全 文 ：微管、 微丝骨架系统在植物有性生殖的重要
环节——花粉萌发、 花粉管生长中具有重要的作
用 [1-2]。 有关花粉与花粉管中细胞骨架的研究结果
多以被子植物为材料观察所得， 关于裸子植物花粉
和花粉管中细胞骨架系统的结构、 功能的研究报道
相对较少。 裸子植物在进化上较被子植物原始， 其
有性生殖过程代表一种较原始的有性生殖方式。 一
些研究初步揭示了裸子植物花粉管中骨架系统分布
与功能、 钙离子分布、 原生质环流模式等与被子植
物存在差异 [3-12]， 但研究所涉及的种类有限， 有必
要对更多的裸子植物进行研究， 以便揭示其普遍规
律。 中国是裸子植物的起源和分化中心， 富含特有
热带作物学报 2013， 34（3）： 511-516
Chinese Journal of Tropical Crops
收稿日期 2012-11-21 修回日期 2013-01-26
基金项目 福建省科技计划重点项目（No. 2009N0048）； 福建省教育厅科技项目（No. JA09206）。
作者简介 李国平（1966年—）， 男， 教授， 博士； 研究方向： 植物多样性保护与利用研究。 *通讯作者： 杨鹭生， E-mail： ptlgp@126.com。
油杉花粉萌发与花粉管
细胞骨架系统的研究
李国平， 杨鹭生 *， 贾小丽， 张 剑， 胡永乐
武夷学院生态与资源工程系， 福建武夷山 354300
摘 要 应用免疫荧光标记法结合激光扫描共聚焦显微镜术对油杉花粉管中的微管、 微丝骨架进行观察。 结果
表明： 伸长的花粉管大致可分为 3 个区， 即位于顶端的管细胞区、 体细胞区和其后的退化区； 花粉管中微管与
微丝的分布样式不同； 微管骨架主要分布于管细胞区和体细胞区， 而退化区的微管较稀疏； 管细胞区内微管呈
网状结构， 微管一直延伸至花粉管极顶端； 体细胞具独立的微管系统。 花粉管内微丝骨架呈轴向排列于整个花
粉管， 自花粉粒内一直延伸至花粉管顶端， 粗微丝束几乎平行于花粉管的长轴。 本研究结果为进一步研究微管
与微丝骨架系统在油杉花粉管顶端极性生长中的作用提供依据。
关键词 裸子植物； 油杉； 花粉管； 微管； 微丝； 激光扫描共聚焦显微镜
中图分类号 Q944.42， S718.47， S791.15 文献标识码 A
Pollen Germination and Cytoskeletal Organization in
Pollen Tube of Keteleeria fortunei
LI Guoping, YANG Lusheng, JIA Xiaoli, ZHANG Jian, HU Yongle
Department of Ecology and Resource Engineering, Wuyi University, Wuyishan, Fujian 354300, China
Abstract The cytoskeletal organization in pollen tube of Keteleeria fortunei was investigated using a confocal
laser scanning microscope after immunolabeling for microtubules and rhodamine-phalloidin fluorescence labeling for
microfilaments. The K. fortunei mature pollen grain contained two degenerated prothallial cells, a body cell, a
stalk cell, and a tube cell. In the elongating pollen tubes, three cytological zones were identified, which were the
tube cell zone, the body cell zone and the deterioration zone. The results of confocal microscopy showed that the
distribution pattern of microtubules within pollen tubes was distinct from that of microfilaments. An enriched
microtubules network was present in the tube cell zone and the body cell zone. However, the deterioration zone
had poor microtubules. In the tube cell zone, microtubules formed an ordered network and extended towards the
pollen tube tip. The body cell possessed a separate dense meshwork of microtubules. The microfilaments formed a
longitudinal array within the pollen tube, which extended from the pollen grain throughout the tube. There was
also a network of microfilaments at the tube tip. The cytoskeletal function in conifer pollen tube growth was
discussed in this present paper. It was also suggested that the microtubule cytoskeleton within the K. fortunei
pollen tube might play key roles in determining the shapes of tube cell and body cell, and maintaining the
polarity of tip growth, while the microfilament cytoskeleton was responsible for pollen tube growth and was
involved in the movement of body cell. It might provide an important foundation for further studies on the
cytoskeletal function in K. fortunei pollen tube growth.
Key words Gymnosperms； Keteleeria fortunei； Pollen tube； Microtubules； Microfilaments； Laser scanning
confocal microscope（LSCM）
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2013.021
第 34 卷热 带 作 物 学 报
和孑遗属种 [13]， 研究这些特有和孑遗属种花粉与花
粉管中的细胞骨架系统对于全面了解裸子植物花粉
管顶端生长机制具有重要作用。
油杉 （Keteleeria fortunei（Murr.） Carr.）属裸子
植物亚门松科油杉属， 主要分布在我国广东、 广
西、 福建、 浙江南部沿海山地， 生长于海拔 800 m
以下的阳坡或林缘， 为我国特有树种， 是古老的孑
遗植物 [13-14]。 油杉作为易危（VU）种， 已载入《中国
植物红皮书》 [15]。 油杉属的胚胎学研究曾有报道，
王伏雄等[16]报道了云南油杉（K. evelyniana Mast）初
期胚胎的发育过程， 刘成运[17]观察了云南油杉在受
精过程中新细胞质及蛋白泡的发生和变化。 李国平
等[18-22]曾报道油杉小孢子发生、 花粉形成过程及油
杉花粉个体发育中淀粉粒消长变化， 但其花粉管内
微管、 微丝的分布尚不清楚。 本研究以油杉花粉为
材料， 应用免疫荧光定位、 荧光探针标记， 结合激
光扫描共聚焦显微镜（LSCM）技术研究其花粉管中
微管、 微丝的分布特征。
1 材料与方法
1.1 花粉采集与保存
2008 年 3 月中上旬油杉花粉散发期， 在福建
省莆田市广化寺后山油杉自然居群和东岩山上 1 棵
树龄约为 60 a 的油杉植株上采集刚开始散粉的雄
球花， 置于室内自然干燥 48 h， 让花粉散出， 最后
将收集的花粉置于-20℃冰箱中， 保存备用。
1.2 花粉体外萌发与花粉管结构的观察
花粉培养于含硼酸 100 mg/L＋氯化钙 100 mg/L+
蔗糖 10％+琼脂 0.7％的固体培养基中。 培养基经
灭菌冷却， 均匀地在培养基表面撒播花粉成一薄
层， 置生化培养箱（28±1）℃下暗培养 27 h。 萌发花
粉经 3.7％多聚甲醛溶液固定 1~2 h， PBS 缓冲液
（pH 值 7.2）洗 3 次， 以醋酸洋红染色液染色， 在
Olympus BX51 型荧光显微镜下观察花粉管形态结
构并拍照； 以 10 μg/mL 的 DAPI 对花粉染色， 紫
外光激发下观察花粉管中细胞核并拍照。
1.3 花粉管中微管骨架的观察
参照 Lazzaro[6]和李国平等 [11]的方法， 观察油杉
花粉管中微管骨架的分布。 花粉管经固定、 酶解、
封闭处理 ， 用鼠抗人单克隆 α-微管蛋白 （α-
tubulin）抗体（北京中杉产品）处理， 再用FITC标记
的抗小鼠抗体IgG（北京中杉产品）处理，用自配抗荧
光衰退剂封片。 制片过程设2个对照，即省去一抗处
理和省去一抗、 二抗处理， 其它步骤相同。 制片在
Leica TCS-SP2 型激光扫描共聚焦显微镜下观察，
激发波长 488 nm， FITC滤镜组合。
1.4 花粉管中微丝骨架的观察
参考 Li 等[23]的方法， 油杉花粉管经固定处理，
用微丝蛋白的特异性荧光探针罗丹明 －鬼笔碱
（Molecular Probes， USA）标记后， 用自配抗荧光
衰退剂封片， 在 Leica TCS-SP2 激光扫描共聚焦
显微镜下观察， 激发波长 543 nm， TRITC 滤镜组
合。 制片过程以省去荧光标记处理为对照， 其它
步骤相同。
2 结果与分析
2.1 油杉花粉管的形态与结构
油杉成熟花粉粒为 5-细胞型的花粉， 由 1 个
管细胞、 1 个体细胞（精原细胞）、 1 个柄细胞（不育
细胞）和 2 个退化的原叶细胞组成 [22]， 即在传粉前
由生殖细胞分裂形成 1 个柄细胞和 1 个体细胞， 花
粉萌发后柄细胞退化， 而体细胞将再分裂 1 次形成
2 个精子。 在体外培养条件下， 花粉管细胞从萌发
孔向外凸出， 形成花粉管， 未见花粉管分枝或多管
现象。 不同发育阶段的萌发花粉经固定、 醋酸洋红
染色或 DAPI 染色， 观察结果表明： 花粉萌发后，
体细胞和柄细胞开始向花粉管内移动（图 1-A）； 随
着花粉管的伸长， 管细胞和体细胞向前移动， 柄细
胞则与体细胞分开， 留在花粉粒附近（图 1-B）。 伸
长的花粉管大致可分为 3个区， 即位于顶端的管细
胞区、 体细胞区和其后的退化区； 管细胞区内富含
淀粉粒， 管细胞核一般位于靠近体细胞的位置（图
1-C）； 体细胞较大， 其直径几乎与花粉管直径同，
原生质较浓， 体细胞核近球形， 有 1 个较大核仁
（图 1-D）； 体细胞的后面为退化区， 柄细胞留在退
化区内， 在花粉管生长初期退化区中具小粒淀粉
粒， 后逐渐解体， 原生质稀疏， 基本上呈透明状。
2.2 花粉管内微管分布
萌发花粉经微管免疫荧光定位， 在激光扫描共
聚焦显微镜（LSCM）下清晰地显示出花粉管中微管
骨架的分布情况。 在刚萌发的花粉管中， 管细胞、
体细胞和柄细胞各具独立且紧密联系的微管网络
（图 2-A）。 在伸长的花粉管中， 微管骨架主要分布
于管细胞区和体细胞区， 而退化区的微管较稀疏
（图 2-B）； 管细胞区内微管呈网络状分布， 微管一
直延伸至花粉管极顶端（图 2-C）； 体细胞细胞质部
分具密集微管网络， 其荧光强度较管细胞的强（图
2-D）。
512- -
第 3 期 李国平等： 油杉花粉萌发与花粉管细胞骨架系统的研究
A、 B.表示花粉管内具 3 个细胞核， 体细胞核随花粉管细胞的伸长而向前移动， 柄细胞核则留在花粉管基部（DAPI 染色， 荧光显微镜
紫外光激发； TCN： 管细胞核； BCN： 体细胞核； SCN： 柄细胞核）； C、 D.表示花粉管分管细胞区、 体细胞区和其后的退化区， 柄细胞位于
退化区内（醋酸洋红染色， 荧光显微镜自然光激发； TZ： 管细胞区； BZ： 体细胞区； DZ： 退化区）。
图 1 油杉花粉管形态与结构
A B
50 μm 50 μm
100 μm
100 μm
C D
100 μm
100 μm
A B
10 μm
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第 34 卷热 带 作 物 学 报
2.3 花粉管内微丝分布
萌发花粉经罗丹明－鬼笔碱标记后， LSCM 观
察结果表明， 花粉管内微丝骨架呈轴向排列于整
个花粉管中， 自花粉粒内一直延伸至花粉管顶端
（图 3-A）， 粗微丝束几乎平行于花粉管的长轴 ；
而体细胞内未观察到有独立的微丝骨架系统分布
（图 3-B）。
3 讨论与结论
油杉成熟花粉属 5-细胞型花粉， 即在散粉前，
其生殖细胞已分裂为体细胞和柄细胞， 其中柄细
胞为不育细胞， 而体细胞将分裂为 2 个精细胞，
参与受精作用。 在体外培养条件下， 花粉管不具
分枝现象， 油杉花粉管顶端由管细胞和体细胞组
成， 为具代谢活力的功能区， 其后为退化区， 柄
A.表示微丝束自花粉粒内一直延伸至花粉管顶端； B.表示微丝束呈平行的轴向分布格局 （罗丹明-鬼笔碱荧光标记，
LSCM 543 nm 波长激发图像）。
图 3 花粉管中微丝骨架结构
50 μm 50 μm
A B
A.表示幼小花粉管内 3 个细胞的微管骨架分布情况； B.表示已伸长的花粉管内微管骨架分布情况； C.表示花粉管顶端
部分的微管网络结构， 箭头指向体细胞核位置； D.表示体细胞内具稠密微管蛋白分布（α-tubulin 抗体免疫荧光标记， LSCM
488 nm 波长激发图像）。
图 2 油杉花粉管中微管骨架结构
50 μm
C D
50 μm
←
←
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第 3 期
细胞与体细胞分开， 留在退化区内。 油杉花粉管
内细胞结构与黑松 （Pinus thunbergii） [12]、 雪松
（Cedrus deodara） [24]、 欧洲赤松 （Pinus sylvestris） [3]
及欧洲云杉（Picea abies） [6]等裸子植物的花粉管不
同， 这些松柏类植物的花粉在体外培养中其生殖细
胞或体细胞与柄细胞的复合体一直留在花粉粒内，
不随花粉管的伸长而移动， 这说明油杉花粉管结构
和伸长生长有其独特的特征。
油杉花粉管中微管骨架分布格局与其细胞结构
相吻合， 花粉管细胞内具网络状微管骨架， 一直延
伸至花粉管最顶端,这个观察结果与其它裸子植物，
如黑松 [11]、 欧洲云杉 [6]、 欧洲赤松 [6]、 赤松 （Pinus
densiflora）[4]和银杏（Ginkgo biloba） [25]的花粉管顶端
微管分布相似。 裸子植物花粉管最顶端具微管的特
点与苔藓植物原丝体的相似[26]， 但与被子植物的不
同， 被子植物花粉管的最顶端没有微管或仅有极少
量分布[1-2]。
油杉花粉管中体细胞具独立的微管骨架系统，
其细胞质部分在 LSCM下呈现极强荧光反应， 说明
体细胞具更稠密的微管网络， 这个观察结果与其它
松科植物及被子植物花粉管中的体细胞或生殖细胞
相似[4，6，27-31]。
油杉花粉管中微丝骨架的分布格局与微管骨架
的不同， 微丝束自花粉粒内一直延伸至花粉管顶
端， 呈轴向分布。 油杉花粉管中微丝骨架分布样式
与其它研究过的裸子植物花粉管基本相同 [3-4，6，23，25]，
但本研究未观察到油杉花粉管中体细胞具有独立的
微丝骨架系统分布， 这个结果与其它研究过的裸子
植物不同[32]， 而与被子植物的相似。 被子植物花粉
管中的生殖细胞－精细胞内也不具微丝分布 [29-31]，
而据 Lazzaro [32]报道 ， 裸子植物欧洲云杉 （Picea
abies）花粉管内体细胞和柄细胞中具独立又相互联
系的微丝骨架系统。
本研究应用免疫荧光标记法结合激光扫描共聚
焦显微镜术对油杉花粉管中的微管、 微丝骨架进行
观察， 初步揭示油杉花粉管在其伸长生长、 细胞结
构和细胞骨架系统分布方面的特征， 为进一步研究
油杉花粉管骨架功能、 花粉管顶端生长机制提供依
据， 对于研究油杉属的系统进化和保护生物学问题
有一定意义。
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责任编辑： 黄东杰
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