全 文 ：第 35 卷第 2 期
2011 年 2 月
水 产 学 报
JOURNAL OF FISHERIES OF CHINA
Vol． 35，No． 2
Feb．，2011
文章编号: 1000 － 0615( 2011) 02 － 0183 － 09 DOI: 10． 3724 /SP． J． 1231． 2011． 17134
收稿日期: 2010 09 27 修回日期: 2010 11 12
资助项目:国家海洋公益项目( 200805069) ; 国家自然科学基金项目( 30700615)
通讯作者:高天翔，E-mail: gaozhang@ ouc． edu． cn
基于 matK、rbcL和 ITS序列的 5 种大叶藻系统发育研究
李 渊1， 孙典荣2， 李文涛1， 张沛东1， 江 鑫1， 郭 栋1， 高天翔1*
( 1．中国海洋大学水产学院，山东 青岛 266003;
2．中国水产科学研究院南海水产研究所，广东 广州 510300)
摘要: 运用 PCR直接测序法，对采自爱尔兰、日本、韩国和中国的大叶藻、矮大叶藻、丛生大叶
藻和红须根虾形藻及 GenBank中的宽叶大叶藻 5 种大叶藻叶绿体的 matK、rbcL 和核糖体 ITS
的部分序列进行测定，并比较分析了 5 种大叶藻 3 个目的片段的核苷酸序列，结果发现胞嘧啶
( C) 在 3 个目的片段上的含量均较低。ITS 片段检测到 172 处核苷酸替换，表现出丰富的遗传
多态性。matK 基因片段上有 52 处核苷酸替换，rbcL 基因片段上有 20 处核苷酸替换，且大部
分替换来自于第三密码子的同义替换，种间在氨基酸水平上产生了一定的分化。基于 ITS、
matK 和 rbcL 3 个目的片段，利用邻接法、最大简约法、最大似然法和贝叶斯法构建的系统发
育树结果基本一致，明显分为 3 大支。矮大叶藻与大叶藻属间 3 种大叶藻的核苷酸最小差异
值为 19． 33%，在分子数据上达到了属的水平。基于 matK 和 rbcL 基因片段拼接序列的分析
结果表明:大叶藻与丛生大叶藻的分化时间在上新世( 2 ～ 2． 7 百万年前) ，与宽叶大叶藻的分
化时间在上新世( 4 ～ 5． 3 百万年) ，与矮大叶藻的分化时间在渐新世( 27 ～ 36 百万年前) ，与红
须根虾形藻的分化时间在始新世( 33 ～ 44 百万年前)。4 个地区大叶藻的 ITS 片段序列完全
相同，结果表明大叶藻 ITS 区的变异程度与地理距离不相关，其不适用于大叶藻不同地理株间
的分子系统演化。该研究进一步阐述了 5 种大叶藻的系统发育关系，同时也为国内海草的分
子系统发育研究提供重要参考。
关键词: 大叶藻属; 虾形藻属; matK ; rbcL ; ITS ; 系统发育关系
中图分类号: Q 949; S 917 文献标识码: A
在热带和亚热带海区，海草床( seagrass bed，
海草在潮间带中呈片状分布，通常将整片的海草
称为海草床) 与红树林和珊瑚礁一样，是三大典
型海洋生态系统之一，具有巨大的碳储备能
力［1］。KUO 等［2］认为全世界海草共有 4 科 12 属
60 多种，我国迄今为止有记录的海草共 4 科 10
属 20 种［3］: 大叶藻科( Zosteraceae ) ，聚伞藻科
( Posidoniaceae) ，海神草科( Cymodoceaceae ) ，水
鳖科( Hydrocharitaceae) 。国内大叶藻科包含大
叶藻属( Zostera) 和虾形藻属 ( Phyllospadix) 2 个
属，大叶藻属包括大叶藻亚属( subgenus Zostera)
［大叶藻 ( Zostera marina ) 、丛生大叶藻 ( Z．
caespitosa) 、具茎大叶藻 ( Z． caulescens ) 、宽叶大
叶藻 ( Z． asiatica) ］和拟大叶藻亚属 ( subgenus
Zosterella) ［矮大叶藻( Z． japonica) ］5 个种; 虾形
藻属包括黑须根虾形藻 ( Phyllospadix japonicus )
和红须根虾形藻( P． iwatensis) 。以上 7 个种主要
分布在山东、河北、辽宁沿海，而矮大叶藻在厦门、
福建、广东、广西、台湾亦有分布［3］。国内学者关
于海草的研究主要集中于生物学、生态生理学等
方面［4 － 8］，尚未见有遗传学方面的研究报道。
近年来，随着分子系统学的发展，叶绿体的
matK、rbcL 基因片段和核糖体 ITS 片段已经成功用
于系统发育研究［9 －18］，但未见有对国内大叶藻科几
种大叶藻的系统发育关系进行探讨。本研究借鉴国
外大叶藻科系统发育研究经验的基础上［10 －13］，选用
水 产 学 报 35 卷
系统发育常用的 ITS、matK和 rbcL 片段作为分子标
记，分析比较 5 种大叶藻在叶绿体和核糖体基因组
不同片段上的遗传分化程度，并探讨 5 种大叶藻间
的亲缘关系和分歧年代，同时比较核糖体和叶绿体
基因组不同片段上核苷酸替代速率的差异，以期为
国内大叶藻科的分子系统发育研究提供参考。
1 材料与方法
1． 1 实验材料
采集于爱尔兰的大叶藻由胡自民博士于 2008
年硅胶干燥保存带回，采集于韩国的样品由李文涛
博士于 2009年硅胶干燥保存带回，采集于日本东京
湾的大叶藻由小松辉久教授 2009 年提供。采集中
国青岛、威海、烟台沿海的 2种大叶藻(表 1) ，并依据
《中国植物志》第 8卷［19］和《中国海草植物》［3］进行
种类鉴定。样品采集后用海水洗净，取新鲜叶片，放
入装有硅胶的离心管中带回实验室备用，或者将新
鲜样品浸于海水中直接带回实验室使用。采样时为
确保所采样品为不同植株，植株间隔至少在 2 m 以
上。宽叶大叶藻和外群海菖蒲( Enhalus acoroides )
的 matK、rbcL 和 ITS 序列参照 GenBank 中同源序
列( AB125360 /AB125352 /EF198347) 和( AB002569 /
U80697 /AY870347)进行比对。
表 1 样品采集地点及样品数
Tab． 1 List of species，localities and number
地点
location
种类 species
大叶藻
Z． marina
丛生
大叶藻
Z． caespitosa
矮大
叶藻
Z． japonica
红须根
虾形藻
P． iwatensis
爱尔兰克莱尔郡 2
日本东京湾 2
韩国巨济岛 2 5 5
青岛胶南 2
威海俚岛 2 5
威海天鹅湖 2
烟台 5
1． 2 实验方法
基因组 DNA 提取 取 4 种大叶藻适量的
新鲜叶片或干燥叶片，参照 BAN［20］的 CTAB
( Cetyltrimenthylammonium bromide ) 法并加以改
良来提取基因组 DNA，将乙醇沉淀后的基因组
DNA 溶解于 100 μL 蒸馏水中，4 ℃保存备用。
取提取的 DNA 3 μL 用 1． 5%的琼脂糖凝胶电泳
检测，以备之后的 PCR扩增。
基因组片段的 PCR扩增、纯化 用于扩增 4
种大叶藻的 matK、rbcL 和 ITS 片段的引物分别为:
matK F: 5-AACATTTCCCTTTTTGGAGGA-3，matK
R: 5-CAGAATCCGATAAATCAGTCCA-3［21］; rbc
LF: 5-ATGTCACACCAAACAGAG-ACTAAAGC-
3，rbcLR: 5-GCAGCAGCTAGTT-CCGGGCTCCA-
3［11］; ITS F5: 5-GGAAGTAA-AAGTCGTAACAA-
3; ITS G4: 5-CTTTTCCT-CCGCTTATTG-
ATATG-3［22］。PCR 反应体系总体积为 50 μL，其
中: 10 × PCR 缓冲液 ( 200 mmol /L Tris-HCl，pH
8． 4; 200 mmol /L KCl; 100 mmol /L ( NH4 ) 2 SO4 ;
15 mmol /L MgCl2 ) 5 μL，dNTP 200 μmol /L，引物
各 0． 2 μmol /L，Taq 酶 1． 25 U ( 大连宝生物公
司) ，模板 DNA 20 ng，加水至 50 μL。以上反应
均设阴性对照以排除 DNA 污染的情况。用
1． 5%琼脂糖凝胶电泳检测 PCR 扩增产物，凝胶
成像系统拍照。
1． 3 PCR产物回收及 DNA序列测定
PCR产物经 1% TAE琼脂糖凝胶电泳，产物
电泳后于紫外灯下切割目的条带，用 DNA 胶回
收试剂盒进行产物的纯化回收。测序分析仪为美
国 ABI公司 3700 型全自动序列分析仪，为保证
所测序列的准确性，每个样品均进行双向测序，测
序反应采用与 PCR反应一致的引物。
1． 4 序列数据分析
用 DNAStar软件对所得序列进行剪切、编辑和
比对，并辅以人工校正。用 PAUP 4． 0［23］和
Modeltest 2． 0［24］筛选 3个目的片段核苷酸最佳替换
模型，并且基于最佳替换模型利用 MEGA 4． 1［25］软
件将蛋白质编码基因 matK和 rbcL 的核苷酸序列的
密码子转换为氨基酸进行检测。分析叶绿体、核糖
体基因组不同片段的核苷酸组成并计算种间遗传距
离，5种大叶藻的 DNA 多态性用软件 Arlequin ver
3． 1［26］进行分析。使用 PAUP 4． 0软件，应用邻接法
( NJ)［27］、最大简约法 ( MP )［28］、最大似然法
( ML)［29］构建系统发育树，运用MrBayes 3． 0软件构
建贝叶斯( Bayes)［30］系统发育树。
2 结果
2． 1 序列差异及核苷酸组成分析
4种大叶藻样品经过 PCR扩增后均得到清晰
的 matK、rbcL 和 ITS 3个目的片段，其中宽叶大叶
藻的 matK、rbcL 和 ITS 序列参照 GenBank 中的同
源序列，对所得序列进行比对且辅以人工校正，得
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2 期 李 渊，等: 基于 matK、rbcL 和 ITS 序列的 5 种大叶藻系统发育研究
到同源片段序列分别为 matK( 763 bp) 、rbcL( 1 324
bp) 和 ITS( 436 ～455 bp) ( 不包括5． 8 S rDNA) ( 表
2) 。5种大叶藻在 ITS 片段上检测到166个多态位
点，在 matK 片段上检测到 51 个多态位点，而在
rbcL 片段上检测到 20个多态位点。
3 个目的片段核苷酸组成分析结果表明: 5 种
大叶藻的 3 个目的片段上胞嘧啶( C ) 的含量均低
于 17． 62%，其中最低的是 matK 片段( 13． 24% ) 。
C 含量在 matK 和 rbcL 蛋白质编码基因的第三密
码子位点上的含量也很低 ( ＜ 12． 19% ) ，其中 5
种大叶藻在 matK 片段上呈现显著的反 C 偏倚
( ＜ 9． 8% ) ( 图 1) 。A + T 的含量明显高于 G + C
的含量，最低的 rbcL 片段中为 58． 08%，A + T 平
均含量为 65． 54% ( 表 3) 。
表 2 序列片段多态及Modeltest检验得到的模型
Tab． 2 Sequence variability and nucleotide substitution model estimates for Modeltest analyses
基因
gene
片段长度( bp)
sequence length
信息简约位点
parsimony
information sites
多态位点
variable sites
单一信息位点
singleton sites
插入 /缺失位点
gapped sites
核苷酸
替代模型
best model
Gamma值
Gamma value
matK 763 5 51 46 0 HKY Equal rates
rbcL 1 324 2 20 18 0 HKY Equal rates
ITS 436 ～ 455 9 166 156 53 HKY Equal rates
图 1 5 种大叶藻 3 个目的片段核苷酸组成
all．整个片段; 3 rd．蛋白质编码基因第三密码子位点。
Fig． 1 Nucleotide compositions of three partial fragments of five Zosteraceae species
all． means the partial fragment，3rd． means the third codon of the gene．
2． 2 遗传分化分析
ITS 片段中，12株不同地区的大叶藻共享一个
单倍型，5株丛生大叶藻共享一个单倍型，5 株矮大
叶藻中共享一个单倍型，10 株不同地区的红须根
虾形藻也是共享一个单倍型。5 种大叶藻共检测
到 166个多态位点( 9 个信息简约位点［10］、156 个
单一信息位点) ，172 个核苷酸替代 ( nucleotide
substitution) 中出现 88 个转换( transition) 、84 个颠
换( transversion) 。matK 基因片段上，12 株不同地
点的大叶藻定义了 3 个单倍型，5 株丛生大叶藻共
享了一个单倍型，5 株矮大叶藻共享一个单倍型，
10株不同地点的红须根虾形藻共享一个单倍型。
5种大叶藻共检测到 51个多态位点( 5 个信息简约
位点、46个单一信息位点) ，52 个核苷酸替代中包
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含 34个转换、18 个颠换。rbcL 基因片段上，12 株
不同地点的大叶藻共享一个单倍型，5 株丛生大叶
藻和矮大叶藻分别共享一个单倍型，10 株不同地
点的红须根虾形藻共享一个单倍型。5 种大叶藻
共检测到 20个多态位点( 2 个信息简约位点、18 个
单一信息位点) ，20 个核苷酸替代中包含 14 个转
换、6个颠换。基于 HKY 模型分别计算得到 5 种
大叶藻间的遗传距离( 表 4和表 5) 。
表 3 核苷酸 matK、rbcL和 ITS片段碱基分布频率
Tab． 3 Nucleotide frequencies of matK，rbcL
and ITS sequences %
基因 gene C T A G A + T
matK 13． 24 41． 83 33． 36 11． 58 75． 19
rbcL 17． 62 30． 55 27． 53 24． 30 58． 08
ITS 16． 31 33． 80 29． 55 20． 34 63． 35
平均值 mean 15． 72 35． 39 30． 14 18． 74 65． 54
表 4 5 种大叶藻的 matK(上三角)和 rbcL( 下三角)基因序列之间的遗传距离
Tab． 4 Genetic distances of gene fragments of matK( above diagonal) and
rbcL( below diagonal) among five Zosteraceae species
大叶藻
Z． marina
矮大叶藻
Z． japonica
丛生大叶藻
Z． caespitosa
宽叶大叶藻
Z． asiatica
红须根虾形藻
P． iwatensis
大叶藻 Z． marina 0． 067 7 0． 004 8 0． 010 2 0． 080 4
矮大叶藻 Z． japonica 0． 014 5 0． 065 3 0． 060 7 0． 047 7
丛生大叶藻 Z． caespitosa 0． 000 8 0． 015 3 0． 007 9 0． 080 3
宽叶大叶藻 Z． asiatica 0． 001 5 0． 014 5 0． 000 8 0． 077 1
红须根虾形藻 P． iwatensis 0． 020 0 0． 019 2 0． 019 2 0． 018 4
表 5 5 种大叶藻的 ITS序列之间的遗传距离
Tab． 5 Genetic distances of fragment of ITS among five Zosteraceae species
大叶藻
Z． marina
矮大叶藻
Z． japonica
丛生大叶藻
Z． caespitosa
宽叶大叶藻
Z． asiatica
红须根虾形藻
P． iwatensis
大叶藻 Z． marina
矮大叶藻 Z． japonica 0． 215 5
丛生大叶藻 Z． caespitosa 0． 002 4 0． 209 8
宽叶大叶藻 Z． asiatica 0． 014 6 0． 193 3 0． 012 1
红须根虾形藻 P． iwatensis 0． 389 9 0． 353 2 0． 400 3 0． 379 1
在 matK 和 rbcL 两个蛋白质编码基因部分片
段中，大部分的突变是同义突变 ( synonymous
substitution) ，最普遍的核苷酸替代是发生在密码
子第三位点上的转换，其次是密码子第三位点上的
颠换和密码子第一位点上的无义转换［31］。matK
基因片段上的 51处突变中，有 23 处在密码子第三
位点上( 5 处为颠换) ，14 处在第二密码子上( 7 处
颠换) ，15处位于密码子第一位点( 9 转换) 。rbcL
基因片段上的 20 处突变中，17 处核苷酸替代皆发
生在密码子第三位点上( 4 处为颠换) ，第二密码子
有 1处颠换，第一密码子有 2处颠换。
氨基酸水平上，在 matK 基因长度为 254 个
氨基酸序列上，5 种大叶藻共检测到氨基酸替代
( amino acid substitution ) 42 处。在 rbcL 基因长
度为 441 个氨基酸序列上，5 种大叶藻检测到 5
处氨基酸替代。可见 5 种大叶藻的 matK 和 rbcL
基因片段在氨基酸水平上均产生了一定程度的遗
传分化( 图 2) 。
图 2 5 种大叶藻 matK和 rbcL基因
片段的氨基酸序列比对
1．丛生大叶藻 韩国; 2．矮大叶藻 韩国; 3．大叶藻 爱尔兰; 4．
大叶藻韩国; 5．大叶藻日本; 6．宽叶大叶藻; 7．红须根虾形藻
烟台; 8．红须根虾形藻 俚岛; 9． 丛生大叶藻; 10． 矮大叶藻;
11．大叶藻 日本; 12．宽叶大叶藻; 13．红须根虾形藻。
Fig． 2 Amino acid sequences alignment of matK and
rbcL gene fragments for five Zosteraceae species
1． Z． caespitosa Korea; 2． Z． japonica Korea; 3． Z． marina Ireland;
4． Z． marina Korea; 5． Z． marina Japan; 6． Z． asiatica; 7． P．
iwatensis Yantai; 8． P． iwatensis Lidao; 9． Z． caespitosa; 10． Z．
japonica; 11． Z． marina Japan; 12． Z． asiatica; 13． P． iwatensis．
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2 期 李 渊，等: 基于 matK、rbcL 和 ITS 序列的 5 种大叶藻系统发育研究
不同基因间核苷酸替代速率的差异不是由于
基因本身的差异引起的，而是可能由于不同进化世
系间的差异产生的。分子钟假说( molecular clock
hypothesis) 认为:某一特定的大分子在所有的世系
( Lineage) 中，氨基酸或核苷酸替代速率在进化过
程中是近似的保持恒定的，尽管替代速率的观测值
受随机误差的影响［32］。水稻 ( Oryza sativa ) 的
rbcL 的同义替代速率为( 0． 9 ～ 1． 2) × 10 －9位点 /
年［33］，这一核苷酸同义替代速率同样适用于海
草［11］，利用贝叶斯联合模型将 matK 和 rbcL 片段
拼接来推算 5种大叶藻的分歧年代得出: 大叶藻与
丛生大叶藻的分歧时间为 2 ～ 2． 7 百万年，发生于
上新世 ( Pliocene) ; 与宽叶大叶藻的分歧时间为
4 ～5． 3 百万年，发生于上新世( Pliocene) ; 与矮大
叶藻的分歧时间为 27 ～ 36 百万年，发生于渐新世
( Oligocene) ; 与红须根虾形藻的分歧时间约为
33 ～44百万年，发生于始新世( Eocene) 。
2． 3 系统发育分析
本研究运用邻接法( NJ) 、最大简约法( MP) 、
最大似然法( ML ) 和贝叶斯( Bayes) 构建的系统
发育树基本一致 ( 图 3 ) 。系统发育研究结果表
明，5 种大叶藻明显分为三大支，第一支由拟大叶
藻亚属( subgenus Zosterella) 组成，另外一支由大
叶藻亚属( subgenus Zostera) 3 个种组成，第三支
由红须根虾形藻组成，而且均有很高的支持率。
从 NJ、MP、ML 和 Bayes系统树上可以看出，大叶
藻与丛生大叶藻首先聚为一支，之后再与宽叶大
叶藻聚类构成大叶藻亚属大支; 作为拟大叶藻亚
属的矮大叶藻单独聚为一大支; 虾形藻属的红须
根虾形藻单独聚为一支。
图 3 邻接法、最大简约法、最大似然法和贝叶斯法构建 5 种大叶藻的
系统发育树(支持率及后验概率标注在分支上)
Fig． 3 Phylogenetic trees of five Zosteraceae species based on neighbor joining analyses，
maximum parsimony analyses，maximum likelihood and Bayes analyses( numbers on the
trees represent the values of supporting values and posterior probability values)
3 讨论
本研究结果显示 matK、rbcL 和 ITS 3 个目的
片段中的胞嘧啶 ( C ) 的含量较低 ( 均低于
17． 62% ) ，在 matK 和 rbcL 蛋白质编码基因的第
三密码子位点上的含量更低( ＜ 12． 19% ) 。A + T
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水 产 学 报 35 卷
的含量高于 C + G 的含量，表现出对 A + T 含量
偏斜。蛋白质编码基因密码子第三位点上核苷酸
的突变受到自然选择压力小，所以密码子第三位
点能够更清晰的表明核苷酸组成的不均一性［31］，
被子植物中蛋白质编码基因的密码子第三位点同
样符合这一规律。MEYER［31］认为，密码子第三
位点上的突变很少导致氨基酸替代( 同义替代) ，
所以比导致氨基酸替代的突变 ( 非同义替代) 积
累得快得多，最常见的突变是密码子第三位点上
的转换，其次是密码子第三位点上的颠换和第一
密码子位点上的无义转换。ITS 片段长度比较保
守，缺乏编码选择压力，但核苷酸序列变化较大，
进化速率较快［9］，在 ITS 基因片段中，检测到丰富
的遗传多态，其中有 166 个多态位点，172 个核苷
酸替代，本研究结果与王建波等［9］的研究结果相
似。在氨基酸水平上，氨基酸序列上的遗传变异
比两种蛋白质编码基因核苷酸序列上的遗传变异
低得多，5 种大叶藻在氨基酸序列上共检测到 47
处遗传变异，表明 5 种大叶藻在 matK 和 rbcL 基
因片段上已有一定的分化。
大量的研究表明，matK、rbcL 和 ITS 片段都
比较保守，适合于种以上水平系统进化分析，且得
到了广泛的应用［11，12 － 16］。其中 ITS 片段更是可
以用于研究不同地理株间的分子系统演化关
系［17］，汪文俊等［18］对浒苔的研究发现中国海区
的浒苔 ITS 片段序列完全相同，为同一来源，而与
日本、英国和美国的浒苔有一定分化。本研究中
中国、韩国、日本和爱尔兰大叶藻的 ITS 片段序列
完全相同，结果表明 ITS 不适用于大叶藻不同地
理株间的分子系统演化。matK、rbcL 和 ITS 3 个
目的片段都能将 5 种大叶藻很好的区分开，而且
构建的系统发育树基本一致。大叶藻与丛生大叶
藻首先聚为一支，之后再与宽叶大叶藻聚类构成
大叶藻亚属大支; 作为拟大叶藻亚属的矮大叶藻
单独聚为一大支，最后虾形藻属的红须根虾形藻
单独 构 成 一 支，符 合 KUO 等［34］ 和 DEN
HARTOG［35］划分结果。
KATO 等［11］对 matK 和 rbcL 的进化速率进
行了检测，得到二者具有相似的进化速率，同时还
利用 Tajima’s relative rate test对水稻和海草的碱
基替代率进行了检测，结果表明二者之间无明显
差别。本研究利用贝叶斯联合模型将 matK 和
rbcL 拼接［36 － 38］，分析重建系统发育关系( 图 3 ) ，
结果与单独构树树形一致。将 ( 0． 9 ～ 1． 2 ) ×
10 －9位点 /年核苷酸分歧速率用于 matK 和 rbcL
拼接片段上来推算 5 种大叶藻的分歧时间［11］。
基于这一标准，我们推算出 5 种大叶藻的分化时
间。KATO 等［11］在大叶藻属的系统研究中，得出
大叶藻与宽叶大叶藻在 3 ～ 6 百万年前分歧，与本
研究得出的结果相近。
1989 年， LARKUM 等［39］ 在 白 垩 纪
( Cretaceous) 地层发现了关于海草的化石，推测可
能是现存的大叶藻科的虾形藻属物种［40 － 41］，
AIOI［42］提出大叶藻科在第三纪( Tertiary ) 之后才
出现，所以不可能是大叶藻科物种的化石。本研
究中的分歧时间支持 AIOI［42］的观点。可见大叶
藻科的起源依然存在争议，如果能找到大叶藻科
物种化石，就可以准确地推断出大叶藻科各种间
的分歧年代。
屈良鹄等［43］对 GenBank 中不同生物类群的
ITS 序列进行比较得出属种划分的分子标准: 被
子植物大多数科属的 ITS 序列的种间差异值为
1． 20% ～ 10． 20%，属间差异值为 9． 60% ～
28． 80%。基于这一标准，张宏意等［44］得出单叶
血藤和大血藤的种间差异为 0． 32% ～ 2． 31%，从
分子数据上更支持将单叶血藤划到大血藤中; 向
建英等［45］从遗传组学研究得出 Begoni handelii
和 B． prostrata 的种间差异仅为 0． 556% ～
0． 696%，明显小于种间的差异值，认为二者在形
态上存在一定差别，且在地理分布上不同，应该是
起源于一较近的共同祖先，由于生境( 分布) 不同
而分化为两个分类群。本实验得出的结果中，大
叶藻与丛生大叶藻的种间差异为 0． 002 4，明显小
于屈良鹄等［43］提出的种间划分的分子标准，但二
者在形态上存在明显的差别，可能是由于各自的
进化环境不同而造成的。而矮大叶藻与大叶藻属
间的几种大叶藻的核苷酸最小差异值为19． 33%，
明显高于种间的差异值达到属间差异水平，从分
子数据上支持矮大叶藻与大叶藻、丛生大叶藻、宽
叶大叶藻之间的差异达到属的水平。TANAKA
等［12］和 KATO 等［11］建议将矮大叶藻所在的拟大
叶藻亚属提升到属的水平。虾形藻属的红须根虾
形藻与大叶藻属的属间差异最小的也为 35．
32%，明显高于屈良鹄等［43］提出的属间划分的分
子标准。
由于本研究所用实验样品仅有大叶藻、丛生
881
2 期 李 渊，等: 基于 matK、rbcL 和 ITS 序列的 5 种大叶藻系统发育研究
大叶藻、矮大叶藻和红须根虾形藻，尚缺少国内分
布的大叶藻科的宽叶大叶藻、具茎大叶藻和黑须
根虾形藻，因此在今后的工作中应补充相关样品，
开展形态学研究的同时，结合更多的分子标记对
我国大叶藻系统发育关系进行深入的探讨。
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091
2 期 李 渊，等: 基于 matK、rbcL 和 ITS 序列的 5 种大叶藻系统发育研究
Phylogenetic relationship in five Zosteraceae species based on
matK，rbcL and ITS partial sequences
LI Yuan1，SUN Dian-rong2，LI Wen-tao1，ZHANG Pei-dong1，JIANG Xin1，
GUO Dong1，GAO Tian-xiang1*
( 1． Fisheries College，Ocean University of China，Qingdao 266003，China;
2． South China Sea Fisheries Research Institute，Chinese Academy of Fishery Science，Guangzhou 510300，China)
Abstract: Fragments of the nuclear ribosome ( ITS ) and the chloroplast ( matK and rbcL ) regions were
successfully suitable for phylogenetic relationship analysis． With sequencing by PCR amplification，the paper
analyzed the phylogenetic relationship of 5 Zosteraceae species( Zostera marina，Z． japonica，Z． caespitosa，
Z． asiatica and Phyllospadix iwatensis ) ，which were collected from Ireland，Japan，Korea，China and
GenBank． Partial nucleotide sequences of matK，rbcL gene and ITS were analyzed for five Zosteraceae
species，and nucleotide composition analysis indicated a strong bias against cytimidine ( C ) in three
fragments． 172 nucleotide substitutions were found in ITS fragment，showing the high genetic polymorphism．
52 nucleotide substitutions were checked in matK gene and 20 nucleotide substitutions were checked in rbcL
gene，most of them were synonymous transitions at the third codon positions． The five species had a certain
degree of differentiation at the amino acid level． Based on partial sequences of matK，rbcL and ITS gene，
phylogenetic trees were constructed by NJ，MP，ML and Bayes methods and the results were consistent and
the phylogenetic trees showed three separate lineages． The minimum pairwise divergences percentage in the
samples of Z． japonica and other Zostera species was 19． 33% and much higher than the standard( 9． 60% －
28． 80% ) among genera of most angiosperm and it would be the generic rank from the molecular data． Based
on the synonymous nucleotide substitution rate of the rice chloroplast genome matK combined with rbcL
gene，we estimated the divergence time between 5 Zosteraceae species approximately arranged from Eocene
to Pliocene． The ITS sequences of all Z． marina samples were identical，which fell into the same cluster． It
was concluded that variation within ITS region of Z． marina was not correlated to their geographical
distance，and ITS region was unsuitable for identification of population groups on a regional or oceanic
scale． The paper further elaborated phylogenetic relationship of 5 Zosteraceae species，and also provided
theoretic basis for seagrass phylogeny in China．
Key words: Zostera; Phyllospadix; matK ; rbcL ; internal transcribed spacer; phylogenetic relationship
Corresponding author: GAO Tian-xiang． E-mail: gaozhang@ ouc． edu． cn
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