全 文 ：　[收稿日期] 2008 02 26
　[基金项目] 湖北省自然科学基金资助项目(2006ABA002)
　[第一作者简介] 朱云芬(1982 ),女 ,湖北荆门人 ,硕士研究生 ,研究方向为植物发育分子遗传学.
　[通讯作者] 李亚男 , E-mai l:yananlee@y ah oo.com .cn
薏苡乙醇脱氢酶基因(ADH1)3末端序列的克隆
　　朱云芬 ,陈大清 ,李亚男　(长江大学生命科学学院 ,湖北 荆州 434052)
[ 摘要]采用 3 -RACE技术 ,根据前一阶段已克隆的的薏苡(Coix lacrymajobi L.)乙醇脱氢酶基因(ADH1)
cDNA 片段(Accession DQ455071)设计特异性引物 , 克隆出 556 bp 的乙醇脱氢酶 3 末端 cDNA 序列 , 利用
DNAM EN 软件将获得序列与已知序列进行拼接 ,得到了 1 个 1 234 bp 的 cDNA 序列。
[ 关键词] 薏苡(Coi x lacrymajobi L.);乙醇脱氢酶基因 1(ADH1);3 -RACE
[ 中图分类号] Q78 [ 文献标识码] A　　[文章编号] 1673 1409(2008)01 S052 03
植物厌氧作为一种逆境因子一直以来被人们高度关注 ,高等植物的需氧组织在土壤渍水的情况下会
因为氧气利用率受阻而迅速死亡[ 1] 。在涝渍条件下 ,植物处于根系缺氧状态 ,乙醇发酵是厌氧胁迫时根系
的主要产能途径 ,而乙醇脱氢酶(alcohol dehydro genase ,ADH)是该代谢途径中起关键性作用的酶[ 2] 。耐
涝植物通过调节 ADH 、PDC等基因表达 ,增强乙醇发酵速率 ,促进 A TP 的生成 ,被认为是提高植物耐涝
能力的有效方法[ 3 , 4] 。薏苡是是一种耐涝植物 ,用栽培水稻的方法来栽培薏苡 ,可以增加产量[ 5] ,潜在的耐
涝性提示蕴含着丰富的耐涝基因资源。本研究的目的是采用 RACE 技术[ 6 ～ 8] ,从耐涝能力较强的薏苡中
分离出乙醇脱氢酶基因(ADH1)的 3 末端 cDNA 序列 ,对它的基本特征进行分析 ,这对于建立耐涝基因
资源 ,阐明植物耐涝的分子机理 ,繁育具备较高耐涝能力的作物品种有重要的理论及实际应用价值 。
1　材料与方法
1.1　材料与试剂
薏苡(Coix lacrymajobi L .)种子由长江大学生命科学学院分子生物学实验室保存 。SMARTS
RACE cDNA 扩增试剂盒购自美国 Clontech公司产品 ,总 RNA 抽提试剂盒购自 Invit rogen 公司 Trizol
试剂盒 ,pMD18-T Vector 购自 TaKaRa公司;各种限制性酶切酶购自 N EB 公司;DEPC 、去离子甲酰胺 、
二甲基甲酰胺 、Amp 、胰蛋白冻 、酵母 、Tris 、EDTA-Na2 、平衡酚等均购自武汉天源生物技术有限公司;
PCR引物由上海生物工程技术服务公司合成 ,大肠杆菌 DH5α由长江大学生命科学学院分子生物实验室
保存 。根据克隆的基因片段序列 ,以引物设计软件 Primer Primier 5.0为主 ,Oligo 6.0为辅 ,设计 2个基
因特异引物:
GSP1:5 -ACCCTGAGGCTCCCCTGGA TAAAGT -3
NGSP1:5 -GACGGCTGGGGTG TTGCTGTGCTG-3
1.2　总 RNA的提取及检测
取淹水胁迫 6 h 的薏苡根尖约 0.1 g 液氮迅速研磨 ,加入 1 mL 的 Invit rogen 公司的 Trizol reagent
试剂 ,按照说明书进行提取。提取的 RNA 总样品用 2%的琼脂糖进行电泳 ,同时使用紫外分光光度仪测
定样品的 D260/D280的值 ,检测 RNA的质量与完整性 。
1.3　逆转录 cDNA第 1链的合成
cDNA 第 1链的合成参照 Clonetech公司的 SMART TM RACE cDNA Amplication Kit的操作说明书
进行。以 1 ug 总 RNA 为模板 ,利用试剂盒提供的逆转录引物 ,在 Pow erScript逆转录酶作用下合成 3 -
RACE Ready cDNA 第 1链。
·52· 长江大学学报(自然科学版)　2008年 3月 第 5卷第 1期:农学Journal of Yangtze University(Nat Sci Edit)　Mar.2008 , Vo l.5 No.1:Agri Sci
1.4　3 -RACE-PCR
按照 SMART TM RACE cDNA Amplicat ion Kit试剂盒说明书要求及所提供的扩增体系和 U niversal
Primer A M ix(UPM)、Nested U niversi ty Prime r A(NUP)进行 3 -RACE 。3 -RACE扩增所采用的是巢
式 PCR扩增 ,第 1轮 PCR反应条件为:94 ℃5 min;94 ℃30 s , 68 ℃30 s ,72 ℃2 min ,30个循环后 72°C
10 min;取第 1轮 PCR产物为模板 ,进行巢式 PCR扩增 ,反应条件为 94 ℃5 min;94 ℃30 s ,65 ℃30 s ,
72 ℃2 min ,30个循环后 72 ℃10 min 。对扩增产物进行 1%琼脂糖凝胶电泳分析纯化后连接到 PMD-
18T 载体 ,筛选阳性重组质粒 ,送上海生物工程技术服务公司测序 。
2　结果分析
图 1　总 RNA 提取的电泳结果
Figure 1　Electrophoresis of total RNA
2.1　总 RNA的质量
总 RNA 的提取结果如图 1所示 ,总 RNA 有 3条清晰的电泳
条带 ,分别是28S RNA 、18S RNA 、5S RNA ,其中28S RNA条带亮
度为 18S RNA 条带的 2倍 ,说明各样品的总 RNA 的完整性较好 ,
RNA 未被降解;另外 , RNA样品的 D260/D280在 1.8 ～ 2.0之间 ,
证明 RNA的纯度较高 ,可以满足后续试验的要求。
2.2　3 -RACE结果分析
ADH1的 3 -RACE 产物经 1.0%琼脂糖凝胶电泳分析 ,结果
显示:第 1轮扩出大小为 800 bp 左右的带型 ,巢式 PCR扩出大小
为 500 bp左右的带型(图 2),与预期一致 。将巢式 PCR产物回收
M:1 000 bp DNA ladder;
1:巢式 PCR产物;2:第一轮 PCR产物
图 2　ADH1 的 3 -RACE PC R扩增结果
Figure 2　3-RACE PCR products of ADH1
后与 PMD-18T 连接 ,转化大肠杆菌 DH5α,提取质粒进行
PCR及双酶切检测;阳性菌株的测序结果显示 ,克隆的序
列由 556 bp碱基组成 ,与已知的 GenBank 中收录的薏苡
乙醇脱氢酶基因(ADH1)cDNA 片断的序列有重叠区。
2.3　ADH1基因 3 -RACE的序列分析
利用 DNAMEN 软件将 3 -RACE获得的序列与已知
序列进行拼接 ,得到了 1个 1 234 bp的 cDNA 序列 。经
EditSeq软件进行开放读码框(open reading f rame , ORF)
分析 ,终止密码为 TAG ,编码由 302个氨基酸残基组成的
蛋白质。BLAST 比对分析显示:薏苡 AD H1氨基酸序列
与其他物种的 ADH 氨基酸序列具有较高的相似性 。其
中玉米(Zea mays)[ 9] 、高粱(Sorghum bicolor)[ 10] 、珍珠粟
(Pennisetum glaucum)[ 11] 、早稻(Oryza sativa)[ 12] 、紫芒
(Miscanthus sinensis)[ 13] ,大麦(Hordeum vulgare)[ 14] 等
ADH 基因编码的氨基酸与薏苡的同源性高达 93%～
96%,说明该基因可能是进化保守性的看家基因 。利用 G EN EDOC 2.6.03 生成薏苡与其他几种植物
ADH 基因编码氨基酸序列的同源性比较结果如图 3 。
3　结论
利用 Clonetech公司的 SMARTTM RACE cDNA Amplif ication Kit 克隆出了薏苡乙醇脱氢酶基因
(AD H1)的 3 末端 cDNA序列 ,经与其他物种 ADH 基因的序列比对 ,相似性很高 ,初步证实为乙醇脱氢
酶基因的片段。这为后期从薏苡中克隆该基因的全长 cDNA 序列 ,并对其开展基因功能分析和转基因植
物研究奠定了良好的基础 。
·53·第 5 卷 第 1 期:农学 朱云芬等:薏苡乙醇脱氢酶基因(ADH1)3 末端序列的克隆 　
(黑色阴影部分代表完全相同的氨基酸)
图 3　薏苡与其他物种 ADH氨基酸序列同源性比较
Figure 3　The compression of the identity in amino-acid sequence coded by ADH between Coix and other species
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·54· 　 长江大学学报(自然科学版) 2008年 3 月
the CBF1 of A.thaliana in GenBank.Then CBF1 segment w as subcloned into pET22b
(+)and an expressional plasmid of pET22b-CBF1 was constructed.The plasmid was
transfo rmed into E.coli ER2566 , and was induced with IPTG.SDS-PAGE result showed
that a light st rip about 24 ku was expressed , which was predicated.
Key words:Arabidopsis thaliana ;CBF1 transcription f acto r;prokaryotic
052 Cloning of End Sequence of 3 cDNA of Alcohol Dehydrogenase(ADH1)from Coix
ZHU Yun-fen , CHEN Da-qing
LI Ya-nan 　 Co llege o f Li f e Science , Yang tz e Universi ty , J in gzhou , H ubei 434025 , China
Abstract:A 556 bp 3 cDNA end sequence by the 3 -RACE on the base of the alcohol de-
hydrogenase cDNA f ragment(Accession DQ455071)was cloned.A 1 234 bp cDNA se-
quence was integ rated w ith the sequence of accession DQ455071 and the one of 556 bp
3 end cDNA by the DNAM EN .
Key words:Coi x lacrgmajobi L;alcohol dehydrogenase(ADH1);3 -RACE
055 Effects of Water Depths and Substrate Types on the Distribution in Winter Buds of Vallis-
neria spinulosa in Poyang Lake
YUAN Long-yi 　
Laborator y o f Aquat ic Plant Biolog y ,Wuhan Botanica l Garden , Chinese Acad emy o f Sciences ,
Wuhan , Hubei 430074 , China;Col leg e o f Hort iculture an d Gardening ,Y angtz e Universi ty ,
J ingzhou , Hubei 434025 , Ch ina
LI Wei 　 Laboratory o f Aquat ic P lant Bio logy ,Wuhan Botan ica l Gard en , Chinese Academy o f S ciences ,
Wuhan , H ubei 430074 , China
Abstract:In o rder to unders tand characteristics of distribution in w inter buds of Val lis-
ner ia spinulosa Yan natural populations to w ater-level fluctuations and different sub-
s trate ty pes , the biomass and quantity of winter buds of V.spinulosa were inves tigated
in Banghu Lake ,Xianghu Lake and Dahuchi Lake which are located in Poy ang Lake na-
ture sanctuary.The results showed that the average density of the living winter buds in
Banghu Lake ,Xianghu Lake and Dahuchi Lake was(179±75.5),(97±51.3)and(41±
28.33)per square meter , respectively , and its average weight w as (24.06 ±9.35)g
DW ,(12.82±8.86)g DW , (7.06±5.12)g DW per square meter , respectively.Those
significant differences displayed a fairly cont rasting co rrelation w ith the water depth in
different habitat s.The majo rity of w inter buds in V.spinulosa were distributed in 10 ～
20 cm sediment depth , less in 20 ～ 30 cm sediment depth.The results about soil charac-
ter and nutrition showed that w inter bud fo rmation in V.spinulosa was easily found in
powder-sand sediment ty pe and inhibited from highly org anic sediments.
Key words:Poyang Lake nature sanctuary;Vallisner ia spinulosa Yan;w inter bud;water
depth;subst rate types
· Ⅶ ·