免费文献传递   相关文献

柏木木屑中精油成分分析及抑菌抗氧化活性研究



全 文 :第31卷 第3期
 2013年9月 
   
四川农业大学学报
Journal of Sichuan Agricultural University
   
Vol.31 No.3
Sep.2013
  收稿日期:2013-05 -13
基金项目:四川农业大学大学生创新性实验计划项目(111062633); 四川省科技厅科技支撑计划项目(2011ZO0006)。
作者简介:侯仰帅,本科,主要研究方向:化学生物学,E-mail:houys2013@sina.com。*责任作者:张利,博士,教授,主要从
事植物学研究,E-mail:zhang8434@sina.com。
doi:10.3969/j.issn.1000-2650.2013.03.014
柏木木屑中精油成分分析及抑菌抗氧化活性研究
侯仰帅,姜媛媛,晏 明,余 静,张 利*
(四川农业大学生命科学与理学院,四川 雅安 625014)
摘要:【目的】以柏木木屑为原料进行柏木精油的提取,实现柏木资源的最大化利用和可持续发展。【方法】采用水
蒸气蒸馏法提取柏木精油,通过气相色谱-质谱联用技术(GC-MS)分析精油成分,采用滤纸片扩散法测定精油和
链霉素分别单独使用以及两者联合使用时对供试细菌的抑制情况,并测定了精油的总还原力以及对1,1-二苯基-2-
三硝基苯肼自由基(DPPH·)、羟基自由基(·OH)、超氧阴离子自由基(O-2·)的清除能力。【结果】结果表明:精油
主要成分为柏木醇(26.06%)、罗汉柏烯(18.25%)、α-柏木烯(15.06%)、(+)-花侧柏烯(8.23%)、α-姜黄烯
(3.20%)、i-石竹烯(2.83%)、β-雪松烯(2.69%)和(+)-β-柏木烯(2.48%)等。柏木精油单独使用时对沙门氏菌的
抑菌效果属高度敏感,对其他供试菌的抑菌效果属中度敏感。在大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、霍氏肠杆菌、克雷伯氏
菌、炭疽杆菌的抑菌实验中,链霉素起主要作用;而在沙门氏菌、枯草芽孢杆菌抑菌实验中,柏木精油起主要作用。
柏木精油的抗氧化活性与精油浓度呈现一定的量效关系,具有较强的还原力。对DPPH·、·OH、O-2·的IC50(清
除率达到50%时的质量浓度)分别为2.55、2.23和1.30mg/mL,表现出较强的抗氧化活性。【结论】柏木木屑精油
具有较强的抑菌能力以及抗氧化能力,为生物杀菌剂以及天然食品防腐剂和抗氧化剂的研究提供了理论依据。
关键词:柏木木屑;柏木精油;成分;抑菌活性;抗氧化活性
中图分类号:Q946-33  文献标志码:A  文章编号:1000-2650(2013)03-0314-05
Chemical Composition,Antibacterial and Antioxidant Activities
of Essential Oil fromCupressus funebris Chips
HOU Yang-shuai,JIANG Yuan-yuan,YAN Ming,Yu Jing,ZHANG Li*
(Colege of Biology and Science,Sichuan Agricultural University,Yaan 625014,Sichuan,China)
Abstract:【Objective】Essential oil in C.funebris chips was extracted and optimizeresource utiliza-
tion and sustainable development of C.funebris can be realized.【Method】The essential oil was
extracted by steam distilation and oil components were separated and identified by gas chromatog-
raphy-mass spectrum(GC-MS).The antibacterial effects were investigated using filter paper dif-
fusion methods when essential oil and streptomycin used alone and in combined with each other.
The reducing power and scavenging capacity against 1,1-streptomycin,Diphenyl-2-picrylhydrazyl
and hydroxyl and superoxide anion free radical antioxidant activities were measured.【Results】
The essential oil of C.funebris mainly contained cedrol(26.06%),thujopsene(18.25%),cu-
parene(15.06%),α-cedrene(8.23%),α-curcumene(3.20%),β-Caryophylene(2.83%),β-Hi-
machalene(2.69%)and(+)-β-Cedrene(2.48%).Essential oil alone was highly sensitive to
Salmonellaand moderately sensitive to the other tested strains.In Escherichia coli,Enterobacter
hormaechei,Bacillus anthraci and Klebsiellaantibacterial experiments,streptomycin play a ma-
jor role.While in Salmonellaand Bacillus subtilis bacteria experiments,essential oils play a ma-
第3期 侯仰帅(等):柏木木屑中精油成分分析及抑菌抗氧化活性研究    
jor effect.The antioxidant activity of essential oil increased with the increase in concentration,ex-
hibiting stronger reducing power.The half maximal inhibitory concentrations(IC50)against 1,1-
Diphenyl-2-picrylhydrazyl,hydroxyl and superoxide anion free radical were 2.55,2.23and 1.30
mg/mL,respectively,indicating stronger antioxidant activity.【Conclusion】The essential oil
fromC.funebris has strong antibacterial and antioxidant capacity,which provides a theoretical
basis for the study of biological fungicides and natural food preservatives and antioxidants.
Key words:Cupressus funebris chip;essential oil of C.funebris;components;antibacterial activi-
ty;antioxidant activity
  柏木(Cupressus funebris Endl.),柏科(Cu-
pressaceae)柏木属(Cupressus)常绿乔木,主要分布
于我国长江流域及以南地区。柏木除作为桥梁、家
具用材之外,其根、干或枝叶也是提取柏木精油的原
材料之一。柏木精油的主要成分柏木醇广泛应用于
香料行业天然定香剂和协调剂的生产,柏木烯是合
成甲基柏木烯酮等高级香料的主要原料,也是制药
工业的重要中间体。将天然植物精油与传统抗生素
联合使用已成为天然产物开发与新药研发领域的一
个热点[1],国际和国内对柏木精油具有较大需求市
场[2-3]。然而,工业上加工柏木木材产生大量的工业
垃圾(柏木木屑),造成了严重的资源浪费和环境污
染。中国和美国为柏木精油的两大主产地[3],在美
国虽已开始利用柏木木屑进行柏木精油的提取,但
对于其抑菌性、抗氧化性方面的相关研究还未见报
道。本研究旨在以柏木木屑为原料,通过水蒸气蒸
馏法提取柏木精油,采用GC-MS鉴定其化学成分,
并对精油进行抑菌及抗氧化活性研究,为柏木木屑的
回收再利用以及柏木精油的开发利用提供理论基础。
1 材料和方法
1.1材料与试剂
试验材料:柏木木屑。
供试细菌:大肠杆菌(Escherichia coli)、沙门氏
菌(Salmonella)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、
霍氏肠杆菌(Enterobacter hormaechei)、炭疽杆菌
(Bacillus anthraci)、克雷伯氏菌(Klebsiella),菌种
来源于四川农业大学生命科学与理学院。
1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、氯化硝基
四氮唑蓝(NBT)、还原型辅酶Ⅰ(NADH)、吩嗪硫
酸甲酯(PMS)均为生化试剂,美国Sigma公司;邻
菲啰啉、铁氰化钾、三氯化铁和三氯乙酸均为分析
纯;实验用水均为超纯水。
1.2 仪器与设备
HP6890GC/5973MS型气相色谱-质谱联用
仪,美国惠普公司;UV-3200PC紫外分光扫描仪,上
海美谱达仪器有限公司;Water Purifier试验室专用
超纯水机,四川沃特尔科技发展有限公司;BT-124S
分析天平,北京赛多利斯仪器系统有限公司;LDZX-
40SAI型立体式自动电热压力蒸汽灭菌器,上海申
安医疗器械厂;KQ-300GDV移液枪(1 000,100,50
μL),上海赛默飞世尔公司。
1.3 方法
1.3.1 柏木精油的提取
水蒸气蒸馏法:称取500g柏木木屑按1∶7的
料液比加入超纯水混合,浸泡2h后,在蒸馏装置中
提取4h,分离出柏木精油。多次提取收集后用无
水Na2SO4 干燥,密封后置于4℃冰箱保存备用。
1.3.2 GC-MS分析条件
气相色谱条件:色谱柱 HP-5MS(30m×250
μm×0.25μm)弹性石英毛细管柱。升温程序:初始
温度40℃,以2.5℃/min升到70℃,再以5℃/
min升到150℃,最后以10℃/min升到280℃,保
持10min;载气为 He,柱流量1.0mL/min,进样口
温度250℃,分流比400∶1;溶剂延迟3.0min。
质谱条件:EI源,离子源温度230℃,进样量1.0
μL。采用面积归一法确定各成分相对百分含量。
1.3.3 抑菌试验
1.3.3.1 培养基的制备
牛肉膏-蛋白胨培养基:称取3g牛肉膏,10g
蛋白胨,5g氯化钠和16g琼脂粉,加少量超纯水加
热溶解后补充水至1 000mL。调节pH 至7.4~
7.6,121℃高压蒸汽灭菌20min。
1.3.3.2 供试细菌的活化及菌悬液的制备
取少量待测菌株于装有液体培养基的锥形瓶
内,充分混匀后加入玻璃珠震荡培养(37℃,1d),
连续活化3代。取少量已活化的待测菌株加入9
mL无菌水,充分混匀,制成菌悬液,用无菌吸管吸
取1mL混匀后的菌悬液于另一装有9mL无菌水
的试管中,依次制成一系列浓度梯度的菌悬液。采
513
    四川农业大学学报 第31卷
用平板计数法测菌悬液浓度,调至浓度约为107~
108 CFU/mL,置于4℃条件下保存备用[4]。
1.3.3.3 抑菌圈的测定
采用滤纸片扩散法测定抑菌圈直径,研究柏木
精油单独使用以及与链霉素联合使用时的抑菌效
果。精油经0.45μm孔径的滤膜过滤除菌,用镊子
夹取3片已灭菌的8mm圆形滤纸片,分别滴加10
μL柏木精油、5μL柏木精油+5μL链霉素溶液、10
μL链霉素溶液,用等体积的无水乙醇对照。在无菌
条件下自然晾干,备用。取各种供试细菌悬液0.15
mL均匀涂布于平板培养基上,再用无菌镊子夹取
处理过的滤纸片均匀贴于上述平板培养皿中,每个
培养皿设3个重复。然后将平板于4℃条件下放置
2h[5]后再将平板倒置,放入37℃培养箱培养24h。
从平板背面用游标卡尺测量抑菌圈直径,以抑菌圈
的边缘以肉眼看不到细菌明显生长为限,记录并整
理数据。
1.3.4.4 体外抗氧化试验
参照李润丰等[6]的方法进行柏木精油还原力的
测定;参照雷学军等[7]的方法进行柏木精油对DP-
PH·清除能力的测定;参照 WU W.L.等[8]的方法
进行柏木精油对·OH 清除能力的测定;参照 O.
Mehmet等[9]的方法进行柏木精油对O-2·清除能力
的测定;每个样品浓度设3次重复。
2 结果与分析
2.1 柏木精油的化学成分
对柏木精油 GC-MS的色谱图进行逐个解析,
并按峰面积归一化法计算各组分的相对百分含量,
共鉴定了28种化合物(表1)。由表1可知,柏木精
油成分中萜类成分22个,占总量的93.54%(包括
单萜7个,占9.05%;倍半萜15个,占84.49%);脂
肪族成分5个,占5.28%;芳香族成分1个,占
1.17%。主要成分有柏木醇(26.06%)、罗汉柏烯
(18.25%)、α-柏 木 烯 (15.06%)、花 侧 柏 烯
(8.23%)、姜黄烯(3.20%)、i-石竹烯(2.83%)、β-雪
松烯(2.69%)和(+)-β-柏木烯(2.48%)。柏木精
油成分分析结果表明,柏木木屑中精油的主要成分
与已有的研究报道[10-11]相似,其种类和含量的差异
可能是由柏木生长环境的不同所致。
2.2 柏木精油对细菌的抑制作用
抑菌圈实验结果的判定标准是:抑菌圈直径>
15mm为高度敏感,10~15mm为中度敏感,8~10
mm为低度敏感,无抑菌圈者为不敏感[12]。柏木精
油对不同供试细菌的抑菌效果如表2所示,由表2
可知,精油单独使用时对沙门氏菌的抑菌圈直径为
16.50mm,属高度敏感;对大肠杆菌、枯草芽孢杆
菌、霍氏肠杆菌、克雷伯氏菌、炭疽杆菌抑菌圈直径
在10.00~15.00mm之间,属中度敏感。精油单独
使用时对沙门氏菌和枯草芽孢杆菌的抑菌圈直径大
于链霉素单独使用时的抑菌直径。当链霉素单独作
用于大肠杆菌、霍氏肠杆菌、炭疽杆菌、克雷伯氏菌
时,抑菌圈直径分为(16.33±1.05)mm、(18.18±
0.81)mm、(16.75±0.89)mm、(15.61±0.62)
mm;当柏木精油单独作用时,抑菌圈直径分为
(12.86±2.38)mm、(14.87±1.91)mm、(10.39±
0.35)mm、(13.66±2.39)mm;当两者(1∶1)联合
作用时,抑菌圈直径分为 (14.02±2.58)mm、
(15.98±2.23)mm、(12.51±3.09)mm、(14.31±
2.14)mm,说明精油与链霉素(1∶1)混合后对大肠
杆菌、霍氏肠杆菌、炭疽杆菌、克雷伯氏菌仍保持相
加作用。
2.3 柏木精油的抗氧化活性
柏木精油的还原力及对 DPPH·、·OH 和
O-2·清除能力测定结果如图1所示。物质的还原
力可以反映其总抗氧化能力,本研究根据柏木精油
将Fe3+还原为Fe2+的能力来评价其抗氧化活性。
由图1可知,在一定浓度范围内,随着柏木精油浓度
的增加,吸光值逐渐增加,精油的还原力逐渐增强,
当精油浓度达到5mg/mL时,吸光值为0.919,表
现出较强的还原能力。孙伟等[13]研究了稀释后的
香柏木(Cupressus funcbris(L.)Endl)精油的抗氧
化活性,研究结果表明其对DPPH·的清除能力达
到 55.85%。本 研 究 结 果 表 明,柏 木 精 油 对
DPPH·,·OH和O-2·3种自由基的清除能力与
样品质量浓度有明显的量效关系,随着柏木精油浓
度的升高,对3种自由基的清除能力逐渐增强。当
精油浓度达到5mg/mL时,对DPPH·、·OH 和
O-2 · 的 清 除 率 分 别 达 到 77.78%、96.78% 及
88.00%,说明柏木精油对3种自由基均有较好的清
除作用。
另外,柏木精油对 DPPH·、·OH、O-2·的
IC50值分别为2.55、2.23及1.30mg/mL。以IC50
值为指标,柏木精油对3种自由基的清除能力大小
为:O-2·>·OH>DPPH·。
613
第3期 侯仰帅(等):柏木木屑中精油成分分析及抑菌抗氧化活性研究    
表1 柏木精油的化学成分
Table 1 Chemical components of essential oil of C.funebris Endl
序号
Number
中文名称
Chinese name
英文名称
English name
保留时间
Retention time/min
相对含量
Relative content/%
1 α-桉叶油醇 α-Eudesmol  8.259  1.31
2 (+)-α-长叶蒎烯 (+)-α-Longipinene  8.446  0.89
3 (+)-长叶烯 (+)-Longifolene  8.590  0.46
4 α-柏木烯 α-Cedrene  8.697  15.06
5 (+)-β-柏木烯 (+)-β-Cedrene  8.852  2.48
6 罗汉柏烯 Thujopsene  9.002  18.25
7 (-)-异石竹烯 (-)-Isocaryophylene  9.275  1.11
8 香叶烯D  Germacrene D  9.526  0.86
9 (+)-巴伦西亚橘烯 (+)-Valencene  9.649  0.81
10 α-姜黄烯 α-Curcumene  9.762  3.20
11 β-雪松烯 β-Himachalene  10.120  2.69
12 (+)-花侧柏烯 (+)-Cuparene  10.227  8.23
13 p-伞花烃 p-Cymol  10.580  0.79
14  1,3,5-三甲基环己烷 1,3,5-trimethyl-Cyclohexane  10.794  0.31
15  2,3,4,5-四甲基-2-环戊烯酮 2,3,4,5-Tetramethyl-2-cyclopentenone  11.275  0.40
16 蛇麻烯 Humulen  11.404  0.76
17 (-)-α-芹子烯 (-)-α-Selinene  11.596  1.29
18 (+)-柏木醇 (+)-Cedrol  11.794  26.06
19 枯茗醇 Cumicalcohol  12.024  1.63
20 香橙烯 Aromadendrene  12.404  0.75
21 (1R)-(+)-CIS蒎烷 (1R)-(+)-CIS-Pinane  12.580  1.02
22  1,1,3-三甲基环己烷 1,1,3-Cyclogeraniolane  12.735  1.78
23 异长叶烷酮 Isolongifolone  12.944  0.99
24 i-石竹烯 i-Caryophylene  13.137  2.83
25 α-法呢烯 α-Farnesene  13.441  1.18
26  2-甲氧基苯甲酸甲酯 2-Methoxybenzoate  13.677  1.17
27 cis-β-愈创木烯 cis-β-Guaiene  23.625  1.88
28 雄烯酮 Androstenone  23.973  1.80
表2 柏木精油的抑菌活性
Table 2 Antibacterial activity of essential oil of C.funebris Endl
菌种
Strains
抑菌圈直径Inhibition zone diameter/mm
精油
Essential oil
精油+链霉素
Essential oil and streptomycin
链霉素
Streptomycin
无水乙醇
Absolute ethyl alcohol
大肠杆菌Escherichia coli  12.86±2.38  14.02±2.58  16.33±1.05  8.00
沙门氏菌Salmonela  16.50±0.57  15.30±1.85  12.89±0.83  8.00
枯草芽孢杆菌Bacilus subtilis  14.49±0.44  14.24±0.62  13.76±0.68  8.00
霍氏肠杆菌Enterobacter hormaechei  14.87±1.91  15.98±2.23  18.18±0.81  8.00
炭疽杆菌Bacilus anthraci  10.39±0.35  12.51±3.09  16.75±0.89  8.00
克雷伯氏菌Klebsiela  13.66±2.39  14.31±2.14  15.61±0.62  8.00
3 结论
利用气相色谱-质谱联用技术分析了柏木木屑
为原料提取的柏木精油的化学成分,共鉴定出28种
化合物,主要成分为:柏木醇(26.06%)、罗汉柏烯
(18.25%)、α-柏 木 烯 (15.06%)、花 侧 柏 烯
(8.23%)、姜黄烯(3.20%)、i-石竹烯(2.83%)、β-雪
松烯(2.69%)和(+)-β-柏木烯(2.48%)等,其中多
种成分为有机化工、食品工业等领域重要原料。
713
    四川农业大学学报 第31卷
图1 柏木精油的还原力及对DPPH·、·OH和
O-2·3种自由基的清除能力
Figure 1 Reducing power and scavenging effects on
DPPH·,·OH and O-2·of C.funebris Endl.Oil
柏木木屑中提取的柏木精油对导致食物腐败的
大肠杆菌、枯草芽孢杆菌,引起食物中毒的沙门氏菌
均具有一定的抑菌效果,且对枯草芽孢杆菌和沙门
氏菌的抑菌效果强于链霉素。当精油与链霉素(1∶
1)混合使用时,对大肠杆菌、霍氏肠杆菌、炭疽杆菌、
克雷伯氏菌仍保持相加作用。
柏木木屑中提取的柏木精油具有较强的还原能
力,且对DPPH·、·OH和O-2·3种自由基的清除
能力与精油质量浓度存在明显的量效关系。柏木精
油对DPPH·、·OH、O-2·的IC50值分别为2.55、
2.23及1.30mg/mL。
参考文献:
[1] 李慧,白红彤,王晓,等.椒样薄荷、薄荷和苏格兰留兰香精
油与抗生素的协同抑菌功能[J].植物学报,2011,46(1):
37-43.
[2] 孙晓东.柏木油生产工艺的改进[J].湖南林业科技,2000,
27(1):71-74.
[3] 陆洪都,汪培根,柏锋.柏木油回顾[J].香料香精化妆品,
2004,1:27-33.
[4] Ozturk S,Erdisil S.Antibacterial activity and chemical con-
stitutions of Ziziphora clinopodioides [J].Food Control,
2007,18(7):535-540.
[5] Cavar S,Milkam M,Vidic D,et al.Chemical composition
and antioxidant and antimicrobial activity of essential oil of
Artemisia annua L.from Bosnia[J].Crops and Products,
2011,10(1):2-7.
[6] 李润丰,刁华娟,彭友舜,等.板栗多糖的提取及抗氧化活
性研究[J].食品研究与开发,2011,8(9):21-25.
[7] 雷学军.清除氧自由基的功能性食品Ⅲ[J].食品工业,
2002,3:12-13.
[8] WU W L,ZHU Y T,ZHANG L,et al.Extraction prelimi-
nary structural characterization,and antioxidant activities of
polysaccharides fromSalvia miltiorrhiza Bunge[J].Carbo-
hydrate Polymers,2011,87(2):1348-1353.
[9] Mehmet O,Fatmaa O,Mehmete D,et al.Antioxidant activ-
ity of stem and root extracts of Rhubarb(Rheum ribes):An
edible medicinal plant[J].Food Chemistry,2007(103):
623-630.
[10] 曹双喜,杨兵,刘家欣.柏木油化学成分的分析研究[J].湖
南化工,1998,28(5):43-44.
[11] 刘家欣.气相色谱-质谱法在柏木油生产中的应用[J].化学
世界,2000(7):385-387.
[12] 杨森艳,姚雷.柠檬草精油抗菌性研究[J].上海交通大学学
报,2005,23(4):374-376.
[13] 孙伟,王淳凯,蔡云升,等.16种芳香植物精油抗氧化活性
的比较研究[J].食品科技,2004(11):55-57.
(本文审稿:卢伟东;责任编辑:巩艳红;英文编辑:徐振锋)
813