全 文 ：工 艺 技 术
2014年第4期
Vol . 35 , No . 04 , 2014
响应面法优化毛叶藜芦环巴胺的
提取工艺
温 文1，薛 兵1，康静静1，刘崇波2，温辉梁1，*
（1.南昌大学食品科学与技术国家重点实验室，江西南昌 330047；
2.南昌航空大学环境与化学工程学院，江西南昌 330063）
摘 要：采用响应面法优化了从毛叶藜芦中提取环巴胺的条件。在单因素实验的基础上选取提取液料比，提取时间和
提取温度为随机因子，以环巴胺提取量为响应值，建立三因素三水平Box-Behnken中心组合设计，并建立数学模型对
响应值进行分析。结果表明，提取液料比、提取时间和提取温度对环巴胺的提取量都有极显著（p＜0.01）的影响，并确
定了最佳的提取工艺参数为：提取液料比9∶1（mL/g），提取时间10.0h，提取温度48.0℃。在此优化条件下，提取10.0g毛
叶藜芦得到环巴胺的理论量为9.38mg，实际提取量为9.19mg，相对误差为2.02%。
关键词：环巴胺，响应面法，优化
Optimization of cyclopamine extraction from Veratrum grandiflorum Loes
by response surface methodology
WEN Wen1，XUE Bing1，KANG Jing-jing1，LIU Chong-bo2，WEN Hui-liang1，*
（1.State Key Laboratory of Food Science and Technology，Nanchang University，Nanchang 330047，China；
2.School of Environment and Chemical Engineering，Nanchang Hangkong University，Nanchang 330063，China）
Abstract：Response surface methodology was used to optimize the extraction conditions of cyclopamine from
Veratrum grandiflorum. Based on single factor experiments，the liquid-to-material ratio extraction time，extraction
temperature were chosen as causal factors and the extraction of cyclopamine was chosen as response value
which was then analyzed by models. In this way，the three-factors-three-levels Box-Behnken central composition
experiments were designed. Results showed that liquid-to-material ratio，extraction time，extraction temperature
had significant effects（p＜0.01） on extraction of cyclopamine. Optimal conditions for achieving the high extraction
of cyclopamine were liquid-to-material ratio 9∶1（mL/mg），extraction time 10.0h，extraction temperature 48.0℃.
Under these optimized conditions，with 10.0g raw materials extraction get cyclopamine 9.38mg in the abstract，
the actual extraction of cyclopamine was 9.19mg，and the model prediction was worth 2.02 percent error.
Key words：cyclopamine；response surface methodology；optimization
中图分类号：TS201.1 文献标识码：B 文 章 编 号：1002-0306（2014）04-0219-04
收稿日期：2013－06－06 * 通讯联系人
作者简介：温文（1988-），男，硕士研究生，研究方向：食品科学。
基金项目：国家自然科学基金资助项目（21264011，20961007）。
藜芦为百合科植物，为有毒中药，世界上约有40
种，据《中国植物志》记载，我国有其中13种和1个变
种[1]。我国盛产藜芦，作为中药用于中风痰壅，癫痫、
喉痹不通，及疥癣和恶疮[2-4]。而通过长期研究，Keeler
等 [ 5]在羊群食用的藜芦属植物山藜芦（Veratrum
californicum）中找到了一种甾体类生物碱环巴胺。直
到90年代中期，环巴胺被发现是一种Hedgehog信号
通路的抑制剂[6]，Hedgehog信号通路的突变与多种肿
瘤的发病有关联，人们发现环巴胺对多种肿瘤如母
髓质细胞瘤、基底细胞癌、神经胶质瘤、横纹肌肉瘤、
小细胞肺癌、消化道肿瘤、乳腺癌、胰腺癌和前列
腺癌等均有显著的抑制活性[7]，对银屑病也有疗效[8]。
因此，以环巴胺开发新型抗癌药物在国内外已经成
为研究热点，环巴胺已经成为新药开发的重要研究
目标。
目前环巴胺的来源主要有三种途径，一是从植
物中提取[9]，虽然含量较低，但是藜芦属植物在我国
含量丰富，提取的方法经济快速；二是全合成，全合
成的过程复杂且立体选择性差，产率很低，仅有1%
左右[10]；三是半合成，通过对具有类似环巴胺结构的
化合物进行化学转化或者结构改造。张卫东[11]对还
原介芬胺得到环巴胺的方法进行了改进，提高了产
率，但是没有避免使用水合肼和高温（200℃），条件
苛刻不适合大量反应，环巴胺的大量获得还是受到
了限制。
为了增加环巴胺的抗肿瘤活性，人们对环巴胺
进行了一系列衍生，包括扩环，环巴胺的3-位羟基氧
化[12]，N-原子烷基化 [13]细胞实验发现部分衍生物对
219
DOI:10.13386/j.issn1002-0306.2014.04.031
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Shh阻断作用有显著增加。Alfredo C C[14]将扩环后化
合物的3-位羟基氧化后再衍生出系列产品，然后将A
环内的双键还原得到的新化合物的活性是还原前的
10~30倍；同样对环巴胺进行相同处理达到的环巴胺
衍生物活性是环巴胺的20倍。
本文对毛叶藜芦中的环巴胺进行提取优化，并
在单因素实验的基础上进行响应面法对影响环巴
胺提取量的主要因素进行分析，从而确定最优提取
工艺。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
毛叶藜芦 四川荷花池中药材专业批发市场肖
草药中药行，产地四川；甲醇 分析纯，国药集团化
学试剂有限公司；无水碳酸钠 分析纯，天津市永大
化学试剂有限公司；三氟乙酸 分析纯，天津市大茂
化学试剂厂；乙腈 色谱纯，国药集团化学试剂有限
公司。
JJ-1型磁力搅拌器 常州国华电器有限公司；
RE-52AA型旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂；JJ-
200型电子天平 常熟双杰测试仪器厂；岛津LC-
10AT型高效液相色谱仪 日本岛津制造所。
1.2 实验方法
1.2.1 环巴胺高效液相色谱检测条件 运用高效液
相色谱对提取出来的环巴胺进行检测，其最优条件为：
色谱柱：WATO-54275 waters C18柱（250mm×4.6mm，
5μm）；流动相：0.01%三氟乙酸（A）和乙腈（B），梯度
洗脱：0~16min（90%~65% A）；分析时长：16min；流
速：1.0mL/min；检测波长：215nm；柱温：25℃。
1.2.2 环巴胺标准曲线的绘制 配制浓度分别为：
0.125、0.25、0.5、1、2mg/mL的环巴胺标准品，利用高
效液相色谱测定紫外吸收。
1.2.3 环巴胺提取量的计算 由高效液相色谱测得
的峰面积根据标准曲线得出环巴胺浓度后，环巴胺
含量按下式计算：
环巴胺含量（mg）=测量浓度（mg/mL）×样品体积
（mL）
1.2.4 单因素实验设计 将10g毛叶藜芦粉碎，以甲
醇为提取溶剂，在液料比4 ∶1、6 ∶1、8 ∶1、10 ∶1、12 ∶1、
14∶1（mL/g），提取时间2、4、6、8、10、12h，提取温度25、
30、35、40、45、50℃的条件下进行提取，再将提取液
用旋转蒸发仪旋干，得到粗提物后用甲醇将粗提物
定容于10mL容量瓶中，并用高效液相色谱进行检测
分析。
1.2.5 响应面实验设计 在单因素实验的基础上，
用Deign-Expert软件进行响应面法的提取优化设计，
并对结果进行分析[15]。以环巴胺提取量为指标，采用
3因素3水平的Box-Behnken的中心设计组合[16]，对液
料比、提取时间、提取温度三个因素进行优化。因素
水平表见表1。
1.2.6 数据处理 本实验用Deign-Expert软件进行
响应面法的提取结果进行分析，得出各因素对环巴
胺提取的影响程度以及最优的提取工艺参数。
2 结果与讨论
2.1 环巴胺标准曲线
环巴胺浓度为x，各个浓度紫外吸收峰面积为y，
得到标准曲线为：y=0.7814x+0.0007，R2=0.9997（图1）。
2.2 环巴胺提取的单因素实验
2.2.1 提取液料比对环巴胺提取量的影响 固定提
取温度为30℃，提取时间为10h对环巴胺提取量进行
分析。从图2中可以看出，随着液料比的增大，环巴胺
的提取量逐步增加，在液料比为8∶1时达到最大，再
增加液料比，环巴胺的提取量变小。在最初时，随着
液料比变大，环巴胺在甲醇中的溶解量逐步增大，而
在液料比达到8∶1之后，在提取时毛叶藜芦中同属于
生物碱的藜芦胺与环巴胺呈现竞争关系，在此液料
比之后藜芦胺竞争性更强，使得环巴胺提取量变少，
故选择提取液料比为8∶1。
2.2.2 提取时间对环巴胺提取量的影响 固定提取
液料比为8∶1，提取温度为30℃对环巴胺提取量进行
分析。从图3可以看出，随着提取时间的加长，环巴胺
的提取量增加，在10h时达到最大，但是之后随之减
因素
水平
-1 0 1
A 提取液料比（mL/g） 6∶1 8∶1 10∶1
B 提取时间（h） 8 10 12
C 提取温度（℃） 40 45 50
表1 Box-Behnken的中心组合因素水平表
Table 1 Factors and levels of Box-Behnken central component
experiments design
图1 环巴胺标准曲线
Fig.1 Cyclopamine standard curve
2.0
1.5
1.0
0.5
0
峰
面
积
0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5
浓度（mg/mL）
图2 液料比对环巴胺提取量的影响
Fig.2 Effect of liquid-solid ratio on cyclopamine extraction
10
8
6
4
2
0
提
取
量
（
m
g）
4∶1 6∶1 8∶1 10∶1 12∶1 14∶1
液料比（mL/g）
220
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实验号 A B C Y 提取量（mg）
1 0 0 0 9.02
2 -1 0 1 7.13
3 0 0 0 9.33
4 0 0 0 8.94
5 0 -1 1 7.39
6 0 -1 -1 7.90
7 0 1 1 8.74
8 1 0 1 9.10
9 1 1 0 8.84
10 -1 1 0 7.01
11 -1 -1 0 6.92
12 -1 0 -1 7.52
13 0 1 -1 7.55
14 0 0 0 9.10
15 1 0 -1 7.66
16 1 -1 0 7.71
17 0 0 0 9.08
表2 Box-Behnken实验设计及其结果
Table 2 Arrangement and results of the three-variable/three-
level central composite design
方差来源 平方和 自由度 均方 F值 p值 显著性
模型 11.80 9 1.31 65.19 ＜0.0001 **
A 2.80 1 2.80 139.04 ＜0.0001 **
B 0.62 1 0.62 30.63 0.0009 **
C 0.37 1 0.37 18.60 0.0035 **
AB 0.27 1 0.27 13.44 0.0080 **
AC 0.84 1 0.84 41.62 0.0003 **
BC 0.72 1 0.72 35.92 0.0005 **
A2 2.42 1 2.42 120.36 ＜0.0001 **
B2 2.16 1 2.16 107.24 ＜0.0001 **
C2 0.98 1 0.98 48.89 0.0002 **
残差 0.14 7 0.020
失拟项 0.056 3 0.019 0.87 0.5258
净误差 0.085 4 0.021
总离差 11.94 16
表3 二次多项模型方差分析表
Table 3 Variance analysis for the fitted quadratic
polynomial model
注：*为显著（p＜0.05），**为极显著（p＜0.01）。
小，是因为提取时间过长，使得环巴胺分解而降低得
率，故选择提取时间为10h。
2.2.3 提取温度对环巴胺提取量的影响 固定提取
液料比为8∶1，提取时间为10h对环巴胺提取量进行
分析。从图4中可以看出，随着温度的提高，环巴胺的
提取量也在增大，这说明环巴胺在溶剂中的溶解性
增大，但考虑到环巴胺在高温下容易变质，而且提取
量上升幅度已经很小，从节能和防止变质的基础考
虑，最佳提取温度为45℃。
2.3 响应面法优化环巴胺的提取条件
实验设计共有17个点，其中12个析因点，5个中
心点。实验设计方案和结果见表2。
对响应面结果进行多元回归拟合，从而得到响
应回归方程为：
Y=9.09+0.59A+0.28B+0.22C+0.26AB+0.46AC+
0.43BC-0.76A2-0.72B2-0.48C2。
回归统计分析结果见表3。从表3中可以看出，以
环巴胺提取量为响应值时，模型p＜0.0001，表明该二
次方程模型极显著。同时失拟项p=0.5258＞0.1，不显
著，模型拟合度较好。该分析统计结果说明实验方法
是可靠的，能很好的描述实验结果，用该方程代替真
实的实验点进行分析是可行的。
各因素对环巴胺提取率的影响程度大小依次
为：A（提取液料比）（p＜0.0001，极显著）＞B（提取时
间）（p=0.0009，极显著）＞C（提取温度）（p=0.0035，极
显著）。由方差分析可知，AB、BC、AC之间交互作用
都极显著，即提取液料比与提取时间、提取液料比与
提取温度、提取温度与提取时间的交互作用对环巴胺
提取量都有极显著的影响，绘制响应曲面图，如图5~
图7所示。
由图5可知，液料比（A）与时间（B）的等高线呈
椭圆形，响应面走势陡峭，说明一次项A、B对Y有极
显著的影响。环巴胺的提取量随着提取液料比增大
和提取时间加长先增大后减少，且提取量在提取液
料比约为8.5∶1提取时间约为10.5h时候达到最大；同
理，由图6可知，一次项A、C对Y有极显著影响，提取
量在提取料液比约为8.5∶1提取温度约为45℃时达到
最大；由图7可知，一次项B、C对Y有极显著的影响，
图3 提取时间对环巴胺提取量的影响
Fig.3 Effect of time on cyclopamine extraction
10
8
6
4
2
0
提
取
量
（
m
g）
0 2 4 6 8 10 12
提取时间（h）
图4 提取温度对环巴胺提取量的影响
Fig.4 Effect of time on cyclopamine extraction
10
8
6
4
2
0
提
取
量
（
m
g）
20 25 30 35 40 45 50 55
提取温度（℃）
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图5 提取液料比与提取时间交互作用对环巴胺提取量影响
的响应面图
Fig.5 Response surface graph of effct of liquid-to-material ratio
and extraction time interaction on the cyclopamine extraction
9.4
Y：
提
取
量
（
m
g）
8.00B：时间（h）
8.775
8.15
7.526
6.9
9.00
10.00
11.00
12.00
6.00
7.00
8.00
9.00
10.00
A：料液比（mL/g）
图6 提取液料比与提取温度交互作用对环巴胺提取量影响
的响应面图
Fig.6 Response surface graph of effct of liquid-to-material
ratio and extraction temperature interaction on the
cyclopamine extraction
9.4
Y：
提
取
量
（
m
g）
40.00C：温度（℃） 6.00
7.00
8.00
9.00
10.00
A：料液比（mL/g）
8.8
8.2
7.6
7.6
42.50
47.50
45.00
50.00
图7 提取时间与提取温度交互作用对环巴胺提取量影响的
响应面图
Fig.7 Response surface graph of effct of extraction time and
extraction temperature interaction on the cyclopamine extraction
Y：
提
取
量
（
m
g）
40.00C：温度（℃） 8.00
9.00
10.00
11.00
12.00
B：时间（h）
9.4
42.50
47.50
45.00
50.00
8.875
8.35
7.825
7.3
提取量在提取时间约为10.5h提取温度约为45℃时达
到最大。
由软件分析得出优化的参数为：提取液料比为
9.11∶1（mL/g）；提取时间为10.31h；提取温度为48.36℃，
此时环巴胺提取量为9.38mg。为了检验响应面法
优化环巴胺提取工艺的可靠性，进行验证实验，考
虑到实际操作性，将优化后的工艺参数调整为料液比
9∶1（mL/g）、提取时间为10.0h、提取温度为48.0℃。进
行三次平行实验，环巴胺平均提取量为9.19mg，相对
误差为2.02%，说明响应面法得到的模型参数准确
可靠。
3 结论
本实验通过响应面法优化了毛叶藜芦中环巴胺
的提取工艺。由方差分析得知，各因素对环巴胺的提
取量有极显著的影响（p＜0.01），影响次序为：A（提取
料液比）＞B（提取时间）＞C（提取温度）。最优工艺参
数调整为料液比9∶1（mL/g）、提取时间为10.0h、提取
温度为48.0℃，环巴胺平均提取量为9.19mg，与理论
值9.38mg相差2.02%，两者吻合较好，说明响应面法
得到的模型参数准确可靠。
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