全 文 ：2001年 2月
第 31卷第 1期　　　
西北大学学报 (自然科学版 )
Journal of No rthw est Univ ersity( Na tur al Science Edition)
　　 Feb. 2001
Vol. 31 No. 1
　　 收稿日期: 2000-06-02
　　 作者简介: 阎桂琴 ( 1956-) ,女 ,山西临猗人 ,山西师范大学副教授 ,西北大学博士生 ,从事分子生态遗传学研究。
太白红杉总 DNA的提取及鉴定
阎桂琴 ,李　珊 ,王 玲 ,王戌梅 ,赵桂仿
(西北大学 生命科学学院 ,陕西 西安　 710069)
摘要:用抗氧剂和螯合剂组合的方法 ,成功地从太白红杉的叶组织中提取和纯化了总 DNA,并对其
产率、质量和纯度作了鉴定。用此方法能有效地去除酚类化合物、多糖、萜类化合物和未知化合物的
干扰 ,为太白红杉的分子生物学研究提供了一套迅速、经济和可靠的技术方案。
关　键　词: 太白红杉 ; 总 DNA抽提 ; 抗氧剂和螯合剂组合提取 DNA法 ; RAPD(随机扩增多态
性 DNA)
中图分类号: Q949. 66+ 5　　文献标识码: A　　文章编号: 1000-274Ⅹ ( 2001) 01-0053-04
　　成功地从组织细胞中提取总 DNA, 是进行一
切有关分子遗传学和分子生物学研究的前提。在植
物研究中 , 一些重要经济作物 , 如小麦、 水稻和玉
米等的总 DNA提取已有成熟的方法 , 但对其他植
物的总 DNA提取制备 , 还需要根据所研究植物的
不同情况来进行实验。最近 , 我们对太白红杉进行
遗传多样性研究时 [ 1～ 4] , 发现太白红杉的针叶内含
有较高的多酚、 萜类、 多糖化合物和一些未知的化
合物 , 用许多现有的成熟方案 [ 5～ 12]未能解决太白红
杉总 DNA的提取。通过反复实验 , 我们探索出一
种迅速、 简便、 经济的分离纯化太白红杉总 DNA
的方法 , 应用该法可有效地去除太白红杉叶内的酚
类、萜类和多糖化合物 [13～ 14 ] , 提取的总 DNA不经
任何纯化处理 , 便可进行 PCR( Po lymorase Chain
Reaction)扩增 ,为太白红杉的进一步研究奠定技术
基础。
1　材料与方法
1. 1　材料采集
实验材料分别采自柞水牛背梁、长安光头山、秦
岭主峰太白山、佛坪大涧沟和宝鸡玉皇山。在每个采
样地依海拔高度 (每升高 50 m) ,阴坡 ,半阴坡 ,设横
向跨度等随机取样。在每棵样树上尽可能取幼嫩、健
康的带叶枝条数枝 ,将采集的材料放于塑料袋中 ,并
淋水 ,尽快地带回实验室 ,放于 - 80℃超低温冰箱保
存备用。
1. 2　总 DNA提取
取超低温冰冻保存的健康无病斑叶子 (约 1 g ) ,
放置在冰冻的研钵中 ,在研磨时加入足够量的抗坏
血酸 ( Asco rbic acid )和聚乙烯吡咯啉酮 ( Polyvinyl
py rrolidone PV P) ,用冰冻的研杵快速研磨成干粉
状。装入 1. 5 mL Eppendorf管中 ,迅速加入 500μL
不含有 CTAB或 SDS的缓冲液和 1 mL的丙酮 ,充
分混匀 ,低速 ( 7 000 r /min)离心 10 min,弃上清液 ;
可重复 2～ 3次 ;在 Eppendo rf管中迅速加入等体积
的、 65℃预热的 2× CTAB缓冲液和 β-巯基乙醇 (β-
mercaptoethanol) (终浓度 3% ) ,并上下颠倒轻摇数
次 ,使材料与缓冲液充分混匀 ,然后置于 60～ 65℃
水浴 1 h; 取出 Eppendo rf管稍冷却 , 加入等体积
的氯仿-异戊醇 ( 24∶ 1)混合液和适量无水乙醇 (终
浓度 10% ～ 20% ) , 混合后于 4 000 r /min离心 15
～ 20 min, 取上清液 , 重复此步骤 2～ 3次 ; 加入 2
倍体积的冷乙醇或 2 /3体积的异丙醇 , 4℃静置 20
～ 30 min, 白色絮状总 DNA沉淀已清晰可见 ,
4℃ , 12 000 r /min离心 10 s,弃上清液 ;加入 500
μL DNA洗涤缓冲液 ,放置 30 min,离心后将所得
沉淀用 70%乙醇洗涤 2次 ,空气干燥后 ,溶于 100
μL 0. 1× TE中 , - 20℃保存备用。
1. 3　总 DNA纯度检测
用 754型分光光度计 (上海第三光学分析仪器
厂 ) ,在波长 230, 260及 280 nm处测定吸光度 ,根据
DOI : 10. 16152 /j . cnki . xdxbzr . 2001. 01. 022
260 nm的吸光度值计算总 DNA产率 ,根据 260 nm
和 280 nm处吸光度的比值判断总 DNA的大致纯
度 ,根据 260 nm和 230 nm处吸光度比值判断有无
残存的盐和小分子杂质 ,如核苷酸、氨基酸、酚等。在
0. 5% 的琼脂糖凝胶中 ,于 5V /cm电压下电泳 ,以
λ-DNA为标准 ,检测总 DNA的分子质量 ,总 DNA
样品的纯度 ,总 DNA样品量 ;用 UV P( combridge)
软件包 SW2000进行高精度的分析 ,更精确地估算
出总 DNA样品的含量。
1. 4　扩增反应
以所提取的总 DNA为模板 ,用 10个碱基寡核
苷酸片段的单引物 ,在 T EMP· TRON IC热循环仪
( Barnsteel /Thermolyne公司 )上进行扩增。 反应体
积为 30μL,成分为 12μL /L引物 , 50 mmol /L Tris-
HCl ( pH 8. 3) , 2. 5 mmol /L MgCl2 , 1μmol /min
Taq聚合酶 (华美生物工程公司 ) , 0. 2 μm /L
dN TP。扩增程序为 [15 ]: 96℃下预变性 330 s。 95℃ ,
70 s, 35℃ , 100 s, 72℃ , 140 s, 40个循环 , 72℃再
续补延伸 390 s。程序进行完毕 ,置样品于 4℃冰箱
中片刻 ,然后在 1. 8%的琼脂糖凝胶 ( EB+ )中电泳 ,
紫外光 ( 254 nm )观察并照相记录。
2　结果与分析
对提取和纯化的总 DNA,测定其 200～ 300 nm
内的紫外吸收光谱。总 DNA在 260 nm处有一个明
显的吸收峰。波长 260 nm和 280 nm处吸光度的比
值在 1. 79～ 1. 84之间 ,表明所提取的总 DNA纯度
是比较高的 ,基本上没有 RNA分子、蛋白质或酚的
污染。根据在 260 nm吸收值计算的总 DNA含量高
达 mg级。波长 260 nm和 230 nm处吸光度比值为
2. 3,表明溶液中基本上没有盐和小分子杂质。 在
0. 5%琼脂糖凝胶上总 DNA样品呈现出一条迁移
率很小的整齐条带 ,在溴酚蓝前没有弥散的荧光区
出现 ,这表明提取的总 DNA样品是比较纯的 (图
1)。
用总 DNA作为模板 ,用 10个碱基的寡核苷酸
片段作为引物进行随机扩增 RAPD(随机扩增多态
性 DNA) ,结果表明可作为有用的分子标记来检测
多态性 (图 2)。
3　讨　论
从太白红杉组织中提取总 DNA分子是对其进
行植物分子生物学方面研究的必要前提。 要进行
Southern杂交 , RFLP, RAPD分析等研究 ,都需要
高质量的总 DNA。 20世纪 80年代以来 ,普遍采用
CTAB法提取植物总 DNA。 CTAB是一种去污剂 ,
既能裂解细胞 ,又能有效沉淀多糖 ,因此有其独特的
优点。 但是 ,对裸子植物 ,尤其是太白红杉总 DNA
的提取是失败的。能成功地从太白红杉叶组织中提
取总 DNA的关键是如何有效地去除多酚类、多糖
和萜类化合物 ,以及某些未知化合物。
1　 2　 3　 4　 5　 6　 7　 8　 9　 10　 11　 12
图 1　提取的太白红杉基因组 DNA
Fig. 1　 Ex tracted genom e DNA o f Larix chinensis
不同泳道的样品如下: 1到 12
分别为 1, 2, 3, 4, 5, 6居群
1　 2　 3　 4　 5　 6　 7　 8　 9　 10　 11
图 2　太白红杉自然居群 RAPD指纹图谱
Fig. 2　 The RAPD finge rprint o f Larix
chinensis na tural populations
不同泳道的引物如下: 1泳道内 s17, 2至 11
泳道为 s7, s26, s51, s83, s90
3. 1　酚类化合物的干扰和去除
许多植物组织都富含酚类化合物 ,而且其含量
会随着植物的生长而增加 ,因而选取幼嫩的植物材
料提取总 DNA比较好。 针叶类植物中多酚的含量
比其他植物要高得多 ,当组织被研磨 ,细胞破碎后 ,
酚类化合物被释放而且被氧化后会与总 DNA不可
逆的结合 ,产生褐化效应 ( brow ning effect ) ,导致总
DNA的活性丧失以及在用苯酚、氯仿抽提时的丢
失。目前 ,去除酚类化合物的一般途径是在提取的初
始阶段防止其氧化 ,然后再将其与总 DNA分开。用
常规的方法去除太白红杉总 DNA提取中酚类化合
物效果不佳 ,用足量的 PV P和 V C,是利用它的“ CO
- N= 基”有很强的结合多酚化合物的能力 ,其结合
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能力随着多酚化合物中芳环羟基数量的增加而加
强。然后 ,可以直接通过离心去除掉或在苯酚和氯仿
抽提时除去。用“ - SH基”防止褐变以及可以打断
多酚氧化酶的二硫键而使之失活来防止酚类化合物
被氧化 ;酚类化合物的种类很多 ,用 - 70℃的丙酮抽
提冷冻研磨的太白红杉材料会进一步提高分离总
DNA的质量。
3. 2　多糖的干扰和去除
太白红杉叶组织中富含多糖 ,在沉淀总 DNA
时 ,同时也产生多糖的絮状沉淀 ,这种含有多糖的总
DNA沉淀难溶于水 ,或溶解后产生粘稠状的溶液。
由于多糖可以抑制许多种酶的活性 ,因此 ,污染了多
糖的总 DNA样品无法用于进一步的分子生物学研
究。在常规的方法中 ,通过 SDS- 盐酸胍处理可以
部分去除一些多糖 ;在高盐低 pH值条件下 ,通过苯
酚、氯仿抽提可以除去一些多糖。但是 ,在太白红杉
总 DNA的抽提中 ,即使通过这些步骤 ,仍会发现有
相当多的多糖与总 DNA混杂在一起。为进一步除
去多糖对总 DNA提取的影响 ,在沉淀太白红杉总
DNA过程中加入乙醇 (终浓度 10% ) ,使得去除多
糖的效果明显提高。
3. 3　未知化合物的去除
在用 CTAB和 SDS方法对总 DNA的提取中 ,
发现某些未知化合物与总 DNA凝聚成不溶性的复
合物 ,并且这种未知化合物在 230 nm和 270 nm处
有强的吸收峰 ,从而干扰了总 DNA的紫外吸收测
定。 污染有这种不溶性复合物的总 DNA不能进行
下游的分子生物学的操作。我们采用抗氧剂和螯合
剂的组合方案 ,能使白色絮状沉淀物容易地溶解在
1 /10的 T E溶液中 ,在 260 nm处有一个明显的吸
收峰。
在总 DNA提取时 ,要特别注意取材。尽可能选
取幼嫩的叶组织。由于个体的不同发育时期 ,组织细
胞内的组成成分不同 ,以及随着个体发育 ,植物组织
细胞内外的组成成分更加复杂多样 ,尤其是酚类化
合物 ,多糖、萜类化合物 ,以及一些次生代谢物和一
些未知化合物含量的增加 ,都会给总 DNA的提取
带来困难。不同的植物含有不同的干扰成分 ,即使是
同一种植物的不同组织 ,或来源于同种植物不同的
种群的材料 ,其总 DNA的提取都会遇到不同的难
点。随着材料的不同 ,总 DNA的提取方法要不断地
探索和积累经验。
参考文献:
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(编　辑　徐象平 )
—55—　第 1期　　　　　　　　　　 　　　　阎桂琴等:太白红杉总 DNA的提取及鉴定　　　　　　　　　　　　　 　
Isolation and characterization of total DNA from Larix chinensis
YAN Gui-qin, LI Shan, WANG Yi-ling , WANG Xu-mei, ZHAO Gui-fang
( Co llege o f Life Science, No rthw est Univ e rsity , Xi′an 710069, China )
Abstract: An ex t raction medium with the combination o f antiox idants and chelants, which can remove
phenolic compound, poly saccharide and terpenoid, was successfully used to obtain to tal DN A from the leaf
tissues o f Larix chinensis beissn. The DN A yields, quali ty and puri ty were characterized. These iso lated
DN A could be used direct ly for PCR reaction, RFLP and RAPD analysis. A rapid, inexpensiv e and
reliable procedure has been developed fo r fur ther study o f g enetic div ersity of this species.
Key words: Larix Chinensis beissn; to tal DN A ex traction; an ex t raction medium w ith the combina tion of
antio xidants and chelants; RAPD( Rahdorn Amplified Po lymo rphism DNA)
·学术动态·
我校“ 211工程”“十五” (二期 )建设项目
顺利通过专家论证
2000年 10月 27日下午 ,我校党政领导、校内各单位负责人和在校博士生导师等 100多人参加了陕西
省教育厅在我校举行的“ 211工程”“十五” (二期 )建设项目专家论证会。在会上 ,专家组组长安芷生院士代表
专家组宣布: 专家组一致同意《西北大学“ 211工程”“十五” (二期 )建设项目论证报告》 ,建议陕西省将西北大
学“ 211工程”列入陕西省“十五”建设规划 ,并尽早启动、组织实施 ,给予更大力度的支持。这标志我校“ 211工
程”“九五”建设以来所取得的成绩得到专家们的充分肯定 ,同时也标志着我校“ 211工程”建设将会进入到一
个新的发展阶段。
根据国务院颁布的《面向 21世纪教育振兴行动计划》、教育部关于“ 211工程”二期建设的有关要求和省
政府批示精神 ,受陕西省发展计划委员会的委托 ,陕西省教育厅组织由 4位知名院士和数名著名学者、管理
专家组成的专家组对《西北大学“ 211工程”“十五” (二期 )建设项目论证报告》进行论证。在论证会开幕式上 ,
我校党委书记李军锋代表学校致欢迎词 ,省政府副秘书长薛汉军和省计委助理巡视员张石庄分别代表省政
府和省计委致辞并对论证会提出一些具体要求。我校校长孙勇教授作了《以重点学科建设为核心 ,建设国内
一流大学》的报告 ,对我校“ 211工程”、“九五”建设成效以及“十五” (二期 )建设项目立项准备的有关情况进
行了详细汇报。专家们在考察了重点学科实验室、展室等我校“ 211工程”“九五”建设项目后 ,经过认真评议 ,
形成“西北大学《` 211工程’ `十五’ (二期 )建设项目论证报告》专家组论证意见” ,对我校“ 211工程”和“九五”
建设所取得的成绩及西大人在建设中表现出的巨大凝聚力和奋斗不息精神给予了充分肯定和高度评价 ,并
认为我校提出的《论证报告》理由充分 ,具有极强的说服力 ,报告思路清晰 ,重点突出 ,符合国家有关“ 211工
程”二期建设的要求 ,也符合西北大学的实际 ,建设目标定位准确 ,发展方向明确 ,提出“ 211工程”“十五” (二
期 )期间的 5. 26亿元建设经费符合学校建设和发展客观实际 ,建设任务设置和经费安排合理 ,切实可行 ,同
时对我校下一步的建设提出了一些很好的建议。
在闭幕式上 ,省教育厅副厅长郝瑜代表主管部门对我校“ 211工程”“十五”建设提出希望 ,希望我校再接
再厉 ,在今后的建设中取得更好的成绩 ;孙勇校长代表学校致答谢词 ,他向各位专家、向省上有关部门领导多
年来对西大的关心和支持表示衷心的感谢 ,并表示全校上下要继续发扬西大人在“ 211工程”一期建设中表
现出的孜孜不倦、不遗余力的创业精神 ,把二期建设做得更好 ,用成倍的成果来回报党和人民的关心和支持。
(薛　鲍 )
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