全 文 :书*基金项目:浙江省重点创新团队科研基金项目(2009R50042)
作者简介:施燕娜(1992-),女,研究方向:中药资源开发与利用。E-mail:18767167354@163.com
**通讯作者:E-mail:zjtcmdzs@163.com
半夏和滴水珠抗五步蛇毒中毒作用的实验研究*
施燕娜,李伟平,陶 陶,朱紫薇,陈铌铍,丁志山**
(浙江中医药大学生命科学学院,浙江杭州 310053)
[摘要] 目的 研究滴水珠与半夏生药及其提取物抗五步蛇毒的作用。 方法 将ICR小鼠随机分为半夏生药组、半夏醇提
物组、滴水珠生药组、滴水珠醇提物组、空白对照组、阳性对照组及模型组,各组小鼠均灌胃给药7天,并观察各给药组小鼠的体
重变化情况;在末次给药1h后于小鼠腹腔注射五步蛇毒,观察各组小鼠的中毒表现,并统计各组小鼠的死亡率,比较各组小鼠
的肝脏指数、脾脏指数及胸腺指数,并对各组小鼠血浆纤维蛋白原(FIB)、血浆凝血酶原时间(PT)、凝血酶时间(TT)、活化部分
凝血酶时间(APTT)以及血小板(PLT)、红细胞(RBC)和白细胞(WBC)计数进行比较。 结果 半夏和滴水珠醇提物、半夏和
滴水珠生药均可降低五步蛇毒中毒小鼠的死亡率,对五步蛇毒引起的小鼠PT、TT、APTT上升和FIB下降具有显著的抑制作
用,与模型组相比P<0.05;并可影响五步蛇毒中毒小鼠外周血血小板(PLT)、红细胞(RBC)和白细胞(WBC)计数,与模型组相
比P<0.05。但滴水珠和半夏生药可引起小鼠体重下降,并影响肝脏、胸腺和脾脏指数,与空白对照组相比P<0.05。 结论
半夏和滴水珠醇提物及半夏和滴水珠生药均具有一定的抗五步蛇毒作用,乙醇提取能降低半夏和滴水珠的毒性。
[关键词] 五步蛇毒;抗蛇毒损伤;半夏;滴水珠;毒性
[中图分类号] R996.3 [文献标识码] A [文章编号] 1001-5639(2012)03-0233-04
doi:10.3969/j.issn.1001-5639.2012.03.001
The study of the Rhizoma Pinelliae Cordatae and Rhizoma
Pinelliae against Agkistrodon acutus(Guenther)
snake venom poisoning*
SHI Yan-na,LI Wei-ping,TAO Tao,ZHU Zi-wei,CHEN Ni-pi,DING Zhi-shan**
(Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou,Zhejiang,310053,China)
Abstract: Objective To research the Rhizoma Pinelliae Cordatae and Rhizoma Pinelliae of their crude drugs
and alcohol extracts'effection resist of Agkistrodon acutus snake venom. Methods Randomly divide ICR mice
into Pinelia crude drugs,Pinelia alcohol extract,Pinelia cordata crude drugs,Pinelia cordata alcohol extract,blank
group,model group and the positive control group,observing each group of the body weight change after 7days in-
tragastric administration.For the last time of administration,each mice group were intraperitonealy injected with
Agkistrodon acutus snake venom after 1hour later,then observing mice's poisoning performance and calculating the
death rate.Comparing each group of the mice's liver index,spleen index and thymus index,meanwhile,detect the
period of fibers in plasma fibrinogen(FIB),plasma prothrombin time(PT),thrombin time(TT),activated partial
thromboplastin time(APTT)and compare platelet(PLT),red blood cel (RBC)and white blood cel (WBC)
number,thus discuss the Pineliae and Pineliae Cordatae effects against Agkistrodon acutus(Guenther)snake ven-
om poisoning. Results Pineliae Cordatae and Pineliae of their crude drugs and alcohol extract can reduce the
mortality of Agkistrodon acutus snake venom poisoning.Also,they have significantly inhibition on increasing the
PT,TT,APTT and decline FIB of the mice which inject the snake venom,compared with the model group,P<
0.05.What's more,their influence on the number of the blood platelets(PLT),the number of red blood cels
(RBC)and the number of white blood cel (WBC)were obviously,compared with the model group,P<0.05.
However,Pineliae Cordatae and Pineliae crude drugs can decrease the body weight of mice,impacting the liver in-
dex,spleen index and thymus index,compared with the blank group,P<0.05. Conclusion Pineliae and Pineli-
ae Cordatae of their crude drugs and alcohol extracts'can against Agkistrodon acutus snake venom poisoning.Etha-
nol extraction also can decrease their toxicity.
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蛇 志 Journal of SNAKE(Science &NAture are KEy to health) 2012年第24卷第3期 Vol.24No.3,2012
Key words: Agkistrodon acutus(Guenther)snake venom;Against snake venom poisoning;Rhizoma Pinelliae;
Rhizoma Pinelliae Cordatae;Toxicity
半夏[Pinelia ternata(Thunb.)Breit.]、滴水珠(Plnelia
cordata)为天南星科半夏属植物。半夏具有燥湿化痰、降逆
止呕、消痞散结的功效;临床主要用于镇咳、祛痰、镇吐、抗溃
疡、抗心律失常等作用。滴水珠具有解毒消肿、散淤止痛功
效;临床用于治疗头痛、神经痛、胃病等疾病。半夏、滴水珠
对毒蛇咬伤也具有防治作用[1],但其抗蛇毒作用目前缺乏系
统的研究。本研究对半夏和滴水珠生药以及提取物的抗五
步蛇毒中毒作用进行了初步的考察,现将研究结果报告如
下。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 仪器与试剂 (1)仪器。R201旋转式蒸发仪(上海
申胜生物技术有限公司),D180C自动双重纯水蒸馏器(上海
申胜生物技术有限公司),AR2130电子精密天平(Ohaus
Corp.Pine Brook,NJ,USA),DZG-6050型真空干燥箱(上海
森信实验仪器有限公司),SHZ-82恒温振荡器(常州国华电
器有限公司),YS-100普通显微镜(NIKON)。(2)试剂。无
水乙醇(AR,杭州长征化学试剂有限公司,批号:20110705),
生理盐水(浙江莎普爱思药业股份有限公司,批号:H 10424-
1),纤维蛋白原(FIB)(上海太阳生物技术有限公司,批号:
1320351),凝血酶时间(TT)测定试剂盒(凝固法)(上海太阳
生物技术有限公司,批号:121080),活化部分凝血活酶时间
(APTT)测定试剂盒(鞣花酸)(上海太阳生物技术有限公司,
批号:1121281),凝血酶原时间(PT)测定试剂盒(凝固法)(上
海太阳生物技术有限公司,批号:103181)。
1.1.2 动物 ICR小鼠72只,体重18~22g,雌雄各半,由
浙江中医药大学实验动物中心提供。
1.1.3 蛇毒 五步蛇为浙江中医药大学生物技术研究所提
供;五步蛇毒由本实验室采集,采用低温冷冻干燥法进行提
取干燥,呈白色。
1.1.4 试验用药 季德胜蛇药片(南通精华制药股份有限
公司,批号:110932),半夏和滴水珠(采自浙江省衢州市江山
宝珠农业有限公司,经浙江中医药大学中药学博士丁志山教
授鉴定,质量符合相关的规定)。药物的提取:将半夏和滴水
珠药材分别打粉,过80目筛,分别取500g左右,加入2000
ml 95%乙醇回流提取1.5h,过滤,滤渣再次加入2000ml
95%乙醇提取,共提取3次,合并3次滤液,减压蒸馏将乙醇
蒸干,得半夏和滴水珠醇提物,经真空干燥24h后密封,阴
暗条件下保存。乙醇提取物经碘化铋钾显色呈阳性,表明含
生物碱类成分。
1.2 实验方法
1.2.1 动物分组与给药 将ICR小鼠随机分为半夏醇提物
组、滴水珠醇提物组、半夏生药组、滴水珠生药组、模型组(五
步蛇毒损伤组)、空白对照组以及阳性对照组,其中模型组大
鼠为12只,其余组均为10只。半夏醇提物组、滴水珠醇提
物组分别给予半夏和滴水珠95%乙醇浸膏2mg/只(各药物
以生理盐水为溶剂,配成混悬液),空白对照组和模型组用相
同剂量的生理盐水进行给药,阳性对照组给予季德胜蛇药片
30mg/只,生药组给予对应的生药20mg/只(研钵中碾碎,
用生理盐水配成混悬液)。各组小鼠均以0.2ml的药物灌
胃,连续给药7天,每日给药1次。
1.2.2 小鼠中毒模型建立 各组小鼠均于末次给药后1h
(除空白对照组外),于腹腔注射五步蛇毒100μg/只,造成小
鼠五步蛇毒中毒模型。
1.2.3 小鼠体重变化测定 各组小鼠每次给药前以及处死
前称取体重,比较各组小鼠的体重变化情况。若注射五步蛇
毒后导致小鼠死亡,则于小鼠死亡后立即称取小鼠体重。
1.2.4 小鼠中毒表现观察 造模后,由专人观察并记录各
组小鼠的局部症状,以及食欲、呼吸、活动等全身状况,并在
注射蛇毒12h后统计各组小鼠死亡率。
1.2.5 小鼠中毒后FIB、PT、TT及APTT测定 小鼠造模
后12h于眼眶取血1ml,加入0.1ml 0.109mol/L枸橼酸钠
抗凝管中,3000rpm×5min离心,取血浆,根据血浆凝血酶
原时间(PT)、活化部分凝血酶时间(APTT)、纤维蛋白原
(FIB)、凝血酶时间(TT)试剂盒说明书进行操作,测定相关
指标。
1.2.6 小鼠外周血血象测定 (1)红细胞(RBC)计数。小
鼠造模后于眼眶取全血10μl,立即用990μl红细胞稀释液
(NaCl 0.5g,柠檬酸钠0.25g,甲醛溶液0.25ml,加蒸馏水
溶解,定容到50ml)稀释成红细胞混悬液,取10μl,立即用
490μl红细胞稀释液进行稀释后,在显微镜下用中方格计数
的方法进行红细胞计数。(2)白细胞(WBC)计数。小鼠造模
后,于眼底静脉丛取血10μl,用190μl白细胞稀释液(冰醋
酸加水稀释成2% HAc溶液中,然后加入10g/L结晶紫3
滴)稀释,在显微镜下用大方格计数的方法进行白细胞计数。
(3)血小板(PLT)计数。小鼠造模后,于眼眶取全血10μl,立
即用990μl血小板稀释液[10g/L草酸铵稀释液(乙二胺四
乙酸二钠0.006g,草酸铵0.5g,用50ml蒸馏水溶解,混
匀)]稀释成混悬液,取500μl,再用500μl血小板稀释液稀
释后,于显微镜下用大方格计数的方法进行血小板计数。
1.2.7 小鼠胸腺指数、脾脏指数及肝脏指数测定 小鼠末
次给药20min后注射五步蛇毒,注五步蛇毒12h后处死小
鼠,摘出胸腺、肝脏和脾脏称重,计算胸腺、肝脏和脾指数。
计算公式:肝指数=肝脏重量/小鼠体重×100%;胸腺指数
=胸腺重量/小鼠体重×100%;脾脏指数=脾脏重量/小鼠
体重×100%。
1.3 统计学处理 采用SPSS 12.0统计软件进行统计学处
理,计量资料以均数±标准差(珚x±s)表示,行双侧检验,检验
水准α=0.05。组间多重数据比较采用单因素方差分析,P
<0.05为差异具有统计学意义。
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蛇 志 Journal of SNAKE(Science &NAture are KEy to health) 2012年第24卷第3期 Vol.24No.3,2012
2 结果
2.1 半夏和滴水珠对小鼠体重的影响 各组小鼠灌胃给药
7天后,统计每天体重。结果发现,在灌胃给药4天时各组小
鼠体重都有一定幅度的增加,但各组间比较差异无统计学意
义;在给药第5天开始,半夏生药组和滴水珠生药组的小鼠
体重明显下降,与其他组相比具有统计学意义(P<0.05);半
夏醇提物组及滴水珠醇提物组的小鼠体重与空白对照组和
模型组比较均无统计学意义(均P>0.05)。见图1。
2.2 小鼠的中毒表现 模型组部分小鼠在注射五步蛇毒10
min后出现抽搐,活动减少;30min后模型组3只小鼠死亡,
且除空白对照组外,其余组的小鼠也出现行动迟缓的现象,
继而出现不饮水,呈嗜睡、呼吸急促等中毒症状,但半夏、滴
水珠生药及醇提物组的小鼠在一定程度上可缓解中毒症状。
2.3 半夏和滴水珠对五步蛇毒中毒小鼠死亡率的影响 见
表1。造模6h后,除空白对照组外,其余组小鼠均出现死
亡。各组小鼠五步蛇毒造模中毒后12h,模型组12只小鼠
中4只死亡,死亡率为33.33%;其余各组小鼠的死亡率与模
型组比较,差异有统计学意义(均P<0.05);醇提物组的小
鼠死亡率低于生药组,半夏的死亡率低于滴水珠,半夏醇提
物与阳性对照组比较,无统计学意义。表明半夏的抗蛇毒作
用优于滴水珠。
表1 半夏、滴水珠生药及醇提物对五步蛇毒中毒小鼠死亡
率的影响(n,%)
组别 n 死亡率(%)
空白对照组 10 0
模型组 12 33.33
半夏生药组 10 20
半夏醇提物组 10 10
滴水珠生药组 10 30
滴水珠醇提物组 10 20
阳性对照组 10 10
2.4 半夏和滴水珠生药及醇提物对五步蛇毒中毒小鼠各内
脏器官的影响 见表2。半夏生药组和滴水珠生药组可引起
小鼠脾脏指数和胸腺指数下降,但两组比较无统计学意义;
两组各与其他组相比均有统计学意义(P<0.05)。比较各组
小鼠的肝脏指数,除阳性对照组外,各组小鼠于注射五步蛇
毒后均显著影响肝脏指数,与空白对照组相比具有统计学意
义(P<0.01)。
表2 各组小鼠内脏器官指数比较(珔x±s)
组别 脾指数 肝指数 胸腺指数
空白对照组 0.478±0.088 4.817±0.376△ 0.278±0.065#
模型组 0.429±0.048 4.354±0.243* 0.267±0.033#
半夏生药组 0.376±0.061* 4.319±0.389* 0.189±0.081*△
半夏醇提物组 0.501±0.015 4.562±0.422* 0.231±0.048#
滴水珠生药组 0.398±0.105* 4.239±0.584* 0.170±0.093*△
滴水珠醇提物组 0.497±0.100 4.235±0.340* 0.287±0.022#
阳性对照组 0.441±0.098 4.728±0.244△ 0.307±0.096#
注:与空白对照组比较,*:P<0.01;与模型组比较,△:P<0.01;与半夏生药组比较,#:P<0.01。
2.5 半夏和滴水珠对五步蛇毒中毒小鼠外周血血象的影响
见表3。从表3可见,五步蛇毒造模后小鼠的红细胞、白细
胞及血小板计数明显减少,与空白对照组相比差异有统计学
意义(P<0.05)。各药物组与模型组的小鼠比较,P<0.05;
与阳性对照组比较,P<0.05。各生药组与提醇物组比较,P
<0.05。
2.6 半夏和滴水珠对五步蛇毒中毒小鼠APTT、FIB、PT及
TT的影响 见表4。从表4可见,五步蛇毒造模后小鼠血
浆纤维蛋白原(FIB)含量上升,凝血酶时间(TT)、凝血酶原
时间(PT)和活化部分凝血酶时间(APTT)延长,与空白对照
组相比,P<0.05;与各药物组比较,差异有显著统计学意义
(均P<0.05);与阳性对照组比较,差异具有统计学意义(P
<0.05)。各生药组与醇提物组比较,差异有统计学意义(P
<0.05)。
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表3 各组小鼠外周血血象测定结果(珔x±s)
组别 WBC(×109/L) RBC(×1012/L) PLT(×109/L)
空白对照组 8.05±0.594△#☆ 6.93±0.296△▲☆ 1014±163.28△☆
模型组 5.89±0.298*#☆ 4.68±0.629*▲☆ 749±182.59*☆
半夏生药组 6.04±0.682*# 5.90±0.428*△▲ 798±147.78*△
半夏醇提物组 6.95±0.483*#△ 6.24±0.395*△ 829±198.24*△
滴水珠生药组 6.25±0.728*△#☆ 6.01±0.294*△ 856±204.84*△
滴水珠醇提物组 7.03±0.247*△☆ 6.47±0.379*△ 884±295.61*△☆
阳性对照组 7.48±0.2.34*△☆ 6.76±0.287△ 989.37±159.25△☆
注:与空白对照组比较,*:P<0.05;与模型组比较,△:P<0.05;与阳性对照组比较,#:P<0.05;与半夏生药组比较,
☆:P<0.05;与滴水珠醇提物比较,▲:P<0.05。
表4 各组小鼠凝血酶测定结果(珔x±s)
组别 PT(s) APTT(s) TT(s) FIB(mg/dl)
空白对照组 16.288±2.397△☆ 21.483±3.285△☆★◇▲ 15.493±2.984△#☆▲★ 51.297±10.268△#☆▲★
模型组 37.829±7.135*#☆▲ 41.671±5.313*☆★◇#▲ 31.294±5.276*#☆▲★ 198.463±13.373*#☆▲★
半夏生药组 23.599±2.976*△▲# 27.657±2.644*△★◇# 24.739±4.380*△# 148.382±15.298*△#▲★
半夏醇提物组 19.487±4.295*△☆▲# 25.493±2.978*△◇ 22.472±2.309*△# 104.397±37.594*△#☆
滴水珠生药组 19.035±3.659*△#▲ 29.329±3.278*△☆★# 25.589±1.938*△# 129.397±24.956*△#▲★
滴水珠醇提物组 17.958±3.285*△☆ 26.157±4.179*△★ 20.502±3.297△# 116.389±20.476*△☆#
阳性对照组 15.844±2.544*△☆ 22.891±2.334△★◇▲ 15.963±3.673△☆★◇ 93.593±22.496*△☆▲
注:与空白对照组比较,*:P<0.05;与模型组比较,△:P<0.05;与阳性对照组比较,#:P<0.05;与半夏生药组比较,
☆:P<0.05;与滴水珠醇提物比较,▲:P<0.05;与半夏醇提物组比较,★:P<0.05;与滴水珠生药组比较,◇:P<0.05。
3 讨论
在民间,半夏和滴水珠常用于五步蛇咬伤的治疗,常见
的治法即直接吞服滴水珠或半夏生药,再配合一些清热解毒
药物如紫花地丁等外敷。本实验研究结果发现,半夏和滴水
珠生药对五步蛇毒中毒小鼠具有一定的疗效,与蛇毒损伤模
型组相比,半夏和滴水珠能显著影响五步蛇中毒小鼠血液中
PT、TT、APTT和FIB,同时,对五步蛇毒中毒小鼠血液中血
小板计数、红细胞计数和白细胞计数也有一定的影响,与模
型组相比具有统计学差异,但效果不如季德胜蛇药的阳性对
照组。此外,半夏和滴水珠生药虽然有一定的疗效,但可影
响小鼠的正常生长(体重比空白对照组和醇提物组轻),故在
使用时必须严格注意用量,并加强监管。但通过乙醇提取可
有效降低半夏和滴水珠的毒性,与生药组相比脾脏指数、体
重变化率等均具有显著统计学意义,并且可提高疗效(与生
药组相比有显著性差异)。有文献报道[5],被五步蛇咬伤,局
部伤口(牙痕)处立即注射50%~75%的酒精可收到一定的
解毒效果。本研究结果显示,乙醇提取可以提高中药半夏和
滴水珠的抗五步蛇毒中毒作用。
季德胜蛇药片是目前常用的治疗毒蛇咬伤的中成药。
我们观察发现,季德胜蛇药抗蛇毒的效果优于半夏、滴水珠
等单味药,且未出现毒副作用,但季德胜蛇药为中成药,组方
复杂,价格较高,而半夏和滴水珠分布广,取材较方便,适合
广大农村地区毒蛇咬伤的治疗。同时在本观察中发现,季德
胜蛇药片及半夏和滴水珠均可降低或消除五步蛇毒中毒后
引起的机体血小板计数减少,凝血酶时间(TT)、凝血酶原时
间(PT)和活化部分凝血酶时间(APTT)延长;同时发现给予
半夏和滴水珠可改善五步蛇毒中毒导致的机体凝血障碍、溶
血现象,提示该结果可以为半夏和滴水珠的抗蛇毒的应用提
供一定的实验依据。
[参考文献]
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北京联合大学学报(自然科学版),2012,26(3):46-51.
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较研究[J].中国药物警戒,2010,7(11):646-649.
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峡药学,1998,10(3):51-52.
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义[J].蛇志,2010,22(2):110-112.
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acutus)毒毒性的影响[J].蛇志,2011,23(3):232-234.
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