
薄片，加蒸馏水 800mL，浸泡 40min，煮沸 1h，4 层
纱布过滤，药渣再煮沸 30min，4 层纱布过滤。合
并，80℃浓缩至 50mg·mL-1，0.22μm 滤膜过滤除
菌，置 4℃冰箱保存备用。供试高糖 DMEM 培养
液、RPMI-1640 培养液、胎牛血清均购自 Hyclone
公 司 ；Cell Counting Kit-8 试 剂 盒 购 自 日 本 同 仁
化学研究所 ；胰蛋白酶购自碧云天生物技术研
究所 ；AV/PI 流式检测细胞凋亡试剂盒购自碧云
天生物技术。试验所使用的仪器有 CO2 培养箱
（Heal Force）、超净工作台（苏州净化设备有限公
司）、超纯水系统（Heal Force）、酶标仪（Bio Tek）、
倒 置 相 差 显 微 镜（Motic）、流 式 细 胞 仪（Becton
Dickinson）。
1.2 方法
HeLa 细 胞 培 养 于 含 有 10 ％ 胎 血 清 的 高 糖
DMEM 培养基中，在 37℃、5％ CO2、饱和湿度条件
下的细胞培养箱中培养，细胞贴壁生长 ；HL60 细胞
培养于含有 10％胎牛血清的 RPMI-1640 培养基中，
在 37℃、5％ CO2、饱和湿度条件下的细胞培养箱中
培养，细胞悬浮生长 ；SPC 细胞培养于含有 10％胎
血清的 RPMI-1640 培养基中，在 37℃、5％ CO2、饱
和湿度条件下的细胞培养箱中培养，细胞贴壁生
长 ；SH-SY5Y 细胞培养于含有 10％胎血清的高糖
DMEM 培养基中，在 37℃、5％ CO2、饱和湿度条件
下的细胞培养箱中培养，细胞贴壁生长 ；每 3~4 天
传代一次。
1.2.1 CCK-8法检测独角莲根茎水提物对各肿瘤
细胞的生长抑制作用
胰蛋白酶消化对数生长期的贴壁细胞，进
行 细 胞 计 数，并 进 一 步 把 细 胞 稀 释 成 2.0×104
个·mL-1 的细胞悬液 ；悬浮细胞直接离心收集并
稀释为 2.0×104 个·mL-1 的细胞悬液，将细胞分
别接种于 96 孔培养板，每孔加 100μL 细胞悬液，
使得每孔约含 2000 个细胞，将培养板置 37℃，5%
CO2 培养箱内培养 24h。加入 10μL 独角莲根茎
水提物并使其终浓度为 0.5、1、2、4mg·mL-1，每个
浓度设 3 个平行孔，以 10μL 灭菌双蒸水作为对
照组，无细胞组作为调零组。将培养板置 37 ℃，
5% CO2 饱和湿度的培养箱内分别继续培养 24、
48h。每孔加入 CCK-8 试剂 10μL，置 37 ℃培养
箱 中 孵 育 1h，于 酶 标 仪 450nm 下 测 定 OD 值，按
公式计算独角莲根茎水提物对各肿瘤细胞的生
长 抑 制 率（inhibitory rate，IR）[1]。IR=1-[（加 药
组 OD 值 - 调 零 组 OD 值）/（对 照 组 OD 值 - 调 零
组 OD 值）]×100%，并求出半抑制浓度（the half
maximal inhibitory concentration，IC50）。
1.2.2 倒置相差显微镜观察细胞形态实验
采用倒置相差显微镜观察 2mg·mL-1 独角莲根
茎水提物处理 HeLa、HL60、SPC、SH-SY5Y 细胞 24、
48h 后的形态变化。
1.2.3 AV/PI流式细胞术检测细胞凋亡
2mg·mL-1 独角莲根茎水提物处理最敏感肿
瘤细胞 24、48h 后收集细胞且细胞量应达到 1×106
个·mL-1，按照 AV/PI 流式检测细胞凋亡试剂盒说
明书固定细胞、染色，流式细胞仪检测分析 [2-3]。
2 结果与分析
2.1 独角莲水提物对HeLa、HL60、SPC、SH-SY5Y细胞
增殖的影响
见表 1~4。由表 1~4 可知，独角莲根茎水提物
对 HeLa、HL60、SPC、SH-SY5Y 细 胞 的 生 长 具 有
抑 制 作 用，与 细 胞 作 用 48h 时 的 IC50 分 别 为 2.575
mg·mL-1、16.054 mg·mL-1、2.077mg·mL-1、0.862
mg·mL-1，与 细 胞 作 用 24 h 时 的 IC50 分 别 为 4.303
mg·mL-1、21.674 mg·mL-1、3.114 mg·mL-1、1.158
mg·mL-1。
表 1 独角莲水提物对 HeLa 细胞增殖的影响
组别 剂量（mg/mL）
24h 48h
OD IR IC50 OD IR IC50
对照组 - 0.702±0.006 -
4.303
0.723±0.004 -
2.575
提取液 0.5 0.537±0.011 23.50 0.514±0.012 28.91
1 0.479±0.005 31.77 0.439±0.016 39.28
2 0.404±0.018 42.45 0.383±0.008 47.03
5 0.348±0.007 50.43 0.304±0.013 57.95
表 2 独角莲水提物对 HL60 细胞增殖的影响
组别 剂量（mg/mL）
24h 48h
OD IR IC50 OD IR IC50
对照组 - 0.797±0.007 -
21.674
0.815±0.008 -
16.054
提取液 0.5 0.642±0.0013 19.45 0.635±0.021 22.09
1 0.623±0.017 21.83 0.602±0.007 26.13
2 0.554±0.004 30.49 0.543±0.006 33.37
5 0.513±0.023 35.63 0.498±0.014 38.90
表 3 独角莲水提物对 SPC 细胞增殖的影响
组别 剂量（mg/mL）
24h 48h
OD IR IC50 OD IR IC50
对照组 - 0.723±0.013 -
3.114
0.754±0.024 -
2.077
提取液 0.5 0.511±0.025 29.32 0.500±0.008 33.69
1 0.428±0.031 40.80 0.412±0.014 45.36
2 0.391±0.026 45.92 0.376±0.007 50.13
5 0.334±0.017 53.80 0.318±0.032 57.82
screen the most sensitive cell lines to AEoTGE among the cancer cell lines. Flow cytometry was used to further
investgate the primary mechanisms of cell death. The results showed that AEoTGE inhibited the growth in
HeLa，HL60，SPC and SH-SY5Y cells. The IC50 was 2.575mg·mL-1，16.054mg·mL-1，2.077mg·mL-1 and
0.862mg·mL-1，respectively at 48h，while the IC50 was 4.303mg·mL-1，21.674mg·mL-1，3.114mg·mL-1 and
1.158mg·mL-1 at 24h. Moreover，the apoptotic bodies were observed by phase contrast microscopy and the
apoptotic cell count were detected by flow cytometry suggesting that AEoTGE could induce apoptosis to inhibit
the growth of cancer cells.
Key words ：AEoTGE ；inhibitory ratio ；IC50 ；CCK-8 ；flow cytometry
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辽 宁 中 医 药 大 学 学 报 1 4 卷
表 4 独角莲水提物对 SH-SY5Y 细胞增殖的影响
组别 剂量（mg/mL）
24h 48h
OD IR IC50 OD IR IC50
对照组 - 0.657±0.011 -
1.158
0.694±0.007 -
0.862
提取液 0.5 0.424±0.023 35.46 0.389±0.014 43.95
1 0.339±0.016 48.40 0.353±0.034 49.14
2 0.268±0.005 59.21 0.263±0.021 62.10
5 0.178±0.012 72.91 0.155±0.018 77.67
2.2 倒置相差显微镜观察细胞形态结果
见图 1~4。由图 1~4 可见，2mg·mL-1 独角莲根
茎水提物处理 HeLa、HL60、SPC、SH-SY5Y 细胞 24、
48h 后，与未加药组比较细胞均出现变圆、皱缩现
象，且加药时间越长，细胞形态变化越显著。
CON
24h
48h
图 1 2mg·mL-1 独角莲根茎水提物处理 HeLa
细胞 24、48 h 后的形态学观察（×200）
CON
24h
48h
图 2 2mg·mL-1 独角莲根茎水提物处理 HL60
细胞 24、48h 后的形态学观察（×100）
CON
24h
48h
图 3 2mg·mL-1 独角莲根茎水提物处理 SPC
细胞 24、48h 后的形态学观察（×100）
221
1 4 卷 辽 宁 中 医 药 大 学 学 报
CON
24h
48h
图 4 2mg·mL-1 独角莲根茎水提物处理 SH-
SY5Y 细胞 24、48h 后的形态学观察（×200）
2.3 流式细胞术检测细胞凋亡
见图 5。由图 5 和可见，2mg·mL-1 独角莲根茎
水提物处理 SH-SY5Y 细胞 24、48h 后，与未加药组
比较细胞早期凋亡和晚期凋亡均有所增加，且随加
药时间增长，细胞凋亡增加。
图 5 2mg·mL-1 独角莲根茎水提物处理
SH-SY5Y 细胞 24、48h 后的凋亡情况
3 结果与讨论
独角莲（Typhoniura giganteum EngL.）为天南
星科植物，中医记载其具有解毒散结止痛之功效，
据报道，独角莲在临床上被用于治疗多种恶性肿
瘤疾病 [4-5]，且疗效较好。然而，关于独角莲根茎
水提物（AEoTGE）体外抗肿瘤活性的研究至今鲜
有报道。随着肿瘤研究在分子水平上的进展，体
外抗肿瘤及机理研究已经成为肿瘤研究的热点领
域。实验采用的 CCK-8 法具有检测快速、灵敏度
高、重复性好等特点，是 MTT 的改进方法，整体性
能优于 MTT，已被广泛用于一些生物活性因子的
活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞增殖试
验、细胞毒性试验以及药敏试验等。实验结果表
明，独角莲根茎水提物对 HeLa、HL60、SPC、SH-
SY5Y 细胞的生长具有抑制作用，且在一定浓度范
围内具有时间和剂量依赖性。2mg·mL-1 独角莲
根茎水提物处理可以诱导 SH-SY5Y 细胞凋亡，并
随时间延长，凋亡程度加深。
近年来的研究已经表明，凋亡密切参与了肿瘤
的发生、发展和治疗等相关过程，利用有关的凋亡诱
导和调控机制诱导肿瘤细胞凋亡已经成为治疗肿瘤
的一个重要途径 [6]。因此，抑制肿瘤细胞的生长，诱
导和加速肿瘤细胞凋亡的研究，已经成为当今肿瘤
治疗研究的热点。
在癌症发生、发展、消亡机理方面来说，独角莲
对 SH-SY5Y 细胞增殖抑制与诱导凋亡之间的关系
有待进一步的研究，对于癌症的治疗具有重大意
义。◆
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