全 文 ：重金属污染土壤毒性的斜生栅藻生长
抑制实验诊断 3
李　彬1 3 3 　李培军2 　王　晶2 　张海荣2 　杨桂芬2 　徐大伟1 　苏宝玲1
(1 沈阳大学生命与环境学院 ,沈阳 110016 ;2 中国科学院沈阳应用生态研究所 ,沈阳 110016)
【摘要】　应用斜生栅藻 ( Scenedesm us obliquus)对重金属污染土壤的毒性进行诊断 ,结果表明 ,斜生栅藻的
增长率与土壤中的重金属含量明显相关 ,并且随重金属投加量的增加 ,其增长率逐渐降低. 对两种测试参
数进行比较 ,发现采用细胞数增长率作为土壤毒性的检测指标要比采用光密度增长率更为敏感. 当采用细
胞数增长率作为检测指标时 ,4 种重金属的 EC50顺序为 : Pb > Cu > Zn > Cd ;采用光密度增长率作为检测指
标时 ,4 种重金属的 EC50顺序为 : Pb > Cu > Cd > Zn. 复合污染情况下 ,由于金属间的协同作用 ,使土壤的毒
性比单一重金属污染时有明显增强 ,从而为污染土壤的优先修复提供了理论依据.
关键词 　藻 　生长抑制实验 　土壤 　毒性
文章编号 　1001 - 9332 (2002) 03 - 0331 - 04 　中图分类号 　X53 　文献标识码 　A
Toxicity assessment of soil contaminated by heavy metals using algae growth inhibition test. L I Bin1 ,L I Pei2
jun2 ,WAN G Jing2 ,ZHAN G Hairong2 , YAN G Guifen2 ,XU Dawei1 ,SU Baoling1 (1 Depart ment of A rchitecture
and Envi ronment , S henyang U niversity , S henyang 110016 ;2 Institute of A pplied Ecology , Chinese Academy of
Sciences , S henyang 110016) . 2Chin. J . A ppl . Ecol . ,2002 ,13 (3) :331～334.
Scenedesm us obliquus growth inhibiton test was carried out to assess the toxicity of soil contaminated by heavy
metals. The results showed that the growth rate of Scenedesm us obliquus was positively related to the concentra2
tion of heavy methals added to soil ,and it was decreased with the increasing concentration of heavy metals. Two
parameters were chosen and the sensivities were compared. It was found that the cell growth rate was more sensi2
tive than OD growth rate. The orders of general detection limit by EC50 of different metals were Pb > Cu > Zn >
Cd by using cell growth rate as the test index and Pb > Cu > Cd > Zn by using OD as the test index. This study
also indicated that under the complex pollution condition ,the toxicity of heavy metals in soil was stronger than
that in the case of soil contaminated by single metal.
Key words 　Algae , Growth inhibition test , Soil , Toxicity.3 国家重点基础研究发展规划项目 ( G199901180825) 和中国科学院
知识创新重要方向资助项目 ( KZCS22SW2416) .3 3 通讯联系人.
2000 - 07 - 25 收稿 ,2001 - 01 - 15 接受.
1 　引 　　言
目前 ,随着工业的发展 ,土壤污染日益严重. 在
对土壤污染进行研究的过程中 ,人们日益发现实现
土壤污染毒性快速诊断的重要性 ,而以往的一些研
究方法如植物法、动物法、微生物法均不能充分反映
土壤的毒性状况以及土壤经淋溶后对地下水和人体
健康的影响 ,完善这一生态毒理学诊断指标体系需
进一步的实验研究.
藻类作为水生生态系统的初级生产者对其的平
衡和稳定起着极其重要的作用[6 ] . 藻类对于许多毒
物比鱼类、甲壳类更敏感 ,具有生长周期短、易于分
离培养和可以直接观察细胞水平上的中毒症状等优
点 ,是较为理想的实验材料. 藻类测试 (Algae inhibi2
tion test) 是水生生态毒理学研究中必不可少的方
法. 但此法主要用于水体中污染物的毒性诊断 ,将其
用于土壤污染毒性诊断还未见报导. 因此 ,探讨将藻
类毒性实验方法应用于污染土壤的毒性诊断上的可
行性 ,确定其毒性临界值 ,从而为土壤污染生态毒理
学指标的建立奠定基础.
2 　材料与方法
211 　供试材料
21111 供试土壤 　草甸棕壤采自中国科学院沈阳生态实验
站无污染实验小区 (0～20cm) ,实验选用过 20 目筛的风干
土 ,土壤 p H 6. 22 , 重金属含量分别为 Cd 01122mg·kg - 1 ,
Cu 1911mg·kg - 1 ,Zn 49190mg·kg - 1 ,Pb 2517mg·kg - 1 .
21112 供试污染物 　CdCl2 ·2. 5H2O、CuSO4 ·5H2O、Pb
(NO3) 、ZnSO4·7H2O 均为分析纯试剂 ,以水溶液的形式投
加 ,投加量以 mg·kg - 1风干土计算.
21113 供试生物 　斜生栅藻 ( Scenedesm us obliquus) 购自中
应 用 生 态 学 报 　2002 年 3 月 　第 13 卷 　第 3 期 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
CHIN ESE JOURNAL OF APPL IED ECOLO GY ,Mar. 2002 ,13 (3)∶331～334
国科学院武汉水生生物研究所藻种库 ,采用水生 4 号培养
基[5 ] ,25 ℃4000Lx 进行培养.
212 　研究方法
21211 斜生栅藻的同步培养 　采用连续接种的方法 [2 ] ,使所
有的细胞个体处于良好的条件下 ,在光照期迅速发育 ,而后
借光暗迭替 ,促使其迅速完成细胞分裂 ,获得子细胞 (即幼期
暗细胞) ,实现同步培养.
21212 光密度测定 　采用惠普 7550 分光光度计 ,在 650nm
处进行测定.
21213 细胞数测定 　采用血球记数板 ,依下式换算
细胞数 = 5 n ×104 ( n 为 5 个中格内细胞数)
21214 斜生栅藻生长曲线的测定 　250ml 三角瓶中装 50ml
藻液 ,于 1d ,2d. . . . . . ,采样进行光密度测定.
21215 土壤酸浸液制备 　称取 60g 过 20 目筛的土壤 ,按 1∶
2. 5 的比例用 0. 1mol·L - 1 HCL 浸提 2h ,过滤 ,调节 p H 为
616 ,进行藻类毒性实验.
21216 重金属浓度的测定 　采用日本岛津 600A 型原子吸收
分光光度仪进行测定.
3 　结果与分析
311 　斜生栅藻的同步培养
20 世纪 60 年代末 ,日、美及欧各国学者进行了
很多有关藻类同步培养的研究[3 ,10 ,12 ] ,推动了藻类生
理生化的迅速发展. 根据生态毒理实验的要求 ,进行
毒性实验的生物应大小、藻龄一致 ,以使结果更具有
代表性和可比性 ,因此 ,对斜生栅藻进行了同步培养.
图 1 　斜生栅藻光密度 ( Ⅰ)和细胞数 ( Ⅱ)的变化
Fig. 1 Change of Optical density (OD) ( Ⅰ) and cell number ( Ⅱ) of
Scenedesm us obliquus .
　　由图 1 可看出 ,在栅藻同步培养的一个生长繁
殖周期中 ,光照期细胞数基本稳定 ,即无形成和释放
子细胞的过程 ,但光密度直线增长. 这是细胞生长期
的特征. 停止光照 4h 后 ,细胞数直线上升 ,而光密度
基本稳定. 这是细胞分裂后期的特征. 说明经同步培
养后 ,斜生栅藻已经达到同步生长状态 ,为本实验方
法的确立提供了良好的前提条件.
312 　斜生栅藻生长曲线的测定
从图 2 可见 ,斜生栅藻经接种后 1～4d ,光密度
迅速增加 ,处于生长迅速的对数生长阶段 ,5～7d 光
密度增长缓慢 ,处于平台期 ,接种 7d 后 ,光密度下
降 ,藻体逐渐死亡. 由于对数生长期的细胞具有生长
迅速 ,敏感性和活性高等优点 ,所以根据实验要求选
取经同步培养的对数生长期的藻体进行毒性实验.
图 2 　斜生栅藻生长曲线
Fig. 2 Growth curve of Scenedesm us obliquus .
313 　单一重金属污染条件下典型土壤毒性对斜生
栅藻生长率的影响
　　从图 3 可以看出 ,对于重金属污染的土壤 ,重金
属的投加量与斜生栅藻的光密度和细胞数增长率存
在明显的相关性 ,随着重金属投加量的增加 ,其增长
率明显降低. 对光密度增长率和细胞数增长率两种
测试指标进行比较 ,发现采用细胞数增长率作为毒
性检测的指标要比采用光密度增长率敏感许多 ( P
< 0105) , 其它几种重金属的趋势与此相同. 这与
Tamiya[13 ]的报道完全一致.
不同重金属污染土壤的毒性强度也不同 ,以光
密度作为检测指标 ,则其毒性强弱依次为 Cd > Zn >
Cu > Pb ;以细胞数作为检测指标 ,则毒性强弱依次
为 Zn > Cd > Cu > Pb. 造成这种现象的原因 ,一方面
在于土壤对重金属的吸附能力不同 ;另一方面不同
重金属对生物的生理、生化指标及种群数量的影响
作用大小不同[10 ] . Lasheen[9 ]的研究表明 ,0. 05mg·
kg - 1的 Cd 对天然藻类的生长无影响 ,而浓度增加
到 1mg·kg - 1时 ,藻类的生长受到严重的抑制. Cu 作
为藻类生长代谢的必须元素 ,当其浓度为 0. 2mg·
kg - 1时 ,可影响栅藻的生长 ;浓度为 0. 5mg·kg - 1
时 ,生长将受到严重抑制[11 ,14 ] . 藻类对 Pb 有较高的
耐受力 ,当浓度为 30mg·kg - 1时 ,栅藻生长良好 ,浓
度为 100mg·kg - 1时 ,生长出现抑制[2 ,8 ] .
不同的重金属毒害作用的机制是不同的 ,Cd 主
要结合在藻类的细胞质和细胞的多磷酸体中 ,使多
磷酸体中的 Ca 和 Mg 丧失 ,以致这些细胞内含物的
元素组成发生离子变化[7 ] ;Cu 主要是影响藻类的生
长和光合作用 ,改变原生质膜的渗透性 ,使 K从细
233 应 　用 　生 　态 　学 　报 　　　　　　　　　　　　　　　　　　13 卷
图 3 　重金属污染土壤浸提液对斜生栅藻增长率的影响
Fig. 3 Relationship between the concentration of metals added to soil and
the growth rate of Scenedesm us obliquus .
Ⅰ1 光密度增长率 Growth rate of OD , Ⅱ1 细胞数增长率 Growth rate
of the cell.
胞内丧失[1 ] ; Pb 对藻类的影响主要是在细胞的叶绿
素形成方面[8 ] . 所以当研究重金属污染土壤毒性
时 ,既要考虑土壤对重金属的吸附特性 ,又要考虑生
物对不同重金属的敏感性及毒性作用机制.
314 　土壤复合污染的条件下毒性对斜生栅藻光密
度和细胞数增长率的影响
单个重金属污染虽有发生 ,但在自然界和现实
生活中 ,重金属的污染多为伴生性或综合性[4 ] ,在
以往的研究中 ,对单一重金属污染条件下的土壤毒
性进行了大量的研究[6 ] ,但对复合污染条件下土壤
毒性研究还不多. 对单一重金属污染土壤毒性的研
究虽有助于制定环境标准和环境容量 ,但根据不足 ,
缺乏说服力 ,往往使制定的标准与实际不相符合 ,甚
至会造成严重后果. 因此有必要对土壤复合污染条
件下的毒性进行诊断 ,从而确立清洁土壤的标准.
表 1 　草甸棕壤 L9( 34)正交实验结果分析
Table 1 Results of orthogonal array L9( 34)
实验号
No.
Cd
(mg·
kg - 1)
Zn
(mg·
kg - 1)
Cu
(mg·
kg - 1)
Pb
(mg·
kg - 1)
光密度增长率
Growth rate
of OD
( %)
细胞数增长率
Growth rate
of cell
( %)
1 1 (10) 1 (10) 1 (100) 1 (200) 74. 44 68. 27
2 1 (10) 2 (40) 2 (200) 2 (500) 35. 24 31. 08
3 1 (10) 3 (80) 3 (300) 3 (700) 21. 08 17. 49
4 2 (20) 1 (10) 2 (200) 3 (700) 30. 48 24. 62
5 2 (20) 2 (40) 3 (300) 1 (200) 42. 84 37. 18
6 2 (20) 3 (80) 1 (100) 2 (500) 38. 76 30. 57
7 3 (30) 1 (10) 3 (300) 2 (500) 25. 47 20. 07
8 3 (30) 2 (40) 1 (100) 3 (700) 32. 58 24. 13
9 3 (30) 3 (80) 2 (200) 1 (200) 48. 62 40. 01
X1 ( 1 水平总计) 130 . 76 130 . 39 145 . 78 165 . 90 ∑X = ∑X’=
X’1 (1’水平总计) 116 . 84 112 . 96 122 . 97 145 . 46 349 . 51 293 . 42
X2 ( 2 水平总计) 112 . 08 114 . 34 114 . 34 99 . 47
X’2 (2’水平总计) 92 . 37 92 . 39 95 . 71 81 . 72
X3 ( 3 水平总计) 106 . 67 108 . 06 89 . 39 84 . 14
X’3 (3’水平总计) 84 . 21 88 . 07 74 . 74 66 . 24
X1 43 . 59 43 . 46 48 . 60 55 . 30
X1’ 38 . 95 37 . 65 40 . 99 48 . 49
X2 37 . 36 38 . 11 38 . 11 33 . 16
X2’ 30 . 79 30 . 80 31 . 90 27 . 24
X3 35 . 56 36 . 02 29 . 80 28 . 05
X3’ 28 . 07 29 . 36 24 . 91 22 . 08
R 8 . 03 7 . 44 18 . 8 27 . 25
R’ 10. 88 8. 29 16. 08 26. 41
　　从表 1 可以看出 ,当复合投加不同浓度的重金
属时 ,草甸棕壤不同处理对斜生栅藻的毒性作用不
同. 正交分析 R 值表明 ,重金属之间存在着相互作
用 ,包括协同、拮抗等作用 , 当 Pb 的投加量为
200mg·kg - 1时 ,对处理 4 和处理 1 进行比较 ,发现
处理 4 在处理 1 的基础上 ,Cd、Cu、Zn 的浓度增加
后 ,斜生栅藻的光密度和细胞数增长率都下降 ,表明
Pb 与其它 3 种重金属之间存在协同作用 ,同样的作
用存在于 Cd、Zn、Cu 与其它重金属之间. 由于本实
验采用正交的实验方法 ,难以具体对各金属间的相
互作用进行判定 ,但对研究复合污染条件下影响毒
性的主要因素进行判定 ,以及确定复合条件下的警
戒值仍有意义. 以斜生栅藻光密度增长率约为 50 %
为标准 ,4 种重金属的临界值为 Cd 30mg·kg - 1 、Zn
80mg·kg - 1 、Cu 200mg·kg - 1 、Pb 200mg·kg - 1 ;以斜
生栅藻细胞数增长率约为 50 %为标准 ,4 种重金属
的临界值为 Cd < 30mg·kg - 1 、Zn < 80mg·kg - 1 、Cu
< 200mg·kg - 1 、Pb < 200mg·kg - 1 .
4 　结 　　论
411 　首次应用斜生栅藻生长抑制实验对重金属污
染土壤的毒性进行诊断 ,证明此方法是可行的 ,而且
迅速、敏感.
412 　通过连续接种的方法可以获得同步生长的斜
3333 期 　　　　　　　　　　李 　彬等 :重金属污染土壤的毒性的斜生栅藻生长抑制实验诊断 　　　　　　　　
生栅藻 ,并确定了接种后 4d 的藻体处于对数生长阶
段 ,为毒理实验的顺利进行奠定了基础.
413 　重金属的投加量与斜生栅藻增长率之间有明
显的相关性 ,随土壤重金属投加量的增加 ,斜生栅藻
的增长率明显降低.
414 　对两种测试参数进行比较 ,证明采用细胞数增
长率作为毒性检测指标 ,其敏感性高. 4 种重金属单
一污染条件下的 EC50值 ,以光密度为检测指标 ,Cd
25. 84mg·kg - 1 、Zn 33. 54mg·kg - 1 、Cu 160. 00mg·
kg - 1 、Pb 408. 26mg·kg - 1 ;以细胞数为检测指标 ,草
甸棕壤 Cd 22. 80mg·kg - 1 、Zn 15. 28mg·kg - 1 、Cu
123. 19mg·kg - 1 、Pb 310. 96mg·kg - 1 .
415 　复合污染条件下 ,由于重金属的协同作用 ,毒
性比单一重金属污染条件下有明显增加 ,4 种重金
属的 EC50值 ,以斜生栅藻光密度增长率为 50 %为标
准 ,4 种重金属的临界值为 Cd 30mg·kg - 1 、Zn 80mg
·kg - 1 、Cu 200mg·kg - 1 Pb 200mg·kg - 1 ;以斜生栅
藻细胞数增长率 50 %为标准 ,4 种重金属的临界值
为 Cd < 30mg·kg - 1 、Zn < 80mg·kg - 1 、Cu < 200mg·
kg - 1 、Pb < 200mg·kg - 1 .
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作者简介 　李 　彬 ,女 ,1974 年生 ,讲师 ,主要从事污染生态
和环境生物技术的研究 ,发表论文 6 篇. E2mail :libin-libin74
@yahoo. com
433 应 　用 　生 　态 　学 　报 　　　　　　　　　　　　　　　　　　13 卷