全 文 ：22　 草　业　科　学 23卷 6期
6 /2006 PRAT ACULT URA L SCIENCE Vol. 23 , No. 6
牧草研究
苇状羊茅与多年生黑麦草内生真菌菌丝
基因组 DNA提取的优化及 PCR初步检测
廖芳 ,刘跃庭 ,崔铁军 ,黄国明 ,罗家凤 ,尹旭芳
(天津出入境检验检疫局 ,天津 300456)
摘要:感染内生真菌的禾草在牧草和草坪业上具有重要的生态和经济意义 , 家畜采食感染 Neoty phod ium
coenophia lum 和 N. lolii的苇状羊茅 Festuca arundinacea 和多年生黑麦草 Loli um perenne 会发生中毒。研
究收集天津口岸 1998 年以来进境的部分苇状羊茅和多年生黑麦草种子 , 对经镜检确认带有内生真菌的种
子进行分离培养 ,对疑似菌株的菌丝用改进的 Moller 等方法进行基因组 DNA 抽提 , 测定浓度及纯度 , 对照
原方法 , DNA 的纯度有较大提高 , 浓度略有上升。 Tubulin2 基因的引物 I S1 ～ IS3 扩增结果显示为单一的条
带 , 结合形态学和序列比对 , 分离培养得到的菌株可以基本确定为 N. coenophialum 和 N. loli i。根据 Gen-
bank 中 N. coenophialum 和 N. lolii 的 NC25 基因序列设计出引物 F1 ～ R1 , 扩增得到能区分开
N. coenophialum 和 N. lolii的单一条带(相差 160 bp), 建立了 N. coenophialum 和 N. lolii 的 PCR检测方
法 , 结果准确可靠。
关键词:苇状羊茅内生真菌;多年生黑麦草内生真菌;基因组 DNA 提取的优化;PCR检测
中图分类号:S543;S432. 4 +4　　　文献标识码:A　　　文章编号:1001-0629(2006)06-0022-05
*　内生真菌是指寄生在寄主植物体内度过全部
或近乎全部生活史 ,而不在寄主体表产生任何菌
体结构 ,也不引起病害症状的一类真菌 。其菌丝
生长在植物细胞间隙 ,严格种传[ 1] 。
作为一种新型的微生物资源 ,禾本科植物内
生真菌 ,特别是 Neotyphod ium coenophialum 和
N. lol ii因其与 2种具有重要经济意义的栽培牧
草 ,即苇状羊茅 Festuca arund inacea 和多年生黑
麦草 Lolium perenne 的密切关系在国际上正日
益受到重视[ 2] 。
N. coenophialum 和 N. lol ii 产生的生物碱
引起家畜采食后中毒死亡的现象很早就被人们注
意到[ 3] , Bacon 1977 年首 次报 道牛采 食被
N. coenophialum 侵染的苇状羊茅所发生的中毒
病(夏季综合症)[ 4] ,20世纪 80 年代初 , Fletcher
和 Harvey 发现 N. loli i 与羊的黑麦草蹒跚病
(Ryeg rass stag ger)有直接关系[ 5] 。
由于其对畜牧业造成巨大经济损失 ,国外对
内生真菌的研究工作非常重视 ,措施之一就是筛
选不感染内生真菌或带菌率低的牧草品种用于放
牧草地的建植。草种中内生真菌的检测最早采用
的是苯胺蓝染色镜检法 , 20世纪 80年代以来 ,一
些先进的技术手段逐渐应用在内生真菌的检测
上。Welty 等和 Bradfo rd等介绍了 ELISA 检验
苇状羊茅内生真菌[ 6 , 7] 。90年代 , PCR技术开始
应用在内生真菌的检测上。Robert 设计了基于
Tubulin2基因引物用来检测苇状羊茅中 Neoty-
phodium属内生真菌[ 8] ,Christina利用微卫星 PCR
体系进行指纹分析 ,针对筛选出的每一个位点设
计引物 ,扩增不同的分类群体来检测多态性[ 9] 。
国内牧草种植利用过程中出现象欧美那样家
畜采食中毒现象尚未见报道 ,但随着草业国际化
引种频繁 ,确实值得警惕 。国内对内生真菌的检
测鉴定研究起步较晚 ,最近 ,刘跃庭 、聂立影等对
苇状羊茅和黑麦草中有毒内生真菌进行了分离培
养[ 10 , 11] ,聂立影应用 AP - PCR 方法对 N. lol ii
进行了初步鉴定 ,但是目前尚未有 PCR方法同时
检测这 2种内生真菌的相关报道。
20世纪 90年代中后期至今 ,我国从国外引
* 收稿日期:2005-12-05
基金项目:科技部 07课题《人畜共患病检测技术研究》中
分课题“植物有毒内生菌实时荧光 PCR检测技
术研究”(2001BA804A22)的部分研究内容
作者简介:廖芳(1973-),男 ,四川达县人 ,农艺师 ,硕士。
E mai l:liaoxy fang@yahoo. com. cn
通讯作者:黄国明　E m ail:hgm315@163. com
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进牧草种子数量逐年增加 。天津出入境检验检疫
局从 1998年起多次从来自美国 、新西兰等国家的
苇状羊茅和多年生黑麦草中通过苯胺蓝染色镜检
法检出内生真菌 ,并对带菌率较高的种子进行了
分离培养[ 12] 。从口岸角度针对来自不同国家 、不
同年份的苇状羊茅和多年生黑麦草种子 ,经分离
培养得到菌丝 ,参照 Moller 等[ 12] 方法进行菌丝
基因组 DNA 提取的优化 ,并建立了同时检测这 2
种内生真菌初步的 PCR方法。
1　材料与方法
1. 1 供试菌株　供试菌株是天津口岸 1998年以
来收集到的进境部分苇状羊茅 、多年生黑麦草带菌
种子分离培养得到的疑似苇状羊茅内生真菌 、多年
生黑麦草内生真菌 ,菌株编号 、来源及年份见表 1。
表 1　供试菌株
序号 疑似菌株 学名 寄主 寄主来源 寄主年份
1 T f1 N. coenophialum F. arundinacea 美国 2004
2 T f2 N. coenophialum F. arundinacea 美国 1998
3 T f3 N. coenophialum F. arundinacea 美国 2001
4 T f4 N. coenophialum F. arundinacea 美国 2001
5 T f5 N. coenophialum F. arundinacea 美国 2002
6 T f6 N. coenophialum F. arundinacea 美国 2003
7 Lp1 N. lolii L. perenne 美国 1998
8 Lp2 N. lolii L. perenne 美国 2004
9 Lp3 N. lolii L. perenne 澳大利亚 2000
10 Lp4 N. lolii L. perenne 澳大利亚 2001
11 Lp5 N. lolii L. perenne 新西兰 2000
12 Lp6 N. lolii L. perenne 新西兰 2002
1. 2 菌丝基因组 DNA 的提取　提取方法参
照 Moller等方法[ 11] ,稍作修改 ,使用的是 Eppen-
dorf LG R16-W离心机 ,具体步骤为:1)挑取菌丝 ,
移至灭菌烘干研钵 ,常温下干燥 1 ～ 2 h ,液氮冷
冻 ,磨碎菌丝;2)加 350 μL TES(100 mmol Tris
HCl ,pH 值 8. 0 ,10 mmo l EDTA , 2%SDS),转入
1. 5 mL 离心管 ,加350μL TES 洗涤研钵 ,全部转
入管中 ,加 50 ～ 100μg 蛋白酶 K , 55 ～ 60 ℃孵育
0. 5 ～ 1 h;3)加70μL 10%CTAB ,65 ℃孵育 10 min;
4)加 700 μL SEVAG(氯仿:异戊醇 =24∶1),轻
摇混匀 , 0 ℃孵育 30 min , 4 ℃12 000 r /min ,
15 min;5)重复第 4步 1次(可换用 1∶1的酚 /氯
仿),离心 10 min;6)取上清液 ,加 225μL 5 mol /L
NH 4Ac ,置冰上 30 min 以上 , 4 ℃10 000 r /min ,
10 min;7)取上清液 ,加 5 μL RNA 酶 , 37 ℃孵育
15 min ,4 ℃10 000 r /min ,10 min;8)取上清液 ,加
0. 55体积异丙醇 ,10 000 r /min , 5 min ,如无 DNA
团出现 ,立即置样品于冰上 15 ～ 30 min;9)弃上清
液 ,冷 70%乙醇洗 2次 ,干燥后溶解于 50 μL TE
中 ,储存于 - 70 ℃冰箱中备用。
1. 3 DNA 浓度及纯度的测定　采用 Perkin
Elmer公司制造的 Lamda35 型紫外可见光双光束
分光光度计测量提取菌丝 DNA的浓度和纯度 。
1. 4 基因组 DNA 的电泳检测　点 2μL 基因
组 DNA于1. 5%琼脂糖凝胶中 ,电泳 ,1 ～ 5μg /mL
EB水溶液染色 10 min ,观察。
1. 5 基因组 DNA 的 PCR检测　在 Biometry
梯度 PCR仪上进行 DNA的 PCR扩增 ,引物合成
和测序由北京博亚完成 , 反应体系里含有 10
mmol /L T ris-HCl ,50 mmo l /L KCl(pH 值 8. 3),
1. 5 mmol /L MgCl2 , 200 nmo l /L dN TPs , 300
nmo l /L 引物 ,1. 5 UTaqDN A聚合酶 ,30 ～ 100 ng
模板DNA ,反应总体积为 30μL。点8 μL 扩增产
物于 1. 5%的琼脂糖凝胶 ,电泳并 EB染色观察。
在 Genbank 中进行 Blast 查询 ,用 ClustalX软件
进行序列对准(alignment)。
1. 5. 1 利用 Robert[ 8] 根据 Tubulin2设计的 Neo-
ty phodium 属通用引物 IS1(GG TG TTGAGC-
CCCCCTGA TT T ) 和 IS3 (G TCTCATCTC-
CGGGGCGGTA T)进行扩增。扩增程序为:94 ℃
预热 1 min ,94 ℃变性 15 s ,60 ℃退火 1 min ,循环
35次 ,72 ℃延伸10 min。
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1. 5. 2在 GenBank 中查询得到 N. coenophialum
和 N. loli i 的 NC25 基因序列(序列号分别为
AY191830 、AY191831),设计引物F1(CGTTCAC-
CATGCAGTTCACTT )和 R1(CTTCCTATG TA-
ATCGAGTTGCC),反应体系同上 ,扩增程序为94 ℃
预热 5min ,94 ℃变性30 s ,54 ℃退火30 s ,72 ℃延伸
45 s ,循环35次 ,72 ℃延伸10 min。
2　结果
2. 1 基因组 DNA 的提取及浓度和纯度的
测定　对 Moller 等方法[ 12] 稍作修改进行了内生
真菌菌丝基因组 DNA的提取 ,能得到用于 PCR扩
增的 DNA ,并对其进行了浓度和纯度的测定 ,纯度
较高 ,A260 /A280 为 1. 573 7 ～ 1. 807 1 ,平均值为
1.722 7 , 浓度为 145. 5 ～ 282.5 ng /L , 平均值为
200.0 ng /μL ,能够用于基因组的 PCR扩增。
2. 2 基因组 DNA 的电泳检测　选取部分提
取的基因组 DNA ,电泳检测 ,均得到比较单一的
条带 ,没有明显的 RNA 带 ,见图 1。
图 1　基因组 DNA的电泳检测结果
　注:M 为 2 000 bp Ladder;1～ 3 分别为 T f1 , T f3 , T f5;
4 ～ 6 分别为 Lp1 , Lp4 , Lp6。
2. 3 引物 IS1 ～ IS3 的 PCR扩增　利用 Rob-
er t[ 8] 根据 Tubulin2 设计的 Neotyphodium 属通
用引物 IS1 ～ IS3对部分提取的基因组 DNA 进行
扩增 ,得到单一的条带(见图 2),大约为 400 bp ,
经测序确认为 444 bp ,Blast查询的结果表明疑似
苇状羊茅内生真菌 、多年生黑麦草内生真菌菌株的
Tubulin 2序列均与 Genbank中的 N. coenophialum
和 N. lolii 的 Tubulin2 序列各自有 100%的相似
性 ,序列对准的结果表明:彼此之间只有 3个非连
续碱基的差别 ,结合菌丝培养条件及菌丝外部形态
等证据 ,可以基本确定分离培养得到的菌株即为
N. coenophialum和 N. lolii。
图 2　基因组 DNA的 Tubulin2 基因 PCR
产物电泳检测结果
　注:7为阴性对照 ,其他同图 1。下图同。
2. 4 引物 F1 ～ R1的 PCR扩增　根据 Gen-
bank中 N. coenophialum 和 N. loli i的 NC25 基
因序列设计的引物 F1 ～ R1对部分提取的基因组
DNA 进行扩增 , 得到单一的条带(见图 3),
N. coenophialum 大约为 550 bp , N. lol ii 大约为
400 bp ,在 1. 5%的琼脂糖凝胶上能够区分这 2种
内生真菌。经测序确认 , N. coenophialum 为 573
bp , N. loli i为 409 bp ,Blast查询及序列对准的结
果表明:所测3个 N. coenophialum的 NC25序列彼
此完全相同 , 与 Genbank 中的 N. coenophialum
(AY191830)只相差 1个碱基 ,所测 3个 N. lol ii的
NC25序列与 Genbank 中的 N. lol ii(AY191831)
有 100%的相似性 ,说明引物 F1 ～ R1扩增得到的
序列是 N. coenophialum 和 N. lol ii 的 NC25 基
因序列 。
图 3　基因组 DNA的 NC25基因 PCR产物电泳检测结果
3　讨论
3. 1 N. coenophialum 和 N. lolii 与其寄主
苇状羊茅和多年生黑麦草之间的关系 　
N. coenophialum 和 N. lolii 侵染寄主后与寄主协
同进化 ,在演化过程中形成互惠共生关系 ,一方面
内生真菌可从寄主中吸收营养供自己生长需要 ,另
一方面能够给寄主带来多种有益特性 ,如:抗病虫
害 、阻抑昆虫和食草动物的采食 、抗旱 、抗寒 ,以及
促进植物生长 ,提高植物产量 ,增强其竞争力等[ 13] 。
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3. 2 对 N. coenophialum和 N. lolii 进行分
子检测的必要性　苇状羊茅和多年生黑麦草
是 2种重要的牧草 ,广泛用于放牧草地的建植 ,其
内生真菌在对其带来有益一面的同时也会对采食
这 2种牧草的家畜产生毒性 ,生产中采用不含有
内生真菌或带菌率低的种子建植人工草地或替换
已感染内生真菌的草地 ,另一方面 ,苇状羊茅和多
年生黑麦草又作为草坪草种用于园林绿化 ,草坪
植物不存在放牧的问题 ,高感染率的苇状羊茅和
多年生黑麦草已广泛用于其育种工作中[ 14 , 15] ,因
此 ,对苇状羊茅和多年生黑麦草中内生真菌的检
测在生产上非常重要 ,由于 N. coenophialum 和
N. lol ii 的菌丝体形态和血清学反应较为相
似[ 16] ,在人工培养基上的生长慢 ,不产孢或产孢
能力弱[ 17] , 这给利用菌落特征 、菌丝的生长特性 、
产孢特性等经典形态学特征进行准确检测和鉴定
(比如苯胺蓝染色镜检法)带来困难 。近年来 ,内
生真菌的分子检测和鉴定已成为内生真菌研究领
域的热点之一[ 1] 。
3. 3 基因组 DNA 的提取方法的优化 　对
Moller等[ 12] 原方法的优化主要在以下几方面:第
1步增加了常温下干燥 1 ～ 2 h;第 4步由 10 000
r /min离心 10 min改为12 000 r /min离心15 min;
增加了第 5步 。对改进后的方法和Moller等原方法
提取的基因组 DNA的浓度和纯度作了个对比 ,原方
法提取的基因组 DNA的 A260 /A280为 1.098 1 ～
1. 361 8 ,平均值为 1. 226 3 ,浓度为 102. 5 ～ 247. 5
ng /μL ,平均值为 169. 1 ng /μL ,经改进 , DNA 的
纯度有较大提高 ,浓度略有上升 。菌丝基因组
DNA 的提取 ,纯度决定于蛋白质消化和去除是否
彻底 , RNA 的消化是否完全 ,通过增加离心转数
和时间能够使蛋白质及其他杂质紧密浓缩于上清
液下面 , DNA 更完全地溶于上清液中 ,从而更好
地转移上清液 ,重复该步骤能够更彻底地去除蛋
白质 ,提高纯度。试验中发现原方法的上清液中
比较浑浊而粘稠 ,给后续步骤带来困难 ,也影响了
DNA 的纯度和浓度 。从二者 A260 /A280值和基
因组 DNA 电泳结果看来 , RNA 的消化比较完
全。DNA 浓度取决于菌丝的研磨 、TES和 CTAB
试剂的配制以及后续步骤的损失量 ,干燥的菌丝
比潮湿的菌丝更易研磨和磨碎 , TES 各组分的浓
度和 pH 值一定要准确 、CTAB的配方一定要正
确 ,这样最后的 DNA 得率就会提高 。
3. 4 基因组 DNA 的 PCR 检测　利用 Rob-
ert
[ 8] 设计的 Neotyphodium 属通用引物 IS1 ～ IS3
进行基因组 DNA 的 PCR扩增 ,能够得到大小相
似的单一条带 ,结合测序结果和形态 、生理方面的
特征 ,可以初步断定从苇状羊茅 、多年生黑麦草带
菌种子中分离培养得到的疑似苇状羊茅内生真
菌 、多年生黑麦草内生真菌就是我们所需要的苇
状羊茅内生真菌 、多年生黑麦草内生真菌 ,但由于
二者之间仅有 3个非连续的碱基差异 ,不能提供
有效的设计特异引物或 Taqman 探针的位点 。
根据 NC25 基因设计出引物 F1 ～ R1 ,
N. coenophialum 和 N. lol ii 的扩增产物相差 160
bp左右 ,在 1. 5%的琼脂糖凝胶上能够明显区分 ,
对另外的 6个菌株进行了 PCR检测 ,均得到截然
区分 、与预计大小相同的带 ,说明引物的设计是正
确的 ,PCR检测是准确可靠的 ,对今后引进牧草
和草坪草种子中内生真菌的确认和鉴定有一定的
理论指导意义 , 同时利用 1 对引物就完成了
N. coenophialum 和 N. lol ii的同时检测 ,避免了
2对引物的相互拮抗 ,更经济实效 。但是供试材
料没有引入其他 Neotyphod ium 近似种(由于收
集的困难 ,正在收集中),该引物是否能够区分开
其他近似种尚未可知 ,需要进一步收集近似种加
以验证 。另外 ,从苇状羊茅和多年生黑麦草种子
中分离培养得到菌丝过程繁杂 ,条件苛刻 ,容易受
杂菌污染 ,而且时间长 ,需 1个月左右 ,这对于口
岸检疫来说速度过慢 ,有必要在现有的工作基础
上 ,进一步探索直接从种子中检测这 2种内生真
菌的分子生物学方法 , 比如套式 PCR 、实时荧光
PCR等 ,从而避开繁杂的菌丝培养 , 提高检测速
度和准确性 。
参考文献:
[ 1] 　郭良栋. 内生真菌研究进展[ J]. 菌物系统 , 2001 , 20
(1):148-152.
[ 2] 　王志伟 ,王世梅 ,纪燕玲 , 等. 中国禾本科植物内生
真菌研究———东营市盐碱地区的禾本科植物内生真
26　 草　业　科　学 (第 23卷 6期) 6 /2006
菌的检测与分布特征[ J] . 草业科学 , 2005 , 22(2):
60-64.
[ 3] 　王兆龙 , 殷朝珍 ,高红明. 内生真菌对草坪草抗逆性
状的改良[ J]. 草业科学 , 2005 , 22(1):66-67.
[ 4] 　Bacon C W , Po r te r J K. Epichloe typhina f rom tall
fescue g rasses[ J] . Applied Enviromental Microbiol-
ogy , 1977 , 34:576-581.
[ 5] 　F letche r L R , Harvey I C. An association of a Loli-
um endophy te with ryeg r ass staggers[ J]. New Zeal-
and Veterinary Journal , 1981 , 32:139-140.
[ 6] 　Welty R E. Endophy te detection in tall fescue seed
by staining and ELISA [ J] . Seed Sci. &Techno l. ,
1986 , 14:105-116.
[ 7] 　Bradford B.Reddick Detection of the Tall Fescue Endo-
phy te with Emphasis on Enzyme - Linked Immunosor-
bent Assay[ J] . J. Prod. Agric. , 1988 , 1(2):133-136.
[ 8] 　Robe rt P Doss. A PC R- Based Technique fo r Detec-
tio n o f Neo typhodium Endophy te in Diverse Acces-
sions of Ta ll Fe scue[ J] . Plant Disease , 1998 , 82
(7):738-740.
[ 9] 　Christina D Moon. Identification of Epichloe Endo-
phy te in P lant by a M icro sa tellite - Based PCR
Fige rprinting Assay w ith Automated Ana ly sis[ J] .
Applied Enviromental Microbiology , 1998 , 65(3):
1268-1279.
[ 10] 　刘跃庭. 进境苇状羊茅和多年生黑麦草种子携带
内生真菌带菌率的研究[ J] . 植物检疫 , 2005 , 19
(4):193-197.
[ 11] 　聂立影. 黑麦草(Loli um perenne L. )内生真菌的
检测 、分离及鉴定[ J]. 微生物学通报 , 2005 , 32(1):
10-14.
[ 12] 　Moller E M , Bahnw eg G , Sande rmann H , et al. A
Simple and Efficient P ro tocol fo r the Iso la tion o f
H igh Mo lecular Weight DNA from Filamentous
Fungi , Fruit Bodies , and Infected Plant Tissues
[ J] . Nucleic Acids Res. , 1992 , 20:6115-6116.
[ 13] 　纪燕玲 , 王志伟 ,于汉寿 , 等. 分离自苇状羊茅(Fe-
stuca arundinacea Schreb. )的内生真菌 Neoty-
p hodi um uncinatum[ J] . 南京农业大学学报 , 2003 ,
26(2):47-50.
[ 14] 　张颖 , 韩建国. 内生真菌对苇状羊茅和多年生黑麦
草影响的研究进展[ J] . 草业科学 , 2004 , 21 (7):
59-65.
[ 15] 　乔安海 , 王文. 禾草内生真菌与草坪草改良[ J] . 青
海草业 , 2004 , 13(1):38-40.
[ 16] 　Fisher P J , Sutton B C , Pctrini L E O , at el. Fungal
endophy te s fr om Opuntia stricta a first repo rt[ J] .
N ova Hedwigia , 1994 , 59:195-200.
Optimization of extraction of mycel ial genomic DNA of Neotyphodium coenophialum
and N. lol ii and their preliminary detection based on PCR
LIAO Fang , LIU Yue-ting ,CUI Tie-jun , HUANG Guo-ming ,LUO Jia-feng , YIN Xu-fang
(Tianjin Entry - Exi t Inspect ion and Quarantine Bureau , Tianjin 300456 , China)
Abstract:Endophy tes-infected grasses have an ext raordinary impact on the ecolog y and economy of
pasture and turf.Festuca arundinacea and Lol ium perenne infected Neotyphodium coenophialum and
N. lol ii are to xic to livestock fed on them. N. coenophialum and N. lol ii in the impo rted grass seeds
of Festuca arundinacea and Lolium perenne by Tianjin Port since 1998 were micro scopical ly af firmed
to take endophytes and w ere separated and cul tivated. The purity and concentration of the genomic
DNA ex tracted f rom hyphaes of 12 suspected strains w ith improved M oller , et al. method w as meas-
ured by ult raviolet spect roscopy. T he puri ty and the concentrat ion increased slightly in contrast wi th
the Mo ller , et al. method. PCR products wi th primers IS1 - IS3 acco rding to Tubulin2 appea red to be
a single band respectively through gel elect ropho resis , and sequence analy sis united w ith morphologic
pro ofs show ed that the suspected st rains could be confi rmed to be N. coenophialum and N. loli i re-
spectively. The prime r F1 - R1 o f NC25 gene had designed acco rding to sequences f rom Genbank , and
the PCR resul t showed that N. coenophialum was evident ly dif fe rent f rom N. lol ii by gel elect ropho-
re sis , since the product of N. coenophialum was 160 bp larger than that of N. loli i by amplification
wi th the same prime r F1 - R1. The detection based on PCR is accurate and credible.
Key words:Neotyphod ium coenophialum ;N. Loli i;optimization o f ex t raction of genomic DNA;de-
tection based on PCR