全 文 ：JournalofTropicalMedicineVol.7No.10Oct.2007
·基础研究论著·[文章编号]1672-3619(2007)10-0952-04
短穗鱼尾葵及长穗鱼尾葵花粉过敏原的分析、鉴定与纯化
刘晓宇 1,肖淑英 1,刘志刚 1*,姚敏 2,孟光 2
(1.深圳大学过敏反应与免疫学研究所,深圳 518060;
2.海南省海口市人民医院耳鼻咽喉科,海口 570208)
【摘要】 目的 对长穗鱼尾葵和短穗鱼尾葵花粉变应原蛋白进行分析、鉴定与纯化。方法 提取这两种花
粉的粗提液,通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离粗提液蛋白质组分并测定其分子量。
收集过敏病人血清,采用免疫印迹(Western-bloting)法鉴定其变应原成分,通过离子交换层析对花粉变应原进
行初步纯化和免疫印迹鉴定。结果 长穗鱼尾葵花粉有 30余条蛋白带,其中主要条带有 18条,12000和
14000Mr为长穗鱼尾葵花粉特异性变应原;短穗鱼尾葵花粉有 30余条蛋白带,其中主要条带有 9条,26000、
12000和 14000Mr为短穗鱼尾葵花粉特异性变应原,其中 14000Mr为主要变应原;通过离子交换层析方法
纯化出长穗鱼尾葵花粉相对分子质量为 12000和 14000的变应原主要分布在Ⅱ峰中,短穗鱼尾葵花粉相对分
子质量为 14000的主要变应原分布在Ⅴ峰和Ⅵ峰中。结论 对长穗和短穗鱼尾葵花粉变应原进行了初步的分
离、鉴定和纯化,为临床鱼尾葵花粉变态反应疾病的诊断和治疗奠定了基础。
【关键词】 短穗鱼尾葵花粉;长穗鱼尾葵;变应原;离子交换层析
中图分类号:R392.8 文献标识码:A
CharacterizationoftheAntigenicPropertiesofPolenAlergensin
CarvotamitisandCaryotaochlandra
LIUXiao-yu1,XIAOShu-ying1,LIUZhi-gang1*,YAOMin2,MENGGuang2
(1.AlergyandImmunologyInstitute,ShenzhenUniversity,Shenzhen518060;
2.Dept.ofOtorhinolaryngology,PeoplesHospitalofHaikouCity,Haikou570208,China)
【Abstract】 Objective TocharacterizeandpurifythepolenalergensisolatedfromCarvotamitisandCaryota
ochlandra.Method PolenextractsfromCarvotamitisandCaryotaochlandrawerepreparedandanalyzedbySDS-
PAGEandproteinsbandswerevisualizedbystainingthegelwithCoomassisblue.Antigenicpropertiesoftheseparated
proteinswereanalyzedbyimmuno-bloting.Ion-exchangechromatographywithDE-52wasusedforthepurificationof
theantigens.ThepurifiedproductswerecharacterizedbyWestern-bloting.Result ForthepolenextractofCaryota
ochlandra,30proteinbandsweredetectedinSDS-PAGE.Twooftheseproteinbands,withamolecularweightof
12000Mrand14000Mr, showedimmunoreactivitywithIgEintheserafrompatientswithalergytopolenof
Caryotaochlandra.ForthepolenextractofCarvotamitis,30proteinbandsweredetectedinSDS-PAGE,andthree
oftheseproteinbands,withamolecularweightof12000,14000,and26000Mr,showedimmunoreactivitywith
IgEintheserafrompatientswithpolenalergyofCarvotamitis. The14000Mrproteinwasthemajoralergen.
Resultfromtheion-exchangechromatographyindicatedthatthetwopolenalergens(12000、14000Mr)fromCaryota
ochlandrawereelutedinthesecondpeak.ThemajorpolenalergenofCarvotamitiswaselutedintheforthandfifth
peak.Conclusion PolenalergensfromCarvotamitisandCaryotaochlandrawerepurifiedandcharacterized.Theresult
wilprovideabasisforthediagnosisandtreatmentofalergytothepolenalergensfromCarvotamitisandCaryota
ochlandra.
【Keywords】 Carvotamitispolen;Caryotaochlandrapolen;alergen;ion-exchangechromatography
基金项目:国家自然科学基金(No.30070702);广东省科技重点专项(No.2003A3080502);深圳市科技计划(No.200326);深圳大学校基金
(No.200528)。
作者简介:刘晓宇,男,深圳大学在读本科生,研究方向为花粉变应原的基础与应用研究。
*通讯作者:刘志刚,男,教授,博导,E-mail:lzg@szu.edu.cn
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热带医学杂志2007年10月第7卷第10期
变态反应性疾病(过敏性疾病)是临床上的常见病、多发
病,世界各国变态反应性疾病的总发病率高达10%～30%[1]。在
众多的过敏原中,花粉是一种重要的过敏原,它可引起“花粉
症”(枯草热)等疾病的发生及相应病症,如鼻粘膜、眼结膜和
支气管炎症,甚至哮喘发作。在我国,对花粉过敏的病人全国
至少有500～1000万,且近年来发病率有持续上升的趋势[2,3]。
短穗鱼尾葵,学名 CarvotamitisLour,别名酒椰子;长
穗鱼尾葵,学名 CaryotaochlandraHance,别名假桄榔、青
棕。它们都属于棕榈科鱼尾葵属,多年生常绿乔木,原产亚
洲热带、亚热带及大洋洲地区,我国广东、海南、广西、云南
等地均有分布,多作为行道树被广泛栽培。由于短穗鱼尾
葵和长穗鱼尾葵花期长,花粉量大,因此具有很大的过敏
潜能[4]。目前,国内外尚未见关于这两种花粉过敏原的研
究报道。本研究通过 SDS-PAGE、Western-bloting和离子交
换层析等方法对这两种花粉变应原进行分离、鉴定,为热
带花粉过敏的诊断及治疗提供资料。
1 材料与方法
1.1 材料
短穗鱼尾葵和长穗鱼尾葵花粉均采自海南海口市人
民医院;患者血清由海口市人民医院提供,所用的血清来
自于 10个对这两种花粉过敏的患者。所有患者也对一些
花粉及植物源性食物(如胡萝卜、花生或苹果等)过敏。
1.2 主要仪器和试剂
垂直电泳槽、转膜电泳槽(model1000/500)、凝胶成
像及分析系统为 VILBERLOURMAT公司产品;层析柱、快
速蛋白液相层析系统(FPLC)为 AmershamPharmacia公司
产品。丙烯酰胺(Acr)为 BBI公司产品;十二烷基硫酸钠
(SDS)为 BIO-RAD公司产品;亚甲基双丙烯酰胺(Bis)、过
硫酸铵(AP)、四甲基乙二胺(TEMED)、三羟甲基氨基甲烷
(Tris)、联苯二胺(DAB)为 AMRESCO公司产品;上样缓
冲体系、蛋白 Marker和预染蛋白 Marker为 MBIFermentas
公司产品;生物素标记的 IgE二抗、辣根过氧化物酶标记
的亲和素(链霉亲和素)为 Kirkegaard&PeryLaboratories公
司产品;硝酸纤维膜(NC膜)为 Gelmanlaboratory公司产
品;DEAE-CeluloseDE-52为 AmershamPharmacia公司产
品。其余均为国产分析纯试剂。
1.3 花粉粗提液的提取
取花粉于液氮中充分研磨,按 1∶3的比例用丙酮 4℃
浸泡去脂至上清澄清。去丙酮,干燥后称重,以 1∶20比例
加入 Coca′s液(氯化钠 5g,碳酸氢钠 2.75g,结晶酚 4g加
蒸馏水至 1000mL,pH8.2),搅拌提取 72h,静置 0.5h
后,上清对蒸馏水透析,冷冻干燥浓缩,均在 4℃进行。
1.4 花粉粗提液进行 SDS-PAGE
采用 SDS-PAGE体系分离粗提液中蛋白质组分并测定
分子量。分离胶12%、浓缩胶5%,考马斯亮蓝R-250染色液
染色,脱色后用凝胶成像及分析系统拍照并分析其分子量。
1.5 花粉粗变应原的免疫学特性鉴定
采用 Western-bloting方法对花粉变应原进行免疫学特
性鉴定,具体步骤如下:用 BIO-RAD转移槽将凝胶中的蛋白
条带转移至硝酸纤维膜上;用TBS洗涤硝酸纤维膜2次,每
次 5min;将膜用 1%BSA封闭液封闭 (4℃过夜);用含
0.05%吐温-20的 TBST洗膜 3次,每次 5min;加一抗(用
1%BSA-TBST进行 1∶9稀释),37℃孵育 2h;同上洗膜 3次
后加入1∶1000倍稀释的二抗-生物素,室温孵育 2h;同上洗
膜 3次后加入 1∶1000倍稀释的链酶亲和素-HRP,室温孵
育 2h;同上洗膜 5次,DAB(3,3′-二氨基联苯胺)显色,摄像
后分析其相对分子质量。
1.6 粗提液的离子交换层析与检测
花粉粗提液对 0.02mol/LTris-HCl(pH7.2)缓冲液透
析24h后,进行DEAE-CeluloseDE-52离子交换层析。具体
步骤如下:在 FPLC层析控制系统下,用 DEAE-CeluloseDE-
52离子交换层析柱,以 0.02mol/LpH7.2的 Tris-HCl缓冲
液充分平衡,透析后花粉粗提液经 0.45!m滤膜过滤后上
样,待穿透峰后的基线走平后,改用洗脱缓冲液(0.5mol/L
NaCl,0.02mol/LTris-HCl)进行线性离子梯度洗脱,流速 2
mL/min,时间80min,自动收集器收集各峰液。对 0.02mol/
LTris-HCl缓冲液(pH7.2)透析,冷冻干燥,干燥样品溶于少
量缓冲液中,调整样品终浓度为2mg/mL。对样品进行SDS-
PAGE及 Western-bloting分析,确定各峰收集液中蛋白的免
疫活性部分。
2 结果
2.1 花粉粗浸液的SDS-PAGE电泳
长穗鱼尾葵花粉主要有 30余条深浅不一的蛋白区带,
其中主带有 18条,在 10000～18000Mr和 23000～100000
Mr之间区带蛋白含量最丰富。短穗鱼尾葵花粉主要有 30余
条深浅不一的蛋白区带,其中主带有 10条,在 25000～66
000Mr之间区带蛋白含量最丰富(图 1)。
图 1花粉粗提液 SDS-PAGE图
Fig.1SDS-PAGEanalysisofpolenextract(Coomassiebriliant
bluestain)
M:Standardmolecularweightmarkers;1:SDS-PAGEanalysisof
Caryotaochlandrapolenextract;2:SDS-PAGEanalysisofCarvota
mitispolenextract.
M 1 2
116.0
66.2
45.0
35.0
25.0
18.4
14.4
Mr(×103)
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JournalofTropicalMedicineVol.7No.10Oct.2007
2.2 花粉特异性变应原鉴定
用过敏患者的阳性血清进行免疫印迹,对花粉粗浸液
中的变应原进行鉴定。
长穗鱼尾葵花粉提取液中可与过敏性病人血清 IgE
结合反应阳性的蛋白质相对分子质量分别为 12000和
14000,为主要变应原(图 2)。
短穗鱼尾葵花粉提取液中可与过敏性病人血清 IgE
结合反应阳性的蛋白质相对分子质量分别为 26000、12000
和 14000,其中 14000Mr为主要变应原(图 3)。
2.3 花粉变应原的纯化
2.3.1 花粉变应原的离子交换层析 用对 DE-52离子交
换层析缓冲液充分透析的花粉粗浸液上柱。长穗鱼尾葵主
要有 4个蛋白峰;短穗鱼尾葵主要有 6个蛋白峰(图 4,图
5)。
2.3.2 SDS-PAGE和 Western-bloting检测 分析表明,短
穗鱼尾葵花粉粗提液离子交换层析后蛋白主要分布在Ⅲ
峰、Ⅳ峰、Ⅴ峰和Ⅵ峰中(图 6),免疫印迹结果显示(图 7)
相对分子质量为 14000的主要变应原组分在第Ⅴ峰和第
Ⅵ峰。
长穗鱼尾葵花粉粗提液离子交换层析后蛋白主要分布
在Ⅰ峰、Ⅱ峰中(图 8),免疫印迹的结果显示(图 9)相对分
子质量为 14000和 12000的主要变应原组分在第Ⅱ峰中。
3 讨论
变态反应性疾病被世界卫生组织认为是当前世界性
的重大卫生学问题之一[5]。当致敏花粉被敏感个体吸入或
接触到的时候,会引发过敏性反应,导致“花粉症”(枯草
热)等疾病。花粉症是敏感个体对花粉的一种超敏反应。机
体首次接触花粉过敏原,体内产生 IgE抗体,结合于肥大
细胞和嗜碱性粒细胞,再次接触时,花粉过敏原与上述细
图 4 长穗鱼尾葵花粉粗提液离子交换层析图
Fig.4 ElutiongraphofpartialypurifiedCaryotaochlandra
polenextractappliedtoDE-52
mAU
600
500
400
300
200
100
0
0 50 100 150 200 250 300 350ml
Ⅰ峰 Ⅱ峰Ⅲ峰 Ⅳ峰
Manualrun3∶10_UV Manualrun3∶10_Logbook
图 5 短穗鱼尾葵花粉粗提液离子交换层析图
Fig.5 ElutiongraphofpartialypurifiedCarvotamitispolen
extractappliedtoDE-52
Ⅰ-Ⅱ峰 Ⅲ-Ⅳ峰
Manualrun9∶10_UV Manualrun9∶10_Cond Manualrun9∶10_Logbook
mAU
300
250
200
150
100
50
0
0 100 200 300 400 500 ml
图 2 长穗鱼尾葵花粉免疫印迹图谱
Fig.2 Western-blotingofCaryotaochlandrapolenextract
M:Standardmolecularweightmarkers;1-10:IgEimmunoblotsof
serafrom10Caryotaochlandrapolenalergicpatients(1-10).
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
170
130
95
55
43
11
17
26
34
72
Mr(×103)
图 3 短穗鱼尾葵花粉免疫印迹图谱
Fig.3 Western-blotingofCarvotamitispolenextract
M:Standardmolecularweightmarkers;1-10:IgEimmunoblotsofsera
from10Carvotamitispolenalergicpatients(1-10).
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
170
130
95
72
55
43
34
26
17
11
Mr(×103)
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热带医学杂志2007年10月第7卷第10期
图9 长穗鱼尾葵花粉粗提液离子交换层析后进行Western-bloting
Fig.9 Western-blotinganalysisoftheproductsoftheion-
exchangechromatographyofCaryotaochlandrapolenextract
M:Standardmolecularweightmarkers;1:Western-bloting
analysisofcolectedfractionsfrompeakⅡ.
图6 短穗鱼尾葵花粉粗提液离子交换层析后各峰液进行SDS-PAGE
Fig.6 SDS-PAGEanalysisoftheproductsoftheion-exchange
chromatographyofCarvotamitispolenextract(Coomassie
briliantbluestain)
M:Standardmolecularweightmarkers;1-6:SDS-PAGEanalysisof
colectedfractionsfrompeakⅥ-Ⅰ.
图7 短穗鱼尾葵花粉粗提液离子交换层析后进行Western-bloting
Fig.7 Western-blotinganalysisoftheproductsoftheion-
exchangechromatographyofCarvotamitispolenextract
M:Standardmolecularweightmarkers; 1:Western-blotinganalysis
ofcolectedfractionsfrompeakⅥ;
2:Western-blotinganalysisofcolectedfractionsfrompeakⅤ.
胞表面两个或两个以上的临近 IgE分子搭桥结合,导致肥
大细胞脱颗粒,释放生物活性介质,引起鼻粘膜、眼结膜和
支气管炎症,甚至哮喘发作。在西方国家,由花粉引起的过
敏症发病率高达 30%[1],因此国内外学者近年来加深了对
植物花粉过敏原的研究。由于空气中花粉飘散种类、数量
及季节布规律与其所处的地理位置有着密切的联系 [6-8],
因此目前各地研究者首先对当地致敏花粉进行缜密的调
查分析,然后进行抗原分析、纯化等工作,制备出具有本地
特色的主要致敏花粉变应原浸液,用于临床特异性诊断和
免疫治疗,并取得了一定的疗效[9,10]。
世界卫生组织 (WHO)以及世界著名的变应原公司
(如 ALK公司、默克公司)提供用于过敏性疾病诊断的变
应原目录中(约 400-500种),目前尚未有热带地区气传致
敏花粉变应原,同时也仅见热带地区气传致敏花粉的少量
研究报道。鱼尾葵作为行道树在我国南方尤其在海南广泛
分布。孟光等[4]在对海口地区热带植物花粉致敏性调查中
发现,鱼尾葵花粉阳性率为 53.2%(266/500),因此对其变
应原的研究显得尤为重要。
本研究通过对长穗鱼尾葵和短穗鱼尾葵花粉的传统
提取方法略加改进后提取这两种花粉的粗提液,然后进行
SDS-PAGE和免疫印迹,结果发现,12000和 14000Mr为
长穗鱼尾葵花粉特异性变应原,26000、12000和 14000
Mr为短穗鱼尾葵花粉特异性变应原,其中 14000Mr为主
要变应原。花粉粗提液经 DE-52离子交换层析后,长穗鱼
尾葵分离得到 4个峰,其中主要变应原 12000和 14000
Mr的蛋白主要在第Ⅱ峰中;短穗鱼尾葵分离得到 6个峰,
其中 14000Mr的主要变应原主要在第Ⅴ峰和第Ⅵ峰中。
本研究为鱼尾葵花粉过敏的诊断及脱敏治疗提供了实验
资料,也为鱼尾葵花粉变应原标准化的制定奠定了实验基
础。
M 1 2 3 4 5 6
图8 长穗鱼尾葵花粉粗提液离子交换层析后各峰液进行SDS-PAGE
Fig.8 SDS-PAGEanalysisoftheproductsoftheion-exchange
chromatographyofCaryotaochlandrapolenextract(Coomassie
briliantbluestain)
M:Standardmolecularweightmarkers;1:Caryotaochlandrapolen
extract;2-5:SDS-PAGEanalysisofcolectedfractionsfrompeakⅠ-Ⅳ.
M 1 2
55
11
17
26
34
Mr(×103)
M 1 2 3 4 5
72
55
43
34
26
17
11
Mr(×103)
M 1
72
55
43
34
26
17
11
Mr(×103)
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Mr(×103)
170
130
95
72
55
43
34
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[参 考 文 献]
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[9]
[10]
认为是迄今为止发现的因产尿素酶最多从而增加了体内
产氨的细菌。在肝硬化患者中,Hp感染率为 48%～60%[4]。
如果胃内大量感染 Hp,其产氨量将足以导致肝硬化患者
血氨升高[6-8],加上如果合并消化性溃疡或食管静脉曲张
破裂出血而大量应用强效抑酸剂导致胃内 pH降低,则更
可促使 Hp产生的氨从胃部吸收,从而使 Hp增高血氨的
作用更为明显。
3.2 培菲康对 Hp和血氨的独特作用
自 1998年 Coconnier[9]研究发现嗜酸乳杆菌 LB株在
活体中对 Hp的抑制作用后,多个关于微生态益生菌对 Hp
杀灭作用的研究,在动物或离体得到了有效的结果[1-3],更
有学者认为,嗜酸乳杆菌清除 Hp感染可以起到与目前常
规使用的二、三联药物相当的效果[10]。
在本实验中,益生菌治疗组 13C呼气值降低幅度稍低
于传统 Hp根治 3联组,但治疗后 13C呼气值明显降低,降
低的幅度明显比空白对照组高,提示益生菌可对 Hp有杀
灭或者抑制作用。益生菌治疗组治疗后血氨明显降低;血
氨降低幅度比传统 Hp3联法根治组、Hp阴性对照组以及
空白对照组大,进一步证实了益生菌在乙肝性肝硬化患者
体内通过抑制或杀灭 Hp、纠正肠道菌群失调、减少氨吸收
等多方面的综合降氨机制,使其在降低血氨上的效果更明
显。然而,比单纯比较疗效更有意义的是,益生菌对 Hp的
杀灭或者抑制作用避免了传统根治法大量联合使用抗菌
素而加剧肠道菌群紊乱的可能,为因顾虑该副作用而未能
对此类患者常规进行 Hp根治的现状提供了一种合理的处
理方法。在当前广泛使用广谱抗菌素带来越来越严重的社
会与经济副作用的情况下,这种绿色生物治疗的方法有明
显的现实意义,值得推广。
3.3 展望
本研究结果比既往部分实验效果好,原因可能是:服
用时间增长,服用量大,本实验的总用量为常规的两倍;本
实验是在停用培菲康后即查 13C呼气值。而传统 3联根治
Hp治疗组是停用 3周后复查,故未能完全说明培菲康是
抑制还是杀灭的作用,后续工作是对培菲康治疗组患者进
行追踪,复查 Hp的复发或再感染情况。
[参 考 文 献]
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