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剑麻茎腐病菌突变株的生物学特性研究



全 文 :第 4期
文章编号:1673- 7636(2009)04- 0261- 06
收稿日期: 2009- 04- 10
资助项目: 2007年公益性行业(农业)科研专项经费资助(项目编号:nyhyzx07- 018),麻类现代农业产业技术体系建设专项资金资助
作者简介: 赵艳龙(1968- ),男,高级农艺师,从事热带作物病虫害研究。 E- mail:zylyym@163.com.Tel:0759- 2859311.* 通讯作者,
E- mail:zhanrulin555@163.com
剑麻茎腐病菌突变株的生物学特性研究
赵艳龙,周文钊,何衍彪, 常金梅,詹儒林 *
(中国热带农业科学院南亚热带作物研究所,湛江 524091)
摘 要:从感病剑麻植株中分离到了一株茎腐病菌的突变菌株,并对其形态特征和生物学特性
进行了研究。与已报道的黑曲霉菌明显不同的是:该菌在 PDA平板上菌丝丰富、白色、产孢速度慢,
其分生孢子表面有瘤状突起。该菌菌落生长与产孢的温度范围为 15℃~40℃,最适为 35℃;菌落生
长的最适 pH 值为 9,各 pH 值条件下产孢无显著差异;全光照条件下菌落生长和产孢速度显著快
于光暗交替和全黑暗条件。 孢子萌发的温度为 20℃~45℃,最适为 35℃;pH值 4~6时,孢子萌发
率最高;光照对孢子萌发没有明显的影响;分生孢子的致死温度为 50℃,10min。
关键词:剑麻;茎腐病;突变菌株;生物学特性
中图分类号:S563.8 文献标志码:A
A Study on the Biological Characeristics of Mutant Strain of
Aspergillus niger in Sisal
ZHAOYan- long,ZHOUWen- zhao,HE Yan- biao,CHANG Jin- mei,ZHANRu- lin
(South Subtropics Crops Research Institute,Zhangjiang,Guangdong 524091,China)
Abstract:Amutant strain of Aspergillus niger from susceptible sisal was isolated. The morphological
and biological characeristics were also identified. Compared with those strains of Aspergillus niger
reported,the mutant strain was with richer white hyphae,slower sporulation on PDA plate culture,strumaes
on surface of conidium. The temperature for colony growth and sporulation was 15~40℃.The optimum
temperature was 35℃ .The optimum pH for colony growth was 9. However there was no significant
differences among pH treatments for sporulation.The colony growth and sporulation were faster significantly
under light than dark or alternation of light and dark for 12 hours.The range of temperature for conidia
germination was 20~45℃,the optimumwas 35℃.The range of pH for conidia germination was 4~8,the
optimum was 4~6. There was no obvious effect of light on conidia germination.The lethal temperature for
conidia was 50℃ remaining 10 minutes.
Key words:sisal;stem rot disease;mutant strain;biological characteristics
剑麻是重要的的热带纤维作物。我国自上世纪六十年代开始种植 H.11648,至今已有近五十年
历史。剑麻的“两病”即剑麻斑马纹病和剑麻茎腐病是剑麻传统的也是最严重的病害[1,2]。笔者在茎
腐病的研究中,发现一株与茎腐病症状相似的植株,表现为未展开的心叶(心轴)发病,首先在心叶
基部产生水渍状灰褐色病斑,不规则形,以后病斑不断向上扩展,最早产生的病斑组织因失水而干
枯,逐渐向上发展,最后底下部产生大量黑色分生孢子堆,与剑麻茎腐病产生的黑曲霉分生孢子堆
非常相似,该病的症状如图 1。我们按柯赫氏法则对该植株的病原菌进行了分离、鉴定,得到的菌株
2009年第 31卷第 4期 中国麻业科学 PLANT FIBER SCIENCES IN CHINA 261
中国麻业科学 第 31卷
图 1 整株剑麻感病症状
Fig.1 Symptom of susceptible sisal
命名为“ANM”,并对其生物学特性进行了初步研究。
1 材料
已报道的剑麻黑曲霉菌(Aspergillus niger)菌株(简称 AN,下同);感病植株上分离得到的菌株
ANM;PDA培养基。
2 方法
2.1 “AN”与“ANM”两菌株的比较
分别挑取少量 AN和 ANM在 PDA平板上,置于 30℃的生化培养箱中培养,7d后分别配成浓
度为 1×106个 /ml的分生孢子悬浮液,各滴 2μl分生孢子悬浮液于 PDA平板中央,并置 30℃培
养,2d后观察菌落形态、质地和颜色,5d后挑取分生孢子在显微镜下观察比较其结构形态。
2.2 病菌生物学特性测定
2.2.1 菌落生长速度与产孢数量的测量
菌落生长速度用培养一定时间后的菌落直径的大小表示,菌落直径用十字法测量;测产孢子数
量时,每培养皿用一定量的无菌水洗下里面的分生孢子,在血球计数板上观察分生孢子的浓度,计
算出每培养皿产生的分生孢子数,计算公式是:分生孢子数 =分生孢子浓度×无菌水的用量。
用邓肯氏新复极差法(DMRT)对测定的结果进行方差分析。
2.2.1.1 温度对菌落生长与产孢的影响
将 ANM在 PDA平板上 30℃培养 7d,配成浓度为 1×106个 /ml的分生孢子悬浮液,滴 2μl于
PDA平板的中心,分别置于 5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃九个温度下培养,5d
后测量菌落直径和每皿产孢数量。
各处理温度设二个培养皿,三次重复。
2.2.1.2 pH值对菌落生长与产孢的影响
将 ANM在 PDA平板上 30℃培养 7d,配成浓度为 1×106个 /ml的分生孢子悬浮液,滴 2μl于
PDA平板的中心,分别置于 4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0十个 pH值条件下培养,5d后
测量菌落直径和每皿产孢数量。
各处理温度设二个培养皿,三次重复。
2.2.1.3 光照对菌落生长与产孢的影响
将 ANM在 PDA平板上 30℃培养 7d,配成浓度为 1×106个 /ml的分生孢子悬浮液,滴 2μl于
PDA平板的中心,分别置于全光照、全黑暗、光暗交替三种光照条件下培养,5d后测量菌落直径和
每皿产孢数量。
262
第 4期
图 2 菌落形态(左为 ANM,右为 AN)
Fig.2 The colony morphology of ANM(left)and AN(right)strains
各处理温度设二个培养皿,三次重复。
2.2.2 分生孢子萌发率的测量
用载玻片萌发法[3],使用凹玻片[4]。
配制分生孢子悬浮液时用蛋白胨葡萄糖液体培养基(POD)。POD制作方法:蛋白胨 20g、酵母
浸出粉 0.5g、KH2PO41g、MgSO4·10H2O 0.5g、葡萄糖 10g,加蒸馏水至 1000ml,高压灭菌[5]。
分生孢子萌发率(%)=萌发的分生孢子数 /观察的总分生孢子数×100
2.2.2.1 温度对分生孢子萌发的影响
将在 PDA培养基上 30℃培养 7d后产生的 ANM分生孢子用 POD培养液洗下,配制成浓度为
10000个 /ml的分生孢子悬浮液,滴一滴于凹玻片的凹槽中,分别置温度为 15℃、20℃、25℃、30℃、
35℃、40℃、45℃和 50℃下培养,10h后观察分生孢子萌发情况,计算分生孢子萌发率。各处理温度
设二片,三次重复。
2.2.2.2 pH值对分生孢子萌发的影响
将在 PDA培养基上 30℃培养 7d后产生的 ANM分生孢子用 pH 值分别为 4.0、4.5、5.0、5.5、
6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0的 POD培养液洗下,配制成浓度为 10000个 /ml的分生孢子悬浮液,
滴一滴于凹玻片的凹槽中,置于 35℃下培养,10h后观察分生孢子萌发情况,计算分生孢子萌发率。
各处理 pH值设二片,三次重复。
2.2.2.3 光照对分生孢子萌发的影响
将在 PDA培养基上 30℃培养 7d后产生的 ANM分生孢子用 POD培养液洗下,配制成浓度为
10000个 /ml的分生孢子悬浮液,滴一滴于凹玻片的凹槽中,置于 35℃下培养,光照条件分别设全
光照、全黑暗、先光照再黑暗和先黑暗再光照四种,10h后观察分生孢子萌发情况,计算分生孢子萌
发率。各处理设二片,三次重复。
2.2.3 致死温度的测定
将在 PDA培养基上 30℃培养 7d后产生的 ANM分生孢子用 POD培养液洗下,配制成浓度为
10000个 /ml的分生孢子悬浮液,每支试管倒入 2ml该悬浮液,分别放入 35℃、40℃、45℃、50℃、
55℃和 60℃的恒温水浴锅,处理 10 min后,立即用冷水降温,后放入 35℃的恒温箱中,10h后观察
分生孢子萌发状况。
3 结果与分析
3.1 菌落形态与分生孢子形态的比较
菌落形态见图 2,从图可见:ANM的菌丝较丰富,且颜色明显比 AN白;AN培养 2d后便在菌落
中心产生很多分生孢子(黑色),而 ANM培养 2d还未见产生分生孢子。说明 ANM营养生长旺盛,
产孢较慢,而 AN生殖生长快些,产孢较快。
赵艳龙等:剑麻茎腐病菌突变株的生物学特性研究 263
中国麻业科学 第 31卷
图 3 分生孢子形态(左为 ANM、右为 AN)
Fig.3 Conidia of strains ANN(left)and AN(right)
7.00
6.00
5.00
4.00
3.00
2.00
1.00
0.00
15 20 25 30 35 40
1200.00
1000.00
800.00
600.00
400.00
200.00
0.00





cm











菌落直径 每皿产孢数
F
E
D
B
A
C
d d
c
b
a
c
培养温度(℃)
图 4 不同培养温度对菌落生长与产孢数量的影响
Fig.4 Effect of temperature on mycelial growth and sporulation
图 5 不同 pH 值对菌落生长与产孢数量的影响
Fig.5 Effect of pH on mycelial growth and sporulation





cm











菌落直径 每皿产孢数
8.00
6.00
4.00
2.00
0.00
200.00
190.00
180.00
170.00
160.00
150.004.5 5 5.5 6 6.5 7 7.5 8 8.5 9
pH值
D CB BC CD CD B B B B A
a a
a
a
a
a
a
a
a
a
分生孢子形态见图 3,从图可见:两个菌株的分生孢子都是呈圆形,但 AN的分生孢子边缘光
滑,而 ANM边缘不光滑,有细微的瘤状突起。
3.2 温度对菌落生长速度与产孢数量的影响
图 4表明:在 10℃以下或 45℃以上菌落不生长,随着培养温度的上升,菌落直径显著增大,
35℃是菌丝生长最快的培养温度,40℃时,菌丝生长速度明显减慢。从产孢情况来看,35℃条件下产
孢显著多于其它温度下的产孢数量,其次依次是 30℃,40℃,25℃,20℃,15℃。10℃以下和 45℃以
上不产孢。图中英文字母表示差异显著性。
3.3 pH值对菌落生长和产孢数量的影响
由图 5可见:菌落生长总的趋势是 pH从 4.5- 9,菌落直径差异不大,产孢数量呈“M”型曲线,在
pH4.5、7.5、9.0时产孢数量少;在 pH6.5时达到最大值,pH8.5时达较大值。从产孢情况来看,所有
的 pH值条件下的产孢数量都无显著差异。图中英文字母表示差异显著性。
264
第 4期
表 1 不同温度对分生孢子萌发的影响
Tab.1 Effect of temperature on spore germination of strain
温度(℃) 15 20 25 30 35 40 45 50
孢子萌发率(%) 0 8 23 90 92 67 42 0
表 2 不同 pH 值对分生孢子萌发的影响
Tab.2 Effect of pH on spore germination of strain
pH 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0
孢子萌发率(%) 70 73 73 70 69 43 18 5 1 0 0
表 3 不同光照条件对分生孢子萌发的影响
Tab.3 Effect of light on spore germination of strain
光照条件 光照 10h 黑暗 10h 光照 5h黑暗 5h 黑暗 5h光照 5h
孢子萌发率(%) 88 88 90 92
表 4 分生孢子致死温度的测定
Tab.4 Determination of lethal temperature for conidium
温度(℃)
35
40
45
50
55
60
分生孢子萌发数
498
405
392
0
0
0
分生孢子总数
571
473
607
517
628
492
萌发率(%)
87
86
65
0
0
0
图 6 不同光照条件对菌落生长速度与产孢数量的影响
Fig.6 Effect of light on mycelial growth and sporulation
光照条件





cm










)6.00
5.00
4.00
3.00
2.00
1.00
0.00
300.00
250.00
100.00
150.00
100.00
50.00
0.00
光照 黑暗 光暗交替
A
a
B
b
B b
菌落直径 每皿产孢数
3.4 光照对菌落生长和产孢数量的影响
图 6可见:全光照条件比黑暗与光暗交替条件下的菌落生长显著快。从产孢来看,全光照条件
比全黑暗与光暗交替条件下的产孢数量显著多。图中英文字母表示差异显著性。
3.5 温度对孢子萌发的影响
由表 1可见:温度对孢子萌发的影响较大:当温度为 15℃时,孢子不萌发;15至 45℃之间都可
以萌发;随着温度的上升,孢子萌发率增加,特别是达到 30℃以上,显著增加,至 35℃时萌发率最
高,40℃时萌发率又开始下降,50℃下不萌发。
3.6 不同 pH值对分生孢子萌发的影响
由表 2可见:pH值为 4.5- 6.0之间时,对孢子萌发的影响不大,萌发率在 70%左右,当 pH值
6.5时,萌发率明显下降,以后随着 pH值的增大,萌发率下降明显,当 pH值达到 8.5和 9时,孢子
不萌发。
3.7 不同光照对分生孢子萌发的影响
由表 3可见:不同光照条件对分生孢子萌发影响不大。
3.8 致死温度的测定结果
由表 4可见:分生孢子的致死温度为 50℃
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3 结论
不同播种期对亚麻生育期、主要经济性状及产量性状都有一定的影响,所设的 5个处理,全生
育日数随播种期的延后而缩短,株高随播种期的延后变矮,单株茎重也基本是随着播种期的延后
而降低,干茎制成率、出麻率及原茎产量和纤维产量出现先升后降的抛物线变化。通过对原茎产量
和纤维产量方差分析,处理间差异达极显著和显著水平。
综合各项指标,处理 B和处理 C产量及出麻率高于其它处理,因此在弥勒或类似气候条件地
区,于 10月底到 11月中旬播种有利于提高原茎产量及纤维产量。
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4 讨论和结论
4.1 由于单一品种的多年种植,近年来,剑麻新病虫害不断滋生,公开报道的主要有剑麻紫色卷叶
病和新菠萝灰粉蚧、剑麻茎天牛[6,7,8]。本文所报道的病害症状与剑麻茎腐病症状非常相似,但该病害
是在盆栽剑麻苗上发现的,大田剑麻未发现该症状的病害;剑麻茎腐病多是从叶基的割口处开始感
病,而发生该病害的植株并没有割叶,估计是由于种植前茎部被割伤感染病菌所引起的。
4.2 ANM菌株和 AN菌株产生的分生孢子堆非常相似,分生孢子形状大小与黑曲霉基本相同,二
者不同的是:ANM菌丝较丰富,颜色也较白,在 PDA平板上培养时比 AN产孢较慢,且分生孢子边
缘有瘤状突起。
4.3 该突变菌株与黑曲霉普通菌株一样喜高温,其菌丝生长与产孢最佳温度是 35℃,分生孢子萌
发的最佳温度是 35℃。
4.4 pH值对该菌菌落生长影响较大:pH值越高,菌落生长越快,pH值为 9时,菌落生长最快;pH
值为 4.5时,菌落生长最慢。但 pH值对该菌的产孢量没有显著影响。pH为 4~6时,最适于孢子萌
发。
4.5 全光照条件下,菌落生长速度显著快于全黑暗与光暗交替条件,产孢量也显著多于全黑暗与
光暗交替条件。但光照条件对孢子萌发没有明显影响。
4.6 经测定,分生孢子的致死温度为 50℃10min。
4.7 本研究丰富了剑麻病害资源库,为该病的防治提供了一定的参考依据。
参考文献:
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