全 文 ：文章编号:1674 － 5566(2013)03 － 0334 － 07
山东半岛大叶藻不同地理种群遗传多样性和遗传结构分析
收稿日期:2012-07-11 修回日期:2013-03-14
基金项目:国家公益性行业(农业)科研专项(201003068) ;科技部对欧盟科技合作专项经费项目(0914)
作者简介:刘 坤(1987—) ，男，硕士研究生，研究方向为海藻生物学。E-mail:liukun198@ 126． com
通信作者:王飞久，E-mail:wangfj@ ysfri． ac． cn
刘 坤
1，2，刘福利
2，王飞久
2，孙修涛
2，汪文俊
2，丁昌玲
2，梁洲瑞
2，
马兴宇
1，2
(1．上海海洋大学 水产与生命学院，上海 201306;2．中国水产科学研究院黄海水产研究所 农业部海洋渔业可持续发
展重点实验室，山东 青岛 266071)
摘 要:应用 RAPD 技术，对自然分布于山东半岛莱州
湾、小石岛、俚岛、楮岛和汇泉湾的 5 个大叶藻种群的遗传
多样性和遗传结构进行了分析，并基于研究结果对山东半
岛大叶藻种群保护和移植修复提出了建议。实验用 10 条
RAPD引物共扩增出 42 条条带，多态条带 39 条，多态性
位点比率为 92． 86%。研究结果表明山东半岛大叶藻种
群具有较高的遗传多样性和较高的遗传分化;AMOVA 分
析显示 5 个种群 99． 68% 的变异来源于种群内部，而
0． 32%的变异来源于种群间;Mantel测试表明 5 种群遗传
距离与地理距离之间没有相关性;遗传多样性最低的是莱
州湾种群，应该得到优先保护;遗传多样性较高的是俚岛
种群和汇泉湾种群，可以作为山东半岛海草场移植修复的
首选种群。
研究亮点:国内学者对自然分布于我国的
大叶藻群体遗传学研究较少，遗传多样性是
海草床修复中需要考虑的重要因素。本研
究利用 RAPD技术对山东半岛大叶藻种群
遗传多样性和遗传结构进行了分析，并基于
保护遗传学观点，提出了优先保护种群以及
海草床移植修复优选种群，为我国大叶藻保
护和海草床修复提供了基础资料。
关键词:大叶藻;海草;遗传多样性;随机扩
增多态性 DNA 标记;分子方差分析;Mantel
测试
中图分类号:Q 943;S 917
文献标志码:A
大叶藻隶属于沼生目(Helobiae)、大叶藻科
(Zosteraceae)、大叶藻属(Zostera) ，广泛分布于我
国山东、河北和辽宁沿海。作为海草的一种，大
叶藻所形成的群落是近海生态系统中关键的组
成部分，具有重要的生态和经济价值［1 － 6］。国内
大叶藻资源的研究起步较晚，研究领域主要集中
在生物学、生态生理学等方面［1，6 － 10］。
目前，我国大叶藻种群正面临着环境恶化与
遗传多样性衰退的双重压力［7，11 － 12］，而国内学者
对大叶藻不同地理种群遗传多样性和遗传结构
的研究却鲜见报道［13 － 14］;遗传多样性是移植中
需要考虑的一个重要因素［15］，然而结合种群遗传
多样性的移植修复实验也未见报道。本实验采
用 RAPD技术对山东半岛大叶藻 5 个不同地理种
群的遗传多样性以及遗传结构进行了研究，以期
掌握山东半岛大叶藻不同地理种群的遗传多样
性和遗传结构现状，为我国沿海进行的大叶藻种
群保护、移植修复提供遗传学依据，同时也将充
实大叶藻保护遗传学资料，对其他海草种类也有
借鉴和参考价值。
1 材料与方法
1． 1 材料
本研究所用大叶藻样品分别采自山东半岛
的 5 个地区，包括:莱州湾、小石岛、俚岛、楮岛和
汇泉湾(图 1) ，采样时植株间至少间隔 2 m，每个
群落随机采集 20 株植株。采集好的样品用海水
初步清洗，装入封口袋，做好标记带回实验室。
1． 2 方法
1． 2． 1 DNA提取
取大叶藻适量的新鲜幼嫩茎叶，对 5 个种群
3 期 刘 坤，等:山东半岛大叶藻不同地理种群遗传多样性和遗传结构分析
的每株样品进行基因组 DNA 的提取，DNA 提取
的试剂盒选用天根植物基因组 DNA 提取试剂盒
(天根，北京)。提取的样品 DNA 用琼脂糖凝胶
电泳检测其完整性和纯度，－ 20 ℃冰箱保存备
用。
图 1 采样地点
Fig． 1 Sampling sites
1． 2． 2 PCR扩增
PCR反应体系:2 × ES Taq MasterMix(康为世
纪，北京)10 μL，ddH2O 8． 2 μL，Primer 0． 8 μL，
Template DNA 1 μL，总体积 20 μL。反应条件:94
℃ 5 min，94 ℃ 30 s，36 ℃ 40 s，72 ℃ 90 s，40 个
循环，72 ℃ 10 min。PCR扩增产物用 1%琼脂糖
凝胶电泳检测，在培清 JS-680C凝胶成像系统(培
清，上海)下成像保存。
1． 2． 3 数据处理与统计分析
将电泳图谱清晰且可重复的条带赋值为 1，
同一位置上的弱带且不重复或者未出现带的赋
值为 0，形成 1、0 数据矩阵。利用 POPGENE
Version 1． 32 计算种群内的遗传多样性指标以及
种群间的遗传差异指标，包括多态位点百分数
(percentage of polymorphic loci)、平均杂合度
(Nei’s gene diversity)、Shannon 多样性指数
(Shannon’s information index)以及遗传相似系数
(genetic identity)、遗传距离(genetic distance)、遗
传分化指数(Gst)、基因流(gene flow) ;运用 DCFA
1． 1［16］以及 AMOVA Version 1． 55 进行种群间遗
传结构分析;利用 NTSYS 2． 10e 基于遗传相似系
数矩阵构建 5 种群 100 个体的 UPGMA 聚类图;
利用 TFPGA Version 1． 3对5种群进行Mantel测试。
2 结果与分析
2． 1 引物筛选
利用 3 份不同地理位置的大叶藻材料进行
引物筛选，从50条RAPD引物中筛选到多态性高且
重复性好的 10 条引物。RAPD扩增条带在 250 ～
2 000 bp之间，图 2 为引物 S12 对小石岛种群 20
个体的扩增结果;10 条引物共扩增出 42 条条带，
多态条带 39 条，多态性位点比率为 92． 86%。
表 1 RAPD引物及其扩增结果
Tab． 1 RAPD primers and amplification results
引物 碱基序列 总条带数 多态性条带数 多态率 /%
S7 GGTGACGCAG 5 4 80． 00
S8 GTCCACACGG 4 4 100． 00
S11 GTAGACCCGT 4 4 100． 00
S12 CCTTGACGCA 6 6 100． 00
S17 AGGGAACGAG 3 3 100． 00
S79 GTTGCCAGCC 4 4 100． 00
S82 GGCACTGAGG 3 2 66． 67
S94 GGATGAGACC 4 2 50． 00
S97 ACGACCGACA 5 5 100． 00
S98 GGCTCATGTG 4 4 100． 00
2． 2 种群内遗传多样性
各种群扩增出的多态位点数为 17 ～ 31 不等，
其中莱州湾种群的多态位点最少，多态位点百分
率为 40． 48%，俚岛种群与汇泉湾种群的多态位
点相同，且多态位点最多，多态位点百分率为
73． 81%。在种群水平上，5 个种群的平均杂合度
和 Shannon多样性指数的范围分别为 0． 150 0 ～
0． 290 9 和 0． 222 0 ～ 0． 424 7，其中汇泉湾种群的
平均杂合度最高，而莱州湾种群的平均杂合度最
低，俚岛种群的 Shannon多样性指数最高，莱州湾
种群的 Shannon多样性指数最低。鉴于以上 3 个
指标，遗传多样性最低的是莱州湾种群，遗传多
样性最高的是俚岛种群和汇泉湾种群，并且这两
个种群的遗传多样性差异不大。对 5 种群的 100
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上 海 海 洋 大 学 学 报 22 卷
个体进行分析，多态位点数为 39，多态位点百分
率为 92． 85%，平均杂合度为 0． 359 3，Shannon 多
样性指数为 0． 529 0(表 2)。
图 2 引物 S12 扩增的 RAPD图谱
Fig． 2 The RAPD amplified pattern by primer S12
1 ～ 20． 20 个小石岛种群大叶藻样品;M．分子量标准 DL 2 000。
表 2 不同大叶藻地理种群 RAPD分析的遗传多样性
Tab． 2 RAPD polymorphisms of populations of Z． marina from different areas
多态位点数 多态位点百分率 /% Shannon多样性指数 平均杂合度
楮岛 24 57． 14 0． 314 3 0． 212 2
莱州湾 17 40． 48 0． 222 0 0． 150 0
俚岛 31 73． 81 0． 424 7 0． 289 9
小石岛 28 66． 67 0． 344 7 0． 230 0
汇泉湾 31 73． 81 0． 424 3 0． 290 9
全部个体 39 92． 85 0． 529 0 0． 359 3
2． 3 种群间的遗传关系
种群间遗传相似性指数和遗传距离的范围
分别为 0． 739 9 ～ 0． 856 4 和 0． 155 1 ～ 0． 301 3，
其中遗传相似指数最大值出现在俚岛种群和小
石岛种群之间，最小值出现在莱州湾种群和小石
岛种群之间;遗传距离最大值出现在小石岛种群
和莱州湾种群之间，最小值出现在俚岛种群和小
石岛种群之间。遗传分化指数(Gst)和基因流的
范围分别为0． 160 0 ～0． 361 5和 0． 883 3 ～2． 625 8，
遗传分化指数的最高值出现在小石岛种群和莱
州湾种群之间，最低值出现在俚岛种群和汇泉湾
种群;基因流最高值出现在俚岛种群和汇泉湾种
群，最低值出现在莱州湾种群和小石岛种群之
间。
基于 RAPD数据的 5 种群大叶藻的 AMOVA
分析结果(表 4)显示:99． 68%的变异来源于种群
内部，而 0． 32%的变异来源于种群间，且随机排
列检验显示种群间差异极显著(P ＜ 0． 001)。
表 3 不同地理种群大叶藻的遗传相似性指数(上三角)和遗传距离(下三角)
Tab． 3 Nei’s genetic identity (above diagonal)and genetic distance
(below diagonal)between five populations of Z． marina populations
楮岛 莱州湾 俚岛 小石岛 汇泉湾
楮岛 0． 842 3 0． 754 5 0． 794 9 0． 763 1
莱州湾 0． 165 8 0． 752 4 0． 739 9 0． 826 1
俚岛 0． 272 8 0． 284 5 0． 856 4 0． 853 3
小石岛 0． 229 5 0． 301 3 0． 155 1 0． 833 9
汇泉湾 0． 270 4 0． 191 1 0． 158 7 0． 181 7
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3 期 刘 坤，等:山东半岛大叶藻不同地理种群遗传多样性和遗传结构分析
表 4 大叶藻 100 个体的 AMOVA分析
Tab． 4 Analysis of molecular variance (AMOVA)for 100 individuals of Z． marina
变异来源 自由度 方差总和 变异组分 变异比例 P值
种群间 4 39． 20 0． 029 0． 32% ＜0． 001
种群群内 95 875． 55 9． 216 99． 68% ＜0． 001
总计 99 914． 75 9． 245 100%
表 5 大叶藻 5 种群两两配对的遗传分化指数(Gst)(上三角)和基因流(下三角)
Tab． 5 Pair-wise estimate of Gst genetic distance (above diagonal)and gene flow
(above diagonal)between the five populations of Z． marina
楮岛 莱州湾 俚岛 小石岛 汇泉湾
楮岛 0． 263 6 0． 268 9 0． 271 0 0． 266 9
莱州湾 1． 396 9 0． 312 5 0． 361 5 0． 245 0
俚岛 1． 359 5 1． 099 8 0． 178 1 0． 160 0
小石岛 1． 245 3 0． 883 3 2． 307 4 0． 198 5
汇泉湾 1． 373 4 1． 540 6 2． 625 8 2． 018 7
基于遗传距离矩阵构建 5 种群 100 个体的
UPGMA系统树(图 3)。5 种群 UPGMA系统树明
显分为 2 分支，俚岛、小石岛种群首先聚到一起，
之后与汇泉湾种群聚为一支，楮岛与莱州湾种群
聚为一支。100 个体 UPGMA 系统树显示，100 个
体明显分为 5 大分支，楮岛、小石岛、莱州湾种群
的个体全部聚到其种群所在的分支中，俚岛种群
的 19 个体聚到其它种群所在的分支中;而汇泉
湾种群中 8 个体与莱州湾种群的全部个体聚为
一支，其余个体与俚岛种群的 1 个体聚为一支。
对 5 种群遗传距离与地理距离数据矩阵进
行相关性检测，相关系数 r = － 0． 106 3(图 4)。
根据相关性原理，当 0． 7 ＜ r ＜ 0． 8，为弱相关性;
当r ＜ 0． 7，为极弱相关性或不相关。因此，5 种群
遗传距离与地理距离之间没有相关性。
3 讨论
本研究利用 RAPD 技术对自然分布于山东
半岛莱州湾、小石岛、俚岛、楮岛、汇泉湾 5 种群
大叶藻的遗传多样性和遗传结构进行了分析。
研究结果表明山东半岛大叶藻种群具有较高的
遗传多样性和较高的遗传分化，这与刘志鸿等［13］
的研究结果类似。而以往的研究中发现大叶藻
的遗传多样性比较低［17 － 18］，之所以造成这种差
异可能是由于所研究的大叶藻种群分布以及取
样范围不同。种群所承受的环境压力不同(如温
度、光照、底质、生物竞争等) ，所表现出的遗传多
样性和遗传结构也不同。大叶藻同时具有有性
生殖和无性生殖两种生殖方式，但是大量研究表
明大叶藻只进行有限的有性生殖［19］，这样就限制
了花粉的杂交和基因的流动。山东半岛沿岸的
海洋环流很容易造成一些独立的生境斑块，从而
造成了种群间的隔离，长时间的独立进化和互相
缺乏基因交流导致群体间较高的遗传分化。
AMOVA分析显示山东半岛 5 种群的变异几
乎全部来源于种群内部。地理距离较远的莱州
湾种群和楮岛种群遗传距离反而较小。5 种群
100 个体 UPGMA系统树显示并不是同一种群的
所有个体都聚在一支，而是部分种群的少数个体
与其他种群聚在一起。出现上述几种结果的原
因可能是山东半岛以前是一大片连续的海草场，
而本研究所选取的 5 种群是大海草场退化后的
小片段种群。在小片段种群恢复期间，由于大叶
藻以无性繁殖为主的生殖方式，导致其现有的遗
传结构也是以前大海草场的一部分。
海洋环境的变化以及人类的过度开发，导致
我国现存的大叶藻自然种群数量下降和生境片
段化，这会明显地改变种群遗传结构，增加近亲
繁殖和导致遗传多样性渐衰。物种的遗传多样
性是长期进化的产物，是其适应、生存、发展和进
化的前提，物种的遗传多样性越高或遗传变异越
丰富，对环境变化的适应能力就越强［20］;反之，具
有较低遗传多样性的物种则更容易受到环境变
化的影响。保护遗传学主张濒危物种保护对策
的制定必须同遗传因子和环境因子结合起来考
虑［21］。本研究中，遗传多样性最低的是莱州湾种
群，应该得到优先保护。
海草移植修复中不宜引入新的基因型，否则
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上 海 海 洋 大 学 学 报 22 卷
图 3 基于遗传相似系数构建 100 个体的
UPGMA系统树
Fig． 3 UPGMA tree of all individuals based
on the Nei’s genetic identity
CD-1 ～ CD-20．楮岛种群 20个体;LZW-1 ～ LZW-20．莱州湾种群
20 个体;HQW-1 ～ HQW-20． 汇泉湾种群 20 个体;LD-1 ～ LD-
20．俚岛种群 20 个体;XSD-1 ～ XSD-20．小石岛种群 20 个体。
图 4 5 种群遗传距离与地理距离数据
矩Mantel测试结果
Fig． 4 Result of Mantel test between genetic
distance data matrix and geographical
distance data matrix of five populations
会造成遗传污染［22］。新的基因型植株可能在短
期内大量繁殖，对土著植株造成较大的生存竞争
压力;而且不同的基因型植株有不同的生活习
性，新引进的基因型植株可能不适应新的生长环
境。从本地环境中引入移植修复植株是至关重
要的，但是不能在不同的地点进行简单的移植，
遗传多样性是移植中需要考虑的一个重要因素，
较低的遗传多样性可能不足以应对外界环境的
变化和繁殖策略的变化，相反较高的遗传多样性
可以应对外界环境的变化，并且可以减少自交的
几率。因此，移植修复是应该采用本地的遗传多
样性高的居群。本研究中，遗传多样性较高的是
俚岛种群和汇泉湾种群，可以作为山东半岛海草
场移植修复的首选种群。
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上 海 海 洋 大 学 学 报 22 卷
Analysis of genetic diversity and structure of Zostera marina populations in
Shandong Peninsula
LIU Kun1，2，LIU Fu-li2，WANG Fei-jiu2，SUN Xiu-tao2，WANG Wen-jun2，DING Chang-ling2，LIANG
Zhou-rui2，MA Xing-yu1，2
(1． College of Fisheries and Life Science，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306，China;2． Key Laboratory of
Sustainable Development of Marine Fisheries，Ministry of Agriculture，Yellow Sea Fisheries Research Institute，Chinese Academy of
Fishery Sciences，Qingdao 266071，Shandong，China)
Abstract:In the present study，random amplified polymorphic DNA (RAPD)molecular marker was used to
study the population genetic diversity and structure of five Zostera marina L． populations distributed in
Shandong Peninsula:Laizhou bay，Xiaoshi Island，Li Island，Chu Island and Huiquan Bay． Based on the
obtained results，suggestions for Z． marina population protection and for seaweed meadow restoration in
Shandong peninsula were put forward． In the experiment，42 bands were obtained by RAPD markers amplified
through 10 selected primers． The percentage of polymorphic bands was 92． 86% ． The results showed that the
populations in Shandong Peninsula had high genetic diversity and high genetic differentiation． The AMOVA
demonstrated that the inter-population component accounted for 99． 68% of the total variation，while the intra-
population component accounted for 0． 32% ． Mantel tests showed that 5 populations of Z． marina L． had no
correlation between genetic distance and geographic distance． The population in Laizhou Bay that showed the
lowest genetic diversity should be given priority protection． The populations in Li Island and Huiquan Bay that
showed highest genetic diversity can be used as the first choice for seaweed meadow transplanting restoration
in Shandong Peninsula．
Key words:Zostera marina L．;seagrass;genetic diversity;RAPD;AMOVA;Mantel test
043