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濒危树种金钱松RAPD体系的建立和遗传多样性分析



全 文 :金钱松 Pseudolarix amabilis 又名金松, 是中国特有的单种属植物。 地质年代的白恶纪金钱松曾经在
亚洲、 欧洲、 美洲都有分布, 更新世的冰河时代各地金钱松都相继灭绝, 唯有中国长江中下游残留少
数, 成为现今仅存于中国的单属单种特有的植物 [1-4]。 由于其特殊的分类地位, 金钱松在裸子植物松科
Pinaceae系统发育、 古生态和古气候的研究方面具有重要意义。 这一宝贵的植物遗产被中国定为国家二
级保护植物, 分布于江苏、 安徽、 浙江、 江西、 湖南等地, 喜光爱肥, 适宜酸性土壤。 金钱松树干通
直, 材性优良, 纹理直, 耐水湿, 可供建筑、 桥梁、 船舶及家具等用材, 而且树形优美, 秋季叶呈金黄
色, 是优良的绿化和庭院观赏树种。 种子可榨油, 树皮和根皮(中药名为土槿皮或土荆皮)有止痒杀虫的
浙 江 农 林 大 学 学 报, 2011, 28(5): 815-822
Journal of Zhejiang A& F University
濒危树种金钱松 RAPD体系的建立和遗传多样性分析
高燕会1, 樊民亮2, 骆文坚2, 黄华宏1, 童再康1
(1. 浙江农林大学 生物技术研究所, 浙江 临安 311300; 2. 浙江省林业种苗管理总站, 浙江 杭州 310020)
摘要: 通过优化随机扩增多态性 DNA(RAPD) 反应体系, 对浙江省不同来源的金钱松 Pseudolarix amabilis 进行遗传
多样性分析。 结果表明: 18条随机引物在 62 个样品中可检测到 172 个可重复位点, 其中多态性位点有 170 个, 多
态性比率为 99.2%。 聚类分析的结果表明: 同一来源金钱松材料聚为一类, 说明金钱松天然群体的 RAPD 多态性分
类和其地理分布有一定的关系, 但也有特殊个体不一致, 表明金钱松天然种群体存在较高的遗传多样性, 并建议
对金钱松进行就地保存和迁地保存。 图 2表 3参 31
关键词: 林木育种学; 金钱松; 遗传多样性; 随机扩增多态性 DNA (RAPD); 迁地保护
中图分类号: S722.3 文献标志码: A 文章编号: 2095-0756(2011)05-0815-08
RAPD analysis of genetic diversity for Pseudolarix amabilis:
a critically endangered plant
GAO Yan-hui1, FAN Min-liang2, LUO Wen-jian2, HUANG Hua-hong1, TONG Zai-kang1
(1. Research Institute of Biotechnology, Zhejiang A & F University, Lin’an 311300, Zhejiang, China; 2. Forest
Tree Seed and Stock Master Station of Zhejiang Province, Hangzhou 310020, Zhejiang, China)
Abstract: In order to protect germplasm resources of endangered plant: Pseudolarix amabilis, genetic diver-
sity of Pseudolarix amabilis from different sources in Zhejiang Province were analyzed using an optimal protocol
of random amplified polymorphism DNA (RAPD) followed by a cluster analysis in this study. Results showed
that for 62 individuals with 18 random primers, 172 repetitive loci were detected, among which 170 were
polymorphic for a species level polymorphic loci rate of 99.2%. The cluster analysis showed that materials from
the same sources were classified together. Thus, RAPD polymorphism classification for natural populations of
P. amabilis was mostly related to geographic distribution, genetic diversity was high among the P. amabilis pop-
ulation, and both in situ preservation and ex-situ conservation were possible. [Ch, 2 fig. 3 tab. 31 ref.]
Key words: forest tree breeding; Pseudolarix amabilis; genetic diversity; random amplified polymorphism
DNA; ex-situ conservation
收稿日期: 2010-11-08; 修回日期: 2011-02-28
基金项目: 浙江省科技计划项目(2006C12059-4; 2006C22064)
作者简介: 高燕会, 副教授, 博士, 从事植物基因工程与遗传改良研究。 E-mail: Gaoyanhui408@126.com。 通
信作者: 童再康, 教授, 博士, 从事林木遗传育种和彩叶花木培育研究。 E-mail: zktong@zafu.edu.cn
浙 江 农 林 大 学 学 报 2011 年 10 月 20 日
功能, 外用于治疗手脚癣、 神经性皮炎、 湿疹[5 - 6]等。 目前, 国内外对金钱松的研究多集中在生物学和生
理学特征方面[7], 例如叶表皮的扫描电镜观察[8]、 种子品质[9]、 栽培繁殖技术[10 -11]、 生长情况[11]、 化学成
分研究[12]。 也有研究金钱松细胞分类学的报道, 认为根据其核型分析, 应该单独建立一个金钱松亚科[13-14]。
零星的还有组织培养 [15]的报道。 而对金钱松遗传多样性的研究报道较少。 随机扩增多态性 DNA(radom
amplified polymorphic DNA, RAPD)分子标记技术操作简单易行, 具有多态性高, 无需活材料, 能实现全
基因组无偏取样和无组织特异性等, 在濒危植物遗传变异方面有较为广泛的应用 [16 -18]。 此外, 还广泛地
应用于松类植物遗传多样性和遗传结构的研究中, 如多脂松 Pinus resinosa, 欧洲赤松 Pinus sylvestris,
辐射松 Pinus radiata, 红松 Pinus koraiensis, 黄山松 Pinus taiwanensis, 马尾松 Pinus massoniana等树种[19-24]。
本研究采用 RAPD 分子标记技术对浙江省内不同来源的金钱松遗传多样性进行研究, 旨在为合理地保
护、 利用与开发金钱松遗传资源提供可靠的科学依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料
供试材料采自浙江省安吉县灵峰寺林场, 共 9 个来自金钱松天然林的 62 个单株(表 1), 采集叶芽,
于-70 ℃的低温冰箱中保存备用。
1.2 试验方法
1.2.1 金钱松基因组 DNA 的提取 金钱松基因组 DNA 的提取采用十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)-硅珠
法[25]。
1.2.2 金钱松随机扩增多态性 DNA-聚合酶链式反应(RAPD-PCR)扩增体系的建立 [25-27] 针对 Taq DNA
聚合酶量, 镁离子(Mg2+), 模板 DNA, 三磷酸碱基脱氧核苷酸(dNTPs)和引物, 采用 5 因子 4 水平的正
交设计 L16 (45)设计方案详 (表 2)进行试验, 共 16 个处理, 重复 2次·处理-1, 在 Gene Amp PCR System
9700扩增仪上进行 PCR 扩增。 RAPD-PCR 扩增反应程序为 94 ℃预变性 4 min, 38 个 PCR 循环(94 ℃变
性 30 s, 38 ℃退火 30 s, 72 ℃延伸 2 min), 72 ℃延伸 7 min。 扩增的反应产物用 10.0 g·kg-1的琼脂糖
凝胶电泳检测, 于 Gel Doc XR凝胶成像系统拍照分析。
编号 代号 来源 编号 代号 来源 编号 代号 来源 编号
1 苳 1号 17 临安 5号 31 九亩 1号 安吉 47
2 苳 2 号 18 临安 6号 临安 32 九亩 2号 三川 48
3 苳 3 号 19 临安 7号 33 九亩 3号 林场 49
4 苳 22 号 20 临安 8号 34 九亩 4号 50
5 苳 23 号 安吉
上市

21 临安 9号 35 章村 1号 安吉 51
6 苳 27 号 22 大 8-2号 36 章村 2号 章村 52
7 苳 28 号 23 大 9-2号 37 大溪 1号 53
8 苳 50 号 24 大 10号 安吉

38 大溪 3号 安吉 54
9 苳 54 号 25 大 63-2号 39 大溪 4号 大溪 55
10 苳 61 号 26 大 64-1号 40 姚 1号 56
11 苳 65 号 27 溪 1号 41 姚 2号 57
12 长兴 1 号 28 溪 2 号 嘉兴

42 姚 3号 安吉 58
13 长兴 2 号
长兴县
29 溪 3 号 43 姚 4号 姚村 59
14 长兴 3 号 30 44 姚 5号 60
15 长兴 4 号 45 姚 6号 61
16 长兴 5 号 46 姚 7号 62
代号
姚 8号
姚 9号
姚 10号
姚 11号
姚 12号
姚 13号
姚 14号
姚 15号
姚 16号
姚 17号
姚 18号
姚 19号
姚 20号
姚 21号
姚 22号
姚 23号
来源
安吉
姚村
表 1 供试材料编号及其来源
Table 1 Code and source of the materials investigated
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第 28 卷第 5 期 高燕会等: 濒危树种金钱松 RAPD 体系的建立和遗传多样性分析
1.2.3 不同退火温度的梯度试验 用以上处理条件所得到的最佳反应体系进行退火温度梯度试验, 设置
退火温度。 在 PCR Express(HyBAID)扩增仪上自动生成 12个温度梯度: 30.0, 30.3, 30.9, 31.8, 32.9,
34.7, 35.5, 36.9, 38.4, 39.3, 39.8, 40.1 ℃, 比较退火温度对电泳谱带的清晰度和数量的影响, 从而
确定最佳退火温度。
1.2.4 引物筛选 引物筛选包括初筛和复筛。 用 1个样品对 200个随机引物进行初筛, 选择谱带清晰的
引物用于复筛。 复筛时用 4 个不同种源各 1 个样品进行扩增, 选择出清晰、 多态性较高的引物用于
RAPD-PCR扩增。
1.2.5 数据统计分析 对金钱松 62 个单株进行 RAPD-PCR 扩增的电泳谱带总条数和多态性条带进行统
计。 根据分子标记在相同电泳迁移率的有无统计得到所有位点的二元数据; 有 DNA 扩增有带记为 1,
无带记为 0, 强带和可分辨的弱带赋值为 1。 扩增条带与标准分子量的迁移率相比对照, 相同引物扩增
出来的同一长度(同一电泳迁移率)的带视为同一位点。 将得到的二元数据应用 SPSS 16.0 软件进行分析,
并计算其欧氏遗传距离, 按 Average Linkage 对金钱松种质资源进行聚类分析, 建立聚类树状图。
2 结果与分析
2.1 金钱松 RAPD-PCR最佳反应体系的建立
2.1.1 正交试验的直观分析 根据本试验的正交设计进行 PCR的扩增结果和电泳检测, 依据琼脂糖电泳
条带的强弱和杂带的多少做直观分析。 正交试验设 PCR扩增结果是由镁离子(Mg2+), dNTPs, 引物, Taq
DNA 聚合酶和模板 DNA 等因素综合作用的结果, 因而扩增结果存在明显差异。 第 1, 2, 3, 4 组合谱
带较弱, 其原因可能是由于 TaqDNA 聚合酶的浓度太低而引起的; 由于 TaqDNA 聚合酶的浓度一定时,
镁离子(Mg2+)浓度的过低(第 5, 6, 9, 10组合扩增不出条带), 而镁离子(Mg2+)浓度过高(第 8 组合扩增
条带拖尾且模糊) 会影响扩增的效果, 第 7 组合条带清晰且多态性高; 当 Taq DNA 聚合酶和镁离子
(Mg2+)浓度浓度升高时, 会扩增出非特异性条带(如第 11, 12组合)。 通过多因素综合比较选择第 7组合
(1.0 × 16.67 nkat TaqDNA 聚合酶, 2.5 mmol·L-1镁离子(Mg2+), 50 ng 模板DNA, 0.1 mmol·L-1 dNTPs,
0.5 μmol·L-1引物)扩增的谱带不但多态性好, 重复性好, 且谱带清晰, 是金钱松 RAPD-PCR 扩增的最
表 2 PCR扩增体系各成分因素-水平正交设计表 L16(45)
Table 2 Orthoronal design for PCR
编号 Taq酶/nkat Mg2+/(mmol·L-1) 模板 DNA /ng dNTPs/(mmol·L-1) 引物/(μmol·L-1)
1 0.5×16.67 1.5 20 0.10 0.25
2 0.5×16.67 2.0 30 0.15 0.50
3 0.5×16.67 2.5 40 0.20 0.75
4 0.5×16.67 3.0 50 0.25 1.00
5 1.0×16.67 1.5 30 0.20 1.00
6 1.0×16.67 2.0 20 0.25 0.75
7 1.0×16.67 2.5 50 0.10 0.50
8 1.0×16.67 3.0 40 0.15 0.25
9 1.5×16.67 1.5 40 0.25 0.50
10 1.5×16.67 2.0 50 0.20 0.25
11 1.5×16.67 2.5 20 0.15 1.00
12 1.5×16.67 3.0 30 0.10 0.75
13 2.0×16.67 1.5 50 0.15 0.75
14 2.0×16.67 2.0 40 0.10 1.00
15 2.0×16.67 2.5 30 0.25 0.25
16 2.0×16.67 3.0 20 0.20 0.50
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图 1 正交试验 PCR产物电泳图
Figure 1 Theelectrophoresis map of PCR products of the orthogonal tests
佳反应体系。
2.1.2 金钱松 RAPD-PCR最佳退火温度的确定 退火温度是影响 PCR的重要因素之一。 退火温度不仅
与引物序列有关, 还与物种 DNA的序列密切相关[28], 因此, 确定最佳退火温度对获得稳定可靠的 ISSR-
PCR 结果非常重要 。 金钱松 RAPD-PCR 温度梯度 PCR 的电泳结果见图 1, 在 12 个温度梯度下
30.0, 30.3, 30.9, 31.8, 32.9 和 34.7 ℃扩增的条带较弱, 不能正确地表达其引物的多态性, 35.5, 36.9
和 38.4 ℃引物扩增出清晰明亮的 RAPD 条带。 39.3, 39.8 和 40.1 ℃温度过高时, 扩增出的条带有拖尾,
所以退火温度过高或过低都会影响到 PCR 扩增条带的清晰度和多态性的正确表达, 综合多方面的因素,
最终选择 38.0 ℃为金钱松 RAPD-PCR扩增最适宜的退火温度。
2.2 扩增产物的多态性分析
通过初筛和复筛共得到的 18 条
多态性引物(表 3), 18 条 RAPD 引物
对 62 个供试材料进行 RAPD-PCR 扩
增, 共扩增出 172 条带, 其中 170 条
带具有遗传多态性 , 多态性比率为
99.2% 。 在 62 个供试材料中 , 不同
RAPD 引物的总位点差异较大, 从 3~
20条不等, 平均为 9.56 条, 扩增出的
DNA 片段大小分布为 200 ~ 3 000 bp;
其中扩增条带数最多的为引物 S53,
共扩增出 20条带, 说明不同引物与供
试材料总 DNA部分区域的同源性有较
引物 序列 5’-3’ 扩增条带 多态性条带 多态性比率/%
S43 GTCGCCGTCA 15 14 93.3
S53 GGGGTGACGA 20 20 100
S90 AGGGCCGTCT 13 13 100
S97 ACGACCGACA 12 11 91.7
S99 GTCAGGGCAA 8 8 100
S102 TCGGACGTGA 6 6 100
S103 AGACGTCCAC 8 8 100
S104 GGAAGTCGCC 8 8 100
S121 ACGGATCCTG 8 8 100
S122 GAGGATCCCT 5 5 100
S123 CCTGATCACC 7 7 100
S124 GGTGATCAGG 10 10 100
S125 CCGAATTCCC 10 10 100
S127 CCGATATCCC 3 3 100
S132 ACGGTACCAG 10 10 100
S147 AGATGCAGCC 7 7 100
S152 TTATCGCCCC 8 8 100
S180 AAAGTGCGGC 14 14 100
平均值 9.6 9.4 99.2
表 3 18个引物扩增出 DNA片段数
Table 3 DNA fragments amplified with 18 primers
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第 28 卷第 5 期
大差异。 可以说明: 金钱松种子园群体内的 DNA 多态性是很丰富的, 遗传变异幅度很大, 可能与野生
类群分布大范围较广, 分布区内环境复杂多样有关, 也可能同其复杂的遗传背景与起源有关, 因而这些
丰富的变异类型为选育观赏新品种奠定了物质基础。
2.3 聚类分析
将 18 条引物扩增后得到的二元数据应用 SPSS 16.0 软件进行分析, 对供试材料根据 RAPD 标记欧
氏遗传距离, 按 Average Linkage对 62份金钱松种质资源进行聚类分析, 建立聚类树状图(图 2)。 由图 2
中以看出, 利用 RAPD 分子标记的结果可以将 62 份金钱松种质资源聚为三大类群: 第一大类群是包括
由采集于安吉大涌千、 安吉三川林场、 安吉章村、 安吉大溪以及安吉姚村的不同材料, 第二大类包括采自
长兴、 临安以及嘉兴的材料, 第三大类包括采自安吉上市乡的材料, 其中, 同一来源的材料几乎都聚在
一起, 说明金钱松天然群体 RAPD的多态性分类和金钱松的地理分布有一定的关系。 但也有例外, 如来
自临安野生种群的 17号和来自长兴野生种群的 16号就分别和来自安吉大汗千的野生种群聚在一起, 可能
是遗传变异的结果; 来自安吉大溪的 39 号较为特殊, 与其他个体的遗传距离为 0.280 0 ~ 1.255 7, 表
明金钱松天然种群内存在较高的的遗传多样性。
3 讨论
3.1 金钱松遗传多样性分析
遗传多样性是指种内基因的变化, 包括种内不同的种群间和同一种群内个体的遗传变异, 种内多样
性是物种及以上各水平多样性的最重要来源。 遗传变异、 生活史特点、 种群动态及其遗传结构等决定或
影响着一个物种与其他物种及其环境相互作用的方式, 而且种内的多样性是一个物种对人类影响进行反
应的决定因素。 种内的遗传多样性多发生在分子水平, 并且都与核酸的理化性质紧密相关, 新的变异是
突变的结果[29]。
濒危植物的遗传多样性水平一般较低。 本研究通过 RAPD技术研究了浙江省内的金钱松的多态性位
点的比率是 99.2%, 这一结果表明: 分布于浙江省的金钱松居群具有较为丰富的种内遗传多样性, 这与
刘建锋等 [16-17]对濒危植物崖柏 Thuja sutchuenensis 的遗传多样性的研究结论相一致: 濒危植物遗传多样
性具有一定的变化范围。 说明并非所有的珍稀濒危植物都存在低水平的遗传多样性。
本研究通过 RAPD分子标记得到的金钱松的聚类图中, 同一来源的材料几乎都聚在一起, 但也有个
别的材料和其地理分布并不完全相同, 如来自临安的 17 号、 来自长兴的 16 号以及来自安吉大溪的 39
号, 这可能是由于不同地理条件的环境因素或者是由于种群内的基因突变所引起的, 这些突变经自然选
择一些中性突变通过随机过程整合到基因组中, 即可形成丰富的分子水平丰富的遗传多样性。
3.2 金钱松种质资源的保护策略
造成金钱松濒危的原因主要有: 一是残存的个体稀少, 分布零星, 加上人为破坏, 使其生存环境受
到严重威胁, 资源日渐减少; 二是金钱松结实有大小年之分, 一般 3 ~ 5 a 丰产 1 次, 对其大量繁殖有
明显地影响。
本研究中, 金钱松的遗传多样性非常丰富, 能为植物遗传改良提供理论指导。 通过对金钱松种子园
的遗传结构分析可以获得群体遗传多样性、 遗传变异分布式样等方面的重要数据, 对实现物种的有效管
理和制定合理的保护策略有重要参考价值 [29 - 30]。 因此, 结合金钱松的群体遗传多样性, 对现存的金钱松
种质资源采取就地保存策略时, 重视大范围群体内不同类型个体的保存, 尽可能防止人为破坏带来的遗
传资源的流失。 另一方面, 由于浙江省内金钱松的遗传多样性较丰富, 因此, 在对金钱松种质资源实施
保存时, 不能仅考虑到群体内不同个体的保存, 同时也应对不同地理区域的群体进行保存, 可以进行迁
地保护[32], 尽可能多地收集其他地区的金钱松种质材料, 建立种质资源库。 本研究即是通过对建立浙江
省安吉县灵峰寺林场的金钱松的种子园, 可以为此加大种群间的交换, 为基因交流和重组创造条件, 以
保存孑遗金钱松的遗传多样性和金钱松的种质资源。
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高燕会等: 濒危树种金钱松 RAPD 体系的建立和遗传多样性分析 819
浙 江 农 林 大 学 学 报 2011 年 10 月 20 日
图 2 金钱松种质资源聚类图
Figure 2 Dendrogram of Pseudolarix amabilis germ plasm resource
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第 28 卷第 5 期
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浙 江 农 林 大 学 学 报 2011 年 10 月 20 日
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