全 文 ：中医骨伤科杂志，2004，12(4):16-20．
［8］ 章建华，章 权，朱 希，等． 健膝壮骨方对大鼠骨性关
节炎软骨细胞凋亡及其调控基因 P53、Bcl-2 表达作用的影
响［J］． 中华中医药学刊，2012，30(11):2437-2439．
［9］ 邹 季． 骨折愈合实验研究中动物模型选择的有关问题
［J］． 湖北中医学院学报，2002，4(2):25-27．
［10］ 聂 林． 骨关节炎的动物模型［J］． 中华实验外科杂志，
1990，7(2):96-97．
［11］ 方 忠，李 锋，杨 琴，等． 特异性 COX-2 抑制剂对骨
性关节炎的软骨保护作用的临床对照研究［J］． 实用医学
进修杂志，2005，33(4):222-227．
［12］ 段 戡，袁长深，姚弘毅，等． 化淤祛湿法对膝骨关节炎
早期诱导型一氧化氮合酶炎症途径影响的实验研究［J］．
时珍国医国药，2009，20(6):3-4．
［13］ 张铁锋，李景峰． 细胞因子 IL-1β 和 TNF-α 在骨关节炎软
骨中 mＲNA表达的变化及意义［J］． 中国现代医生，2008，
46(15):116-117．
［14］ 季卫锋，施伟峰，陈 林，等． 补肾活血法防治大鼠膝骨
性关节炎的实验研究［J］． 中国骨伤，2012，25(3):
246-250．
12β-羟基藜芦酰棋盘花胺对小鼠小脑和大脑皮层组织 DNA损伤的影响
郭敬功1， 李 林2， 刘迎滑3， 王江英2， 李沙沙2， 沈 姗2， 魏晓利3， 丛 悦2* ，
王天晓3*
(1． 河南大学生命科学学院，河南 开封 475004;2． 河南大学药学院药物研究所，河南 开封 475004;
3． 河南大学药学院中药研究所，河南 开封 475004)
收稿日期:2016-01-21
基金项目:国家自然基金项目 (21102035);河南省科技厅基础研究项目 (142300410128) ;河南省教育厅自然科学项目 (14A180030)
作者简介:郭敬功 (1982—)，男，博士生，从事生物学研究。Tel:(0371)22857224，E-mail:jgguo@ henu． edu． cn
* 通信作者:丛 悦 (1978—)，女，副教授，从事中药药效物质基础研究。Tel:(0371)23880680，E-mail:congyue1027@ 163． com
王天晓 (1975—)，女，教授，从事中药药理研究。Tel:(0371)23880680，E-mail:wtx1975@ 126． com
摘要:目的 探讨 12β-羟基藜芦酰棋盘花胺 (12β-hydroxylveratroylzygadenine，Vog)引起小鼠小脑和大脑皮层组织
DNA损伤的影响。方法 取 132 只雄性昆明种小鼠，随机分为空白组，Vog 高 (2. 50 μmol /kg)、低剂量组
(0. 25 μmol /kg)，给药 7 d。采用彗星实验检测小脑和大脑皮层 DNA损伤及修复情况;酶联免疫法检测 8-羟基脱氧鸟
苷 (8-OHdG)、醌氧化还原酶 (NQO1)含有量;比色法测定小脑和大脑皮层活性氧自由基 (ＲOS)、丙二醛
(MDA)、一氧化氮 (NO)含有量和总超氧化物歧化酶 (T-SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶 (GSH-Px)活力;ＲT-PCＲ检
测小脑和大脑皮层 8-羟基鸟嘌呤 DNA糖苷酶 (Ogg1)和血红素加氧酶-1 (Ho-1)mＲNA 表达。结果 Vog 明显提高
小鼠小脑和大脑皮层 MDA、ＲOS、NO以及尿液中 8-OHdG含有量，降低 GSH-Px 和 T-SOD 活力，以及 NQO1 含有量，
上调 Ogg1 表达。停药后第 3 天 DNA修复接近正常水平，8-OHdG 含有量接近正常水平。结论 Vog 可能引起氧化应
激，导致 DNA损伤。Vog同时上调 Ogg1 表达，为抗氧化防御状态和 DNA修复系统的代偿性调节。
关键词:12β-羟基藜芦酰棋盘花胺;DNA损伤;氧化应激;DNA修复
中图分类号:Ｒ966 文献标志码:A 文章编号:1001-1528(2016)08-1668-05
doi:10. 3969 / j． issn． 1001-1528. 2016. 08. 002
DNA damage of 12β-hydroxylveratroylzygadenine to cerebellum and cerebral
cortex of mice
GUO Jing-gong1， LI Lin2， LIU Ying-hua3， WANG Jiang-ying2， LI Sha-sha2， SHEN Shan2，
WEI Xiao-li3， CONG Yue2* ， WANG Tian-xiao3*
(1． School of Life Science，Henan University，Kaifeng 475004，China;2． Institute of Pharmacy，Pharmaceutical College，Henan University，Kaifeng
475004，China;3． Institute of Chinese Materia Medica，Pharmaceutical College，Henan University，Kaifeng 475004，China)
ABSTＲACT:AIM To investigate DNA damage of 12β-hydroxylveratroylzygadenine (Vog)to mouse cerebellum
8661
2016 年 8 月
第 38 卷 第 8 期
中 成 药
Chinese Traditional Patent Medicine
August 2016
Vol． 38 No． 8
and cerebral cortex． METHODS One hundred and thirty-two male mice were randomly divided into the control
group，Vog high-(2. 50 μmol /kg)and Vog low-dose groups (0. 25 μmol /kg)． Comet assay was used to detect
DNA damage and repair of mouse cerebellum and cerebral cortex． Their levels of 8-hydroxy- deoxyguanosine (8-
OHdG)and quinone oxidoreductase (NQO1)were determined by enzyme-linked immunosorbent assay． The col-
orimetry was applied to measuring reactive oxygen species (ＲOS)，methane dicarboxylic aldehyde (MDA) ，nitric
oxide (NO) ，total superoxide dismutase (T-SOD)and glutathione peroxidase (GSH-Px)． ＲT-PCＲ was performed
to examine the levels of 8-hydroxyl-guanine DNA glycosylase (Ogg1)and hemeoxygenase-1 (Ho-1)mＲNA．
ＲESULTS Vog could significantly increase the levels of MDA，ＲOS，NO and 8-OHdG;reduce NQO1 level and
the vitality of GSH-Px and T-SOD;and increase Ogg1 mＲNA expressions in mouse cerebellum and cerebral cortex．
Meanwhile，DNA damage was repaired and the content of 8-OHdG was restored close to the normal level on the
third day after Vog withdrawn． CONCLUSION Vog may cause oxidative stress and consequently lead to DNA
damage;at the same time it also raises the expression of Ogg1 mＲNA as a compensatory adjustment to the antioxi-
dant defense status and DNA repair systems．
KEY WOＲDS:12β-hydroxylveratroylzygadenine;DNA damage;oxidative stress;DNA repair
神经细胞 DNA 损伤是神经毒性研究领域的一
个重要方向。神经细胞 DNA损伤因素有自身因素、
物理因素和化学因素，均导致体内 DNA结构改变。
氧化应激是组织细胞 DNA损伤的重要因素之一［1］。
当 DNA损伤发生时，细胞通过一系列应答反应，
如细胞周期停滞、DNA 修复、细胞凋亡等，以维
持基因组的稳定性。然而脑组织 DNA修复能力低，
所以 DNA修复系统缺陷导致 DNA损伤的积累，最
终导致神经变性即神经毒性［2-5］。藜芦为百合科藜
芦 (Veratrum nigrum L．)植物，其根和根茎入药，
味苦，辛，性寒，大毒，具有催吐、袪风痰、杀虫
疗疮的功效，治疗中风、癫痫、疥癣秃疮、喉痹
症、痰涎涌盛、高血压等疾病［6］。前期研究证实
藜芦生物碱是藜芦引起神经 DNA 损伤的主要毒性
成分［7］。12β-羟基藜芦酰棋盘花胺 (12β-hydroxyl-
veratroylzygadenine，Vog)是从藜芦中提取分离的
一种甾体生物碱类成分［8］。研究表明 Vog 能显著
引起小鼠小脑和大脑皮层的 DNA 损伤，并呈剂量
依赖性［9］。但目前关于 Vog 对小鼠小脑和大脑皮
层的 DNA损伤与修复效应的文献报道较少。本研
究以雄性昆明种小鼠为研究对象，从氧化应激角
度，观察 Vog 对小鼠小脑和大脑皮层 DNA 损伤的
影响，以 Ogg1 和 Ho-1 的 mＲNA 表达水平来评价
DNA修复活性和氧化应激防御状态。将有助于揭
示其神经毒性的作用机理，对藜芦的减毒和毒效关
系研究具有重要意义。
1 材料与方法
1. 1 实验动物 健康雄性昆明种小鼠及普通饲料
均购于郑州大学实验动物中心，小鼠体质量 22 ～
25 g，SPF级，许可证号:SCXK (豫)2010-0002。
1. 2 药物与试剂 Vog的纯度 ≥ 98%，由本实验
室制备［8］，分子式为 C36H51NO11，相对分子质量为
673. 346 2。8-羟基脱氧鸟苷 (8-OHdG)检测试剂
盒购于上海西唐生物科技有限公司。丙二醛
(MDA)、谷胱甘肽过氧化物酶 (GSH-Px)、总超
氧化物歧化酶 (T-SOD)、活性氧族 (ＲOS)、一氧
化氮 (NO)及醌氧化还原酶 (NQO1)检测试剂
盒均购于南京建成生物工程研究所。8-羟基鸟嘌呤
DNA糖苷酶 (Ogg1)和血红素加氧酶-1 (Ho-1)
ＲT-PCＲ试剂盒购于北京全式金生物公司。
1. 3 分组及给药 取雄性昆明种小鼠 132 只，普
通饲料适应性喂养 1 周后，随机分为空白组 (52
只)、Vog低剂量组 (0. 25 μmol /kg，28 只)、Vog
高剂量组 (2. 50 μmol /kg，52 只)。每大组根据测
试生化指标数，空白组分为 13 组，低剂量组分为
7 组，高剂量组分为 13 组，每组 4 只。Vog 用
0. 05%二甲基亚砜 (DMSO)双蒸水溶解，灌胃给
药，连续给药 7 d;空白组灌胃给予等体积 0. 05%
DMSO 双蒸水。所有小鼠实验期间自由进食、
饮水。
1. 4 小鼠小脑和大脑皮层 DNA损伤修复 分别在
末次给药后 1 h、停药第 1 天、停药第 3 天、停药
第 7 天，断头取小鼠小脑和大脑皮层。采用彗星实
验，检测 DNA损伤修复情况，具体实验方法参照
文献［7，10］。
1. 5 小鼠尿液中 8-OHdG 含有量的检测 小鼠放
入代谢笼，分别在末次给药后 1 h、停药第 1 天、
停药第 3 天、停药第 7 天，收集 16 h 尿液 (空腹
9661
2016 年 8 月
第 38 卷 第 8 期
中 成 药
Chinese Traditional Patent Medicine
August 2016
Vol． 38 No． 8
状态)，3 000 r /min离心 20 min。取上清液，按照
试剂盒说明进行处理，以 450 nm波长测其吸光度，
计算其 8-OHdG的含有量。
1. 6 小鼠小脑及大脑皮层标本采集 于末次给药
后 1 h，断头取小脑和大脑皮层组织，按质
量 (g) ∶ 体积 (mL) = 1 ∶ 9 的比例加入生理盐
水，冰水浴条件下匀浆，3 000 r /min 离心 15 min，
取上清液，严格按照试剂盒说明，测定小脑和大脑
皮层组织的 MDA、NO、ＲOS、NQO1、GSH-Px、T-
SOD活性等生化指标。
1. 7 小鼠小脑及大脑皮层 Ogg1 和 Ho-1 mＲNA 水
平检测 于末次给药后 1 h，取小鼠大脑皮层和小
脑组织 50 ～ 100 mg 剪碎，Trizol 法提取总 ＲNA，
然后采用 EasyScript Two-Step ＲT-PCＲ SuperMix 法
进行逆转录和 PCＲ，所得产物用含终质量浓度
1 μg /mL溴乙啶的 1. 0%琼脂糖凝胶做电泳检测，
用凝胶成像分析系统检测结果，并用 GelAnalyzer
2010 分析软件分析结果。
1. 8 统计学处理 所有数据采用 SPSS 17. 0 应用
软件进行统计学分析。数据均以 x ± s 表示，采用
单因素方差分析，判断总体显著性差异，组间比较
采用 t检验方法，P ＜ 0. 05 具有统计学差异。
2 结果
2. 1 Vog引起小鼠小脑和大脑皮层 DNA 损伤及自
身修复 如图 1 所示，Vog高剂量组显著引起小鼠
小脑和大脑皮层 DNA损伤 (P ＜ 0. 01);高剂量组
在停药第 1 天仍可以显著引起小鼠小脑和大脑皮层
DNA损伤 (P ＜ 0. 01)，而在停药后的第 3、7 天，
Vog引起的小脑和大脑皮层 DNA 损伤不显著，即
修复接近正常水平，与空白对照组比较无差异
(P ＞ 0. 05)。
注:与空白组比较，＊＊P ＜ 0. 01
图 1 Vog对小鼠小脑和大脑皮层 DNA损伤的影响 (x ±
s，n =4)
Fig. 1 Effects of Vog on brain cells DNA in cerebellum
and cerebral cortex of mice (x ± s，n =4)
2. 2 Vog对小鼠尿液中 8-OHdG含有量的影响 如
图 2A所示，与空白组比较，Vog低、高剂量组小鼠
尿液中 8-OHdG含有量显著升高 (P ＜ 0. 01)。如图
2B所示，Vog 高剂量组在停药第 1 天，8-OHdG 含
有量仍较高，与空白组比较，有显著性差异 (P ＜
0. 01)，而在停药第 3 天，8-OHdG 含有量接近正常
水平，与空白对照组比较无差异 (P !0. 05)。
注:与空白组比较，＊＊P ＜ 0. 01
图 2 Vog对小鼠尿液中 8-OHdG的影响 (x ± s，n =4)
Fig. 2 Effects of Vog on 8-OHdG concentrations in urine of mice (x ± s，n =4)
2. 3 Vog 对小鼠小脑和大脑皮层 MDA、NO、
ＲOS、GSH-Px、T-SOD、NQO1 生化指标的影响
与空白组比较，Vog低、高剂量组小鼠小脑和大脑
皮层的 MDA和 NO含有量显著升高，GSH-Px 活力
显著降低 (P ＜ 0. 05，P ＜ 0. 01)。Vog 高剂量组小
鼠小脑和大脑皮层 ＲOS 含有量显著升高而 T-SOD
活力显著降低 (P ＜ 0. 05，P ＜ 0. 01)。Vog 低、高
剂量组小鼠小脑和高剂量组大脑皮层的 NQO1 含有
量显著降低 (P ＜ 0. 05，P ＜ 0. 01)。见图 3。
0761
2016 年 8 月
第 38 卷 第 8 期
中 成 药
Chinese Traditional Patent Medicine
August 2016
Vol． 38 No． 8
注:与空白组比较，* P ＜ 0. 05，＊＊P ＜ 0. 01
图 3 Vog对小鼠小脑和大脑皮层 MDA、NO、ＲOS、GSH-Px、T-SOD、NQO1 的影响 (x ± s，n =4)
Fig. 3 Effects of Vog administration on MDA，NO，ＲOS，GSH-Px，T-SOD，NQO1 in cerebellum and cerebral
cortex of mice (x ± s，n =4)
2. 4 Vog对小鼠小脑和大脑皮层 Ho-1 和 Ogg1 mＲ-
NA表达的影响 ＲT-PCＲ 结果显示，与空白组比
较，Vog 高剂量组小鼠小脑和大脑皮层中 Ogg1
mＲNA表达增加，有显著性差异 (P ＜ 0. 05，P ＜
0. 01)，而 Vog 高剂量组小鼠小脑和大脑皮层中
Ho-1 的 mＲNA表达有增加趋势，但没有统计学差
异 (P !0. 05)，见图 4。
3 讨论
氧化应激是组织细胞 DNA 损伤的重要因素之
一，中枢神经细胞是极为活跃的细胞，神经细胞膜
过多的多不饱和脂肪酸和低氧防御系统使得脑组织
易于受到氧化损伤。毒性药物主要通过引起氧化应
激反应损伤神经细胞 DNA，导致 DNA 碱基烷基
化、碱基脱落、断裂、交联。细胞具有一整套抗氧
化防御机制和 DNA 修复系统以抵制自由基的损伤
作用和处理未被清除的自由基。ＲOS 和 NO是脑组
织氧化应激的重要源头，并容易发生细胞膜脂质过
氧化，产生小分子 MDA，这些均可对 DNA 造成损
伤，而机体的抗氧化酶体系包括 GSH-Px、T-SOD、
NQO1 等可以清除这些自由基和过氧化物。
前期研究发现 Vog高、低剂量均引起小鼠大脑
皮层和小脑 DNA 的显著性损伤［9］。所以本实验从
氧化应激角度研究 Vog引起小鼠大脑皮层和小脑组
织 DNA损伤效应。研究结果显示，Vog 引起小鼠
大脑皮层和小脑 ＲOS、NO、MDA 水平显著升高，
注:与空白组比较，* P ＜ 0. 05，＊＊P ＜ 0. 01
图 4 Vog对小鼠小脑和大脑皮层 Ogg1 和 Ho-1 mＲNA
表达的影响 (x ± s，n =4)
Fig. 4 Ogg1 and Ho-1 expressions in mice cerebral cortex
and cerebellum after Vog administration (x ± s，
n =4)
NQO1 水平、GSH-Px、T-SOD 活力显著降低;此
外，小鼠尿液中 DNA 氧化损伤的分子标志物 8-
OHdG含有量也显著升高。由此推测，Vog 可通过
引起小鼠脑组织氧化应激而导致 DNA损伤。
此外，研究发现 Vog引起小鼠大脑皮层和小脑
1761
2016 年 8 月
第 38 卷 第 8 期
中 成 药
Chinese Traditional Patent Medicine
August 2016
Vol． 38 No． 8
的 DNA 损伤在停药后第 3 天可以修复至接近正常
水平。8-OHdG是公认的内源性及外源因素对 DNA
氧化损伤的生物标志物，8-OHdG 导致 DNA 链碱
基配对颠换，该突变与肿瘤发生发展及某些疾病有
密切关系［11-12］，在停药后第 3 天开始，8-OHdG 含
有量接近正常水平。这些结果表明脑细胞具有
DNA损伤的自动修复能力。我们同时检测了 Vog
对具有碱基切除修复能力 OGG1 及具有抗氧化防御
作用 HO-1 的影响。一般认为 OGG1 的表达主要受
氧化应激的调节，OGG1 的碱基切除修复能力是化
学致癌物质或环境中有害物质引起细胞内氧化应激
的又一生物分子标志物［13］，其在体内特异识别 8-
OHdG并将其切除修复。HO-1 可通过减少促氧化
物质水平及增加抗氧化物质含有量来发挥抗氧化作
用，从而提高机体的抗氧化防御状态。HO-1 的诱
导被认为能在各种氧化应激状态下参与组织细胞的
抗氧化应激损伤，对机体起到保护作用［14］。研究
结果显示，Vog可增加小鼠大脑和小脑皮层组织的
Ogg1 和 Ho-1 的 mＲNA 水平。Ho-1 上调表明脑组
织增加了对抗 Vog引起氧化应激的抗氧化能力，同
时 Ogg1 上调提示脑组织增强了 DNA 修复能力，
以上这些是脑细胞抗氧化防御状态和 DNA 修复系
统的代偿性调节。
综上，Vog可通过引起小鼠脑组织的氧化应激
而导致 DNA损伤，这种 DNA损伤可通过自身防御
系统得到部分修复，但是 Vog 对小鼠脑组织 DNA
损伤作用仍不可忽视，因为化学物质引起的 DNA
损伤及修复频率的增加，也会增加致突变和致癌的
可能性［15］。
参考文献:
［1］ Deng X L，Vidaruben L，Englander E W． Accumulation of oxi-
dative DNA damage in brain mitochondria in mouse model of he-
reditary ferritinopathy［J］． Neurosci Lett，2010，479 (1):
44-48．
［2］ Barzilai A，Biton S，Shiloh Y． The role of the DNA damage re-
sponse in neuronal development，organization and maintenance
［J］． DNA Ｒepair，2008，7(7) :1010-1027．
［3］ Morio T，Kim H． Ku，Artemis，and ataxia-telangiectasia-muta-
ted:signalling networks in DNA damage［J］． Int J Biochem Cell
Biol，2008，40(4) :598-603．
［4］ Brasnjevic I，Hof P Ｒ，Steinbusch H W M，et al． Accumula-
tion of nuclear DNA damage or neuron loss:Molecular basis for
a new approach to understanding selective neuronal vulnerability
in neuro degenerative diseases［J］． DNA Ｒepair，2008，7(7) :
1087-1097．
［5］ 王娅杰，孙 华，刘耕陶，等． p53 在 DNA损伤反应中的研
究进展［J］． 药学学报，2011，46(12):1413-1419．
［6］ 毛晓峰，史志诚，王亚洲． 我国藜芦属植物研究进展［J］．
动物毒物学，2003，18(1，2):17-21．
［7］ 丛 悦，张亚宏，郭 磊，等． 黒紫藜芦对小鼠小脑和大脑
皮层细胞 DNA 损伤研究［J］． 中成药，2011，33(7):
1234-1236．
［8］ Cong Y，Wang J H，Wang Ｒ，et al． A study on the chemical
constituents of Veratrum nigrum L． processed by rice vinegar
［J］． J Asian Nat Prod Ｒes，2008，10(7) :619-624．
［9］ Cong Y，Guo J G，Tang Z，et al． Identification of in vitro and
in vivo metabolites of 12β-hydroxylveratroylzygadenine associat-
ed with neurotoxicity by using HPLC-MS /MS［J］． Chin Chem
Lett，2014，25(8) :1107-1111．
［10］ Cong Y，Guo L，Yang J Y，et al． Steroidal alkaloids from Vera-
trum japonicum with genotoxicity on brain cells DNA of cerebel-
lum and cerebral cortex in mice［J］． Planta Med，2007，73
(15) :1588-1591．
［11］ Shigenaga M K，Ames B N． Assays for 8-dydroxy-2’-deox-
yguanosine:a biomarker of in vivo oxidative DNA damage［J］．
Free Ｒadic Biol Med，1991，10(3，4) :211-216．
［12］ 陈志强，舒 融，骆传环． 木耳多糖的制备及辐射防护作用
试验研究［J］． 中华放射医学与防护杂志，2001，21(1):
40-47．
［13］ Ｒiis B，Ｒism L，Loft S，et al． OGG1 mＲNA expression and in-
cision activity in rats are higher in foetal tissue than in adult liv-
er tissue whiles 8-hydroxy-2’-deoxyguanosine levels are un-
changed［J］． DNA Ｒepair，2002，1(9) :709-717．
［14］ Bauer M，Bauer I． Heme oxygenase-1:redox regulation and
role in the hepatic response to oxidative stress［J］． Antioxid
Ｒedox Signa，2002，4(5) :749-758．
［15］ Kido Ｒ，Sato I，Tsuda S． Detection of in vivo DNA damage in-
duce by ethanol in multiple organs of pregnant mice using the al-
kaline single cell gel electrophoresis (comet assay) ［J］． J Vet
Med Sci，2006，68(1) :41-47．
2761
2016 年 8 月
第 38 卷 第 8 期
中 成 药
Chinese Traditional Patent Medicine
August 2016
Vol． 38 No． 8