全 文 ：连作障碍与根际微生态研究 Ⅲ. 土壤酚酸物质
及其生物学效应 3
张淑香 3 3 　高子勤　刘海玲　(中国科学院沈阳应用生态研究所 ,沈阳 110015)
【摘要】　以黑龙江省大豆重茬 5 年与正茬土壤和根系为主要研究对象 ,采用高效液相色谱法 ,研究土壤和根系
浸提液中的酚酸物质的含量及其生物学效应. 结果表明 ,重茬土壤中对羟基苯甲酸和香草酸的含量 (1mol·L - 1
NaOH 提取)大于正茬土壤 ,且差异达到极显著水平 ,香草醛含量差异不显著 ;重茬大豆根系水提液中对羟基苯
甲酸、香草酸、阿魏酸、香草醛、香豆素含量均高于正茬. 大豆连作条件下土壤多酚氧化酶活性高于正茬土壤. 重
茬大豆根系水提液及在水培条件下外加对羟基苯甲酸对大豆幼苗生长发育有一定的抑制作用 ;酚酸物质加入
土壤 1 周后 ,对羟基苯甲酸、香草酸、香草醛、阿魏酸、苯甲酸、香豆素残留率分别为 10. 4 %、15. 3 %、4. 1 %、
2. 3 %、5. 0 %、17. 5 % ;且外加酚酸浓度与土壤中真菌数量呈极显著指数相关.
关键词 　大豆连作障碍 　土壤酚酸
Continuous cropping obstacle and rhizospheric microecology Ⅲ. Soil phenolic acids and their biological effect.
ZHAN G Shuxiang , GAO Ziqin , L IU Hailing ( Institute of A pplied Ecology , Chinese Academy of Sciences ,
S henyang 110015) . 2Chin. J . A ppl . Ecol . ,2000 ,11 (5) :741～744.
The contents of phenolic acids in the extracts of soil and roots of continuously cropped for five years and normally
cropped soybean in Heilongjiang province and their biological effects were studied with HPLC method. The result
showed that the contents of p2hydroxy benzoic acid ,vanillic acid (extracted by 1mol·L - 1 NaOH) in continuous crop2
ping soil were significant higher than that in normal cropping soil ,and the content of vanillin had no significant differ2
ence in these soils. The contents of p2hydroxybenzoic acid ,vanillic acid ,vanillin ,ferulic acids ,and coumarin of aqueous
extracts of soyhean roots were higher in continuous cropping than in normal cropping soil. The activity of polyphenol
oxidase in continuous cropping soil was higher than in normal cropping soil. Under conditions of water culture and
adding exogenous p2hydroxybenzoic acid , the aqueous extract of soybean roots inhibited the growth of soybean
seedlings. After a week of exogenous phenolic acids addition ,the residual rates of p2hydroxybenzoic acid ,vanillic acid ,
vanillin ,benzoic acid ,ferulic acids ,and coumarin were 10. 4 % , 15. 3 % , 4. 1 % , 2. 3 % , 5. 2 % , 17. 5 % , respective2
ly. There was a very significant exponential relationship between the addition amount of exogenous phenolic acids and
the fungi population in soil.
Key words 　Continuously cropping soybean obstacle , Soil phenolic acids.
　　3 国家“九五”重中之重招标资助项目 (9520120522B03) .
　　3 3 通讯联系人. 现在中国农业科学院土壤肥料研究所 ,北京
100081.
　　1999 - 10 - 18 收稿 ,2000 - 05 - 10 接受.
1 　引 　　言
据报道 ,黑龙江省大豆重茬 3 年面积占大豆总面
积的 60 % ,连作大豆减产的平均幅度为 15 %～26 % ,
以成为制约当地大豆减产的重要因素. 对重茬大豆障
碍机制研究已有不少报道[9 ,10 ,11 ,17 ] . 研究表明 ,大豆
连作可导致土壤速效养分下降 ,p H 下降[14 ,19 ] ,土壤脲
酶、酸性磷酸酶、过氧化氢酶、转化酶活性均呈下降趋
势[2 ] ,土壤微生物种群的改变[8 ,15 ] ,根腐病和胞囊线
虫严重等[12 ] . 土壤中酚酸物质主要来自作物残体分解
产物和根系的分泌作用 ,是一类重要的他感物质 ,对作
物生长发育有一定抑制作用. 有研究表明酚酸类物质
在作物和树木的连作障碍中起一定作用[1 ,3 ,5 ,6 ] . 本文
以黑龙江省重茬和正茬土壤为研究对象 ,探索大豆连
作条件下 ,土壤中是否含有对大豆生长起抑制性的酚
酸物质以及与其它研究结果的关系 ,旨在揭示致毒物
质 (酚酸)与连作障碍的关系 ,为阐明大豆连作减产的
原因及调控措施提供科学依据.
2 　材料与方法
211 　样品采集
土样 1 于 1996 年 5 月采自黑龙江省八五三农场连作大豆
两年的耕层土壤 (白浆土) ;土样 2 于 1996 年 7 月采自黑龙江
农科院大豆研究所的大豆正茬、重茬 1 年 (重茬 1) 、重茬 3 年
(重茬 3)的大豆根系与耕层土壤 (黑土) ;土样 3 于 1997 年 5、7、
9 月采自黑龙江八五 O 农场大豆正茬与重茬 5 年 (重茬 5) (白
浆土) .
212 　样品制备
21211 土壤提取液 (土样 3) 　称 25g 鲜土于离心管中 ,加入
应 用 生 态 学 报 　2000 年 10 月 　第 11 卷 　第 5 期 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
CHIN ESE JOURNAL OF APPL IED ECOLO GY ,Oct . 2000 ,11 (5)∶741～744
25ml 1 mol·L - 1NaOH 放置过夜 ,次日振荡 30min ,离心后将过
滤离心液用 12 mol·L - 1的盐酸酸化至 p H2. 5 ,2h 后离心除去胡
敏酸 ,而后直接上 HL PC 测定上清液 (重复 3 次) ,结果按照烘
干土重换算[4 ] .
21212 根系提取液 　毛刷去除根际土后的根系 ,放入离心管
中 ,加水振荡 30min (水 ¬根为 10 ¬1) ,过滤液备用.
213 　样品分析
21311 土壤多酚氧化酶的测定 　按照土壤农化常规分析方
法[14 ] .
21312 土壤酚酸测定 　以 Hertley[4 ]的测定方法为基础 ,根据测
定仪器调整流动相的组成 ,使测定物质得到了较好的分离 (参
见图 3 - 标准图谱) .
21313 标样与试剂 　标样对羟基苯甲酸、香草酸、香草醛、阿魏
酸、苯甲酸、香豆素均为国产的分析纯 ,甲醇为优级纯.
21314 标样制备 　分别称取 10mg 的对羟基苯甲酸、香草酸、阿
魏酸、苯甲酸、香豆素置入同一个 100ml 的容量瓶中 ,用甲醇溶
解并定容至刻度 ,该混合标准溶液每种酚酸的浓度为 100μg·
ml - 1 .
21315 仪器与色谱条件 　日立 635U 型高效液相色谱仪 ,配备
日立 200210 双光束紫外分光光度检测器 ,日立 833 型数据处理
机. 柱子 :Nucleosil C18 4 ×250mm 不锈钢柱 ,流动相 :0. 01mol·
L - 1 NaAc ¬ HAc ¬丁醇 (100 ¬1. 5 ¬2) ;流速 :0. 9ml·min - 1 ,柱
压为 180kg·cm - 2 ,柱温 :室温检测波长 275nm ,进样量为 10μl ,
21316 定性定量 　样品中的各酚酸采用色谱保留时间比较法
定性 ,外标法测定其含量.
214 　培养试验
21411 试验 1 　精选 10 粒大豆种子均匀地放在垫有滤纸的培
养皿中 ,分别加入重茬 3、重茬 1、与正茬土壤水提液 15ml ,同体
积的蒸馏水作为对照 ,观察其大豆胚根的生长情况 (3 次重复) .
21412 试验 2 　将大豆种子表面消毒 ,放置于培养皿中 (每皿垫
一层滤纸用于保湿) ,在 25 ℃的恒温箱中培养 ,待胚根长出 2cm
后 ,选择长势一致的幼苗分别放入浓度为 0、6. 25、12. 5、25、50、
100μg·ml - 1的对羟基苯甲酸溶液中 (每容器 10 棵) ,培养 1 周
后测定其幼苗的干重.
21413 试验 3 　称 300g 样品 1 风干后过 2mm 筛土壤放入塑料
盆中 ,分别加入含对羟基苯甲酸、香草酸、香草醛、阿魏酸、苯甲
酸与香豆素 (每种酚酸浓度均为 1000μg·ml - 1 ) 的混合液各 0、
15、30、60ml ,并用蒸馏水补齐至 60ml ,土壤含水量达到 20 % ,
同时使土壤中各酚酸的含量分别达到 0、50、100、200μg·g - 1 . 置
于 25 ℃恒温箱中培养 ,7d 后用 1mol·L - 1氢氧化钠提取并测定
各酚酸的含量 ,用平板法测定土壤中的真菌数量.
3 　结果与分析
311 　大豆连作条件下土壤中酚酸物质的变化
从表 1 可看出 ,只有对羟基苯甲酸、香草酸、香草
醛被检出 ,而阿魏酸、苯甲酸与香豆素未检出. 大豆连
作后土壤中酚酸物质与正茬有明显差异 ,大豆重茬 5
年的土壤中 (不同生长期平均值)对羟基苯甲酸与香草
酸的全量较正茬高 1. 8 和 4. 26μg·g - 1 ,达到了极显著
水平 (p < 0. 01) ,香草醛含量相差不大 ( HPLC 分离见
图1) ,说明对羟基苯甲酸和香草酸在重茬条件下得到
表 1 　土壤中酚酸化合物的种类与含量
Table 1 Kinds and contents of phenolic acids in soils(μg·g - 1)
采样时间
Sampling time
对羟基苯甲酸 p2hydroxybenzoic acid
大豆正茬1) 大豆重茬 5 年2)
香草酸 Vanillic acid
大豆正茬 大豆重茬 5 年
香草醛 Vanillin
大豆正茬 大豆重茬 5 年
1997. 5 7. 00 ±0. 41 8. 58 ±0. 43 18. 66 ±1. 21 21. 74 ±1. 84 2. 97 ±0. 46 2. 81 ±0. 39
1997. 7 4. 38 ±0. 23 5. 92 ±0. 49 13. 96 ±1. 13 17. 50 ±1. 42 1. 82 ±0. 37 2. 92 ±0. 48
1997. 9 3. 67 ±0. 17 5. 97 ±0. 67 10. 69 ±1. 41 16. 81 ±1. 83 2. 60 ±0. 32 3. 57 ±0. 51
1) Normally cropped soybean ,2) Continuously cropped soybean for 5 years. 下同 The same below.
图 1 　酚酸混合物和土壤中酚酸的色谱图
Fig. 1 HPLC chromatograms of a phenolic mixture and 1mol·L - 1NaOH ex2
traction of soil.
A :标准图谱 Standard figure ,B :重茬 5 年 Continuously cropped soybean
for 5 years ,C :大豆正茬 Normally cropped soybean , a) 对羟基苯甲酸 p2
hydroxybenzonic acid ,b)香草酸 Vanillic acid , c)香草醛 Vanillin.
了积累 ,反映重茬大豆条件下酚酸物质积累特征 ,土壤
中酚酸积累主要来源于大豆根系分泌物、植物体残体
分解以及微生物合成等 ,受土壤化学、土壤生物化学、
植物生物化学等多种因素的影响. 5 月土壤中高量的
对酚酸对抵抗力弱的大豆幼苗有较明显的抑制作用.
到 7、9 月期间 ,不论是正茬还是重茬土壤中对羟基苯
甲酸与香草酸均呈现出随时间推移而减少的趋势. 这
是由于春季气温回升、土壤含水量适当 ,土壤中有机质
残体腐解 ,使酚酸有一定积累 ,随着气温升高 ,土壤中
生物化学过程旺盛 ,致使对羟基苯甲酸、香草酸的分解
加快导致含量减少 ,且维持相对稳定水平 ,香草醛含量
变化幅度较小.
312 　大豆连作条件下多酚氧化酶活性的变化
多酚氧化酶在土壤中芳香族有机化合物转化为腐
殖质组分的过程中起着重要的作用 ,其活性能在一定
程度上反映土壤腐殖化的进程 ,多酚氧化酶与土壤中
247 应 　用 　生 　态 　学 　报 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　11 卷
酚酸的积累有一定的关系. 由表 2 可知 ,对羟基苯甲酸
与香草酸含量之和与多酚氧化酶变化趋势一致 ,即重
茬大豆土壤中多酚氧化酶的活性较正茬高 0. 19 红紫
醅精 mg·g - 1土 ,这与林木连栽多酚氧化酶的变化趋势
相似 ,这是由于土壤中酚酸物质经过诱导作用而使土
壤中多酚氧化酶的活性增强[6 ,7 ] ,从而引起作物体内
生长素氧化酶的活性随之增强 ,生长素因此分解 ,影响
作物的生长发育 ,多酚氧化酶的活性增强反映大豆重
茬条件下又一重要土壤特征.
表 2 　土壤的酚酸物质与多酚氧化酶
Table 2 Soil phenolic acids contents and polyphenol oxidase
耕作方式
Cultural
method
采样时间
Sampling
time
p H
( H2O)
对羟基苯甲酸 +
香草酸 p2
hydrobenzonic +
vanillic acid
(μg·g - 1)
多酚氧化酶
Polyphenol
oxidase
(红紫醅精
mg·g - 1土)
大豆正茬1) 1997. 5 5. 74 25. 66 0. 43
大豆重茬 5 年2) 1997. 5 5. 76 30. 32 0. 53
大豆正茬 1997. 7 5. 77 18. 34 0. 25
大豆重茬 5 年 1997. 7 5. 63 23. 42 0. 56
大豆正茬 1997. 9 5. 67 14. 36 0. 15
大豆重茬 5 年 1997. 9 5. 89 22. 78 0. 32
313 　根系水浸液中酚酸物质及对大豆胚根生长影响
从图 2 可看出 ,重茬 1 年大豆根系水提液胚根的
长度均比对照长 ,说明根系水提液中较蒸馏水中富含
有某些营养物质 ,或水提液中某些致毒物质的浓度低 ,
而对大豆胚根生长有一定的刺激作用 (差异未达到显
著水平) . 重茬 3 年大豆胚根长度远低于其它各处理 ,
且差异达极显著水平 (p < 0. 01) ,说明重茬 3 年根系水
提液对大豆胚根生长有明显抑制作用 ,产生抑制作用
的原因可能其水提液中存在某些毒素物质 ,这与于贵
瑞等[16 ]的研究结果相似. 由此可以推断土壤中的毒素
物质与大豆连作障碍有一定作用.
图 2 　大豆根系水提液对大豆胚根生长的影响 (cm)
Fig. 2 Effect of water extraction of soybean root system on radicle growth.
Ⅰ1 对照 CK , Ⅱ1 正茬 Normally cropped soybean , Ⅲ1 重茬 1 年 Continu2
ously cropped for one year , Ⅳ1 重茬 3 年 Continuously cropped for three
years.
表 3 　根系水提液中酚酸的种类与含量
Table 3 Kinds and contents of phenolic acids in aqueous extraction of root system(μg·g - 1)
根系
Root system
对羟基苯甲酸
p2hydroxybenzonic acids 香草酸Vanillic acids 香草醛Vanillin 阿魏酸Ferulic acids 香豆素Coumarin
正茬 Normal cropping 1. 09 ±0. 07 4. 37 ±1. 13 1. 51 ±1. 11 1. 45 ±0. 09 1. 00 ±0. 07
重茬 Continuous cropping 1. 24 ±0. 10 13. 7 ±1. 46 1. 94 ±1. 14 1. 66 ±1. 13 1. 81 ±0. 12
　　由于酚酸物质只有通过水溶液才能被作物摄取 ,
因而水提液的酚酸与作物的生长发育关系最为密切 ,
研究根系水提液中的酚酸分离与鉴定具有重要意义.
重茬大豆根系水提液中对羟基苯甲酸、香草酸、香草
醛、阿魏酸、苯甲酸、香豆素的含量均高于正茬 ,香草酸
重茬是正茬的 3 倍 (表 3) ,色谱图参见图 3 ,反映大豆
在重茬条件下根系分泌的酚酸物质在根系附近得到了
图 3 　酚酸混合物和大豆根系水提液中酚酸的色谱图
Fig. 3 HPLC chromatograms of a phenolic mixture and a water extraction
from soybean root system.
d)阿魏酸 Ferulic acids ,e)苯甲酸 Bennolic acids ,f)香豆素 Coumarin.
积累 ,由此可见大豆根系分泌物对土壤中酚酸的积累
有一定作用.
314 　酚酸物质的生物学效应
31411 水培条件下外加对羟基苯甲酸对大豆幼苗生长
的影响 　对羟基苯甲酸是一种较为普遍的他感物质 ,
并且在试验土壤、根系水提液中已被检出. 为验证酚酸
物质对大豆生长发育的抑制作用 ,本文选用对羟基苯
甲酸研究对大豆幼苗生长的抑制作用 . 由图4可以看
图 4 　对羟基苯甲酸对大豆幼苗生长的影响
Fig. 4 Effect of p2hydroxybenzoic acid on soybean seedling growth.
出 ,含有对羟基苯甲酸的溶液中大豆植株的干重均比
3475 期 　　　　　　　　　　　　　　　　张淑香等 :连作障碍与根际微生态研究 Ⅲ. 　　　　　　　　　
对照低 ,说明对羟基苯甲酸对大豆生长与发育有一定
抑制作用 ,其它酚酸对大豆生长的抑制作用有待进一
步研究.
31412 外加酚酸在土壤中的残留及其对土壤中真菌数
量的影响 　进入土壤中的酚酸很容易被土壤吸附或在
微生物作用下转化为其他的物质[13 ] . 本文对酚酸物质
与真菌数量研究表明在经过 1 周培养后 ,各酚酸残留
率范围为 25 %～ 17. 5 % , 其大小顺序为 : 香豆素
(17. 5 %) > 香草酸 (15. 3 %) > 对羟基苯甲酸 (10. 4 %)
> 苯甲酸 ( 5. 0 %) > 香草醛 ( 4. 1 %) > 阿魏酸
(2. 25 %) ,说明 82. 5 %～97. 75 %酚酸已被微生物分
解或被微生物的生长活动而消耗 ,可见土壤中酚酸是
不稳定的. 在大田条件下 ,根系分泌物或作物残体分解
可使土壤中酚酸物质得到补充 ,与此同时又有若干过
程使之分解 ,土壤中酚酸始终处于一个动态变化过程.
若在一定外界胁迫条件下 ,如果土壤中酚酸补充过多
而又未及时分解 ,或不容易分解 ,在土壤中积累对作物
的生长产生伤害.
图 5 　土壤中真菌菌落数的数量与酚酸浓度的关系
Fig. 5 Relation between concentration of phenolic acids and fungi colony
population.
Ⅰ1 指数 Index (10D) , Ⅱ1 指数 Index (60D) .
酚酸物质与土壤中微生物的数量有直接关系[13 ] ,
由于在大豆连作条件下 ,土壤中根系酚酸物质含量高
于正茬 ,而真菌数量的增加是重要的微生物分布特
征[12 ,16 ,18 ] . 为了探讨大豆连作条件下 2 种土壤环境特
征之间的关系 ,以及揭示大豆连作实质 ,本文探讨了外
加酚酸混合物对真菌数量的影响. 由图 5 可知 ,在培养
10d 时 ,随着外加酚酸浓度的增加 ,真菌数量呈明显增
加的趋势 ,当培养时间达到 60d 时 ,各种酚酸浓度的真
菌数量与 10d 相比呈上升趋势 ,但酚酸浓度与真菌数
量的正相关关系仍与培养 10d 时相似 ,外加酚酸浓度
与土壤中真菌的数量之间的关系均呈指数关系 ,相关
系数达极显著水平 (图 5) ,说明土壤中酚酸物质能刺
激真菌繁殖与生长或为真菌生长提供了有效的 C 源.
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作者简介 　张淑香 ,女 ,1965 年生 ,博士 ,副研究员 ,主要从事土
壤生态研究 ,发表论文 10 多篇. E2mail :sxzhang @ppi. caas. ac. cn
447 应 　用 　生 　态 　学 　报 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　11 卷