全 文 ：湖 北 农 业 科 学 2016 年
收稿日期：2016－01－27
基金项目：河北省自然科学基金重点项目（C2013204141）
作者简介：王志伟（1980－），男，河北满城人，讲师，硕士，主要从事作物育种研究，（电话）13833225040（电子信箱）bdwangzhiwei＠126．com；
通信作者，张桂寅（1963－），男，研究员，博士，主要从事棉花育种研究。
第 55 卷第 8 期
2016年 4 月
湖北农业科学
Hubei Agricultural Sciences
Vol． 55 No.7
Apr.，2016
2
1
1
Jan
． 8
棉花是重要的经济作物，不仅是优质天然纤维
的主要来源， 而且种子中含有极为丰富的蛋白质。
棉子蛋白是优质的蛋白质原料，可以提高动物生产
性能，降低饲料成本 ［1］。 中国每年有 1 000 万 t 以上
的棉子，年产棉子饼、粕达 600 万 t 以上 ［2］。 根据资
料中国棉花棉子蛋白质含量为 22％～24％［3］，是世界
上仅次于大豆的重要植物蛋白质资源。 目前全球大
面积栽培的棉花品种主要是陆地棉（Gossypium hir-
sutum），其种仁含有棉酚及其衍生物，人及非反刍动
物食用后会出现中毒现象，轻则头晕、呕吐，重则引
起死亡。 通过选育无腺体性状已获得无酚或低酚棉
花品种，并已取得卓越成效，实践证明采取控制腺
体性状来控制棉酚是很有效的策略［4］。 然而从分子
生物学角度，如何调控棉酚，探索棉酚与腺体之间
的关系，达到有效控制棉酚和腺体，这都是亟待解
决的问题。 棉酚是倍半萜次生代谢物质，其生物合
成代谢是异戊二烯途径，其中倍半萜环化酶—杜松
烯合酶（Delta－cadinene sythase）是该途径的关键酶
之一［5，6］。本研究拟采用同源克隆结合棉花 D基因组
序列克隆陆地棉参与棉酚合成的关键酶，为弄清棉
酚与腺体形成的机制奠定基础。
1 材料与方法
1．1 试验材料及处理
棉花幼苗采用无菌培养。 精选大小均匀、无病
虫害的棉花种子，用 0．1％的升汞消毒 8 min，蒸馏水
冲洗干净，种植于装有 MS培养基的锥形瓶中。培养
室温度控制在昼温 25 ℃，夜温 20 ℃，光照周期 12 h，
陆地棉棉酚合成关键基因杜松烯合酶基因克隆
及序列差异分析
王志伟 1，张 艳 2，薛 薇 1，张桂寅 2
（1．保定职业技术学院，河北 保定 071051；2．河北农业大学，河北 保定 071051）
摘要：利用同源克隆法克隆获得有酚陆地棉（Gossypium hirsutum）杜松烯合酶（Delta－cadinene sythase）
基因。 结果表明，该基因长 ORF 为 1 665 bp，编码 551 个氨基酸，具有类戊二烯的保守结构域，有酚和低
酚陆地棉之间，该基因存在序列差异。
关键词：陆地棉（Gossypium hirsutum）；杜松烯合酶；克隆；差异序列
中图分类号：S562 文献标识码：A 文章编号：0439－8114（2016）08－2114-03
DOI:10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.08.051
Cloning of Gossypium hirsutum Phenol Synthesis of Keys Genes Delta－cadinene Sythase
and Analysis of Its Variame Sequence
WANG Zhi－wei1， ZHANG Yan2， XUE Wei1， ZHANG Gui－yin2
（1．Baoding Vocational and Technical College，Baoding 071051，Hebei，China；2．Agricultual University of Hebei，Baoding 071051，Hebei，China）
Abstract： The gene named Delta－cadinene sythase in this study was obtained from using homology－based cloning method for
cloning． The results showed that this gene contained an ORF of 1 665 bp in length encoding 551 amino acids with the con-
servative domain structure of class pentadiene．Between low phenol and phenolic G． hirsutum， the gene exist sequences of dif-
ferences．
Key words： Gossypium hirsutum； Delta－cadinene sythase； clone； sequence of variance
第 8 期
光照度 5 000 lx。
待棉花幼苗子叶完全展开时，选取生长健壮、大
小均匀一致的植株进行取样。 称取 0．1 g 用 0．1％
DEPC水冲洗干净，在液氮中充分研磨后置于－70 ℃
冰箱保存备用。
1．2 总 RNA的提取与 cDNA的合成
取保存的样品，采用 EASYspin RNA 快速提取
试剂盒（重庆波尔公司）提取总 RNA，具体步骤参照
试剂盒说明书。 采用紫外分光光度计测定 RNA 的
浓度和纯度，琼脂糖凝胶（1．2％）电泳检测 RNA 的
质量 。 采用 ReverTra Are qPCR RT Master Mix
with gDNA Remover （TOYOBO）试剂盒，按照试剂
盒说明书操作合成第一链 cDNA，用于基因克隆。
1．3 种子序列及基因全长的获得
1） 利用已经发表的其他物种上相关基因的序
列，采用 Blast程序在 NCBI 网站进行棉花 EST 数据
库比对，寻找出高度同源的序列，将同源序列进行
拼接组装成重叠群（Contig）。
2）以重叠群为种子序列，再次 Blast 检索棉花
的 EST 数据库和序列组装，延伸重叠序列，重复上
述过程，直至没有新的 EST 检出即重叠群序列不再
延伸，从而生成最终的最长新生序列。 将新获得的
种子序列与公共数据库棉花 D 基因组比对，找到该
序列对应的基因全长，以该全长序列为参考设计引
物，以陆地棉 cDNA为模版扩增，并通过测序获得目
的基因全长序列。
1．4 目的基因的 PCR扩增
以上述反转录得到的棉花 cDNA 为模版，进行
PCR 扩增。 PCR 扩增程序为 94 ℃预变性 5 min；
94 ℃变性 45 s，58 ℃退火 45 s，72 ℃延伸 105 s，23
个循环；72 ℃延伸 10 min。 将 PCR 扩增目的条带回
收纯化后 pMD18－T 载体连接并转化到大肠杆菌
TOP10，挑取阳性克隆、提取质粒，并送至生工生物
工程（上海）股份有限公司测序。
1．5 目的基因的生物信息学分析
通过 NCBI 的 ORF finder 寻找杜松烯合酶基
因的开放读码框，通过 Blast 和 CDD 数据库分析氨
基酸序列和结构域； 通过 ProtParam（http：//web．ex-
pasy．org/protparam/）在线分析蛋白质的等电点、相对
分子质量等理化性质；利用 SignalP3．0（http：//www．
cbs．dtu．dk/services/SignalP－3．0/） 进行信号肽分析；在
NCBI 数据库 （http：//www．ncbi．nlm．nih．gov/）和中国
农业科学院棉花研究所棉花基因组数据库（http：//
cgp．genomics．org．cn/page/cn/index．jsp） 中 Blast 杜松
烯合酶基因的同源基因，并进行序列比对分析。
2 结果与分析
2．1 RNA提取与 cDNA的合成
对提取的 RNA 进行 1．2％的琼脂糖电泳检测，
上样量为 1 μL， 从图 1 中可以看出，28 s RNA、18 s
RNA 特征谱带无拖尾现象， 比例约为 2∶1，RNA 完
整，无降解，质量高，符合试验要求。反转录 cDNA主
要集中在 250～1 500 bp（图 2），说明质量较好，可用
于后续试验。
2．2 杜松烯合酶全序列的克隆
基于 cDNA 全序列设计引物，PCR 扩增后获得
了 1 851 bp 的目的片段（图 3），其中包括 1 665 bp
的开放读码框（ORF），29 bp 的 5’UTR 和 157 bp 的
3’UTR。经测序分析该全序列与拼接序列完全相同，
其中包括 1 665 bp 的 ORF区域。
2．3 杜松烯合酶氨基酸序列及保守结构域分析
生物信息学分析表明，该基因编码 551 个氨基
酸残基（图 4），具有类戊二烯的保守结构域，表明克
隆得到的序列为杜松烯合酶基因序列。
2．4 杜松烯合酶基因的生物信息学分析
通过在线 ProtParam 分析杜松烯合酶蛋白质的
理化性质，推测其分子式为 C2865H4413N759O860S24，相对
分子质量约为 64 ku，理论等电点（pI）为 5．3。 Sig-
nalP3．0 信号肽分析显示该基因内部没有信号肽，
如图 5 所示。
图 1 棉花总 RNA 电泳情况
28 s RNA
18 s RNA
1．NNA Marker；2． cDNA
图 2 反转录 cDNA 电泳
1 2
1：PCR产物；M：DL2000 Marker
图 3 杜松烯合酶基因 ORF PCR 产物
M 1
王志伟等：陆地棉棉酚合成关键基因杜松烯合酶基因克隆及序列差异分析 2115
湖 北 农 业 科 学 2016 年
2．5 有酚与低酚陆地棉种杜松烯合酶基因的序列
差异比较
将克隆得到的杜松烯合酶基因与数据库中来
自于低酚陆地棉的该基因 （U88318．1） 进行序列比
较，发现 2个基因存在序列差异，如图 6所示。 推测
这些序列内部的差异位点对有酚和无酚棉种基因
功能具有重要作用。
3 小结与讨论
由于棉子只是棉花生产的副产品， 长期以来，
棉花育种围绕棉纤维产量和品质展开。 开展棉子营
养品质的研究与改良还很有限，加上常规育种存在
检测成本高及检测效率低等不足，利用基因工程手
段结合常规育种可以对棉子品质改良带来更广阔
的前景［7］。
本研究通过同源克隆法获得了有酚陆地棉棉
酚合成酶关键基因—杜松烯合酶基因的 cDNA全序
列， 通过 Blast 分析发现该基因编码一个含有 551
氨基酸残基的多肽，保守结构域分析显示其具有类
戊二烯的保守结构域。 有酚与低酚陆地棉中序列差
异比对发现，杜松烯合酶基因在二者间具有高度的
同源性（99．16％），但也存在序列间的多态性，这些
位点的变异可能是导致 2 个棉花品种在棉酚合成
方面的不同。
参考文献：
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花学报，1995，7（2）：94－99．
图 4 杜松烯合酶编码氨基酸序列及保守域分析
图 5 杜松烯合酶蛋白质信号肽预测
0 10 20 30 40 50 60 70
位置
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
得
分
图 6 杜松烯合酶基因序列差异比较
2116