全 文 ：对氯代苯胺( PCA)在填充床生物反
应器中的降解作用*
万登榜 惠 阳 陈云霞 丘昌强 (中国科学院水生生物研究所,武汉 430072)
摘要 以氯代苯胺( PCA)为选择基质 ,用驯化技术从降解对二氯苯 ( pDCB)的富集培
养物中得到了以同化 PCA为唯一碳源和氮源的混合微生物.将这种固定在填充床反应器
中的微生物用于 PCA 的降解作用研究中. 在该反应器里, PCA 的生物降解遵循 Logist ic方
程 q= qmax/ ( 1+ e- Uv ) . 由方程求出了主要的动力学常数, K s(半速率常数)和 qmax(最大
比基质降解速率) . 于 PCA 降解的同时, 释放氯离子到培养基中.在水力停留时间 3h, 进水
PCA 浓度为 360mgL - 1情况下, 基质的体积降解率达到 125mgL- 1h- 1 ; 基质的百分去
除率为 91% .
关键词 填充床生物反应器 对氯代苯胺 微生物降解
Degradation of pchloroaniline(PCA) in packedbed bioreactor. Wan Dengbang , Hui Yang,
Chen Yunx ia and Q iu Changqiang ( I nstitute of Hydrobiology , A cademia Sinica, Wuhan
430072) . Chin. J . A pp l. Ecol. , 1998, 9( 3) : 313~ 317.
With pchloroaniline( PCA) as a select ed substrate, t he mixed microorg anisms assimilating it as
the sole source of carbon and nitro gen were obtained by acclimation technique from the enriched
cultural products of degraded pdichlorobenzen( pDCB) . The mixed microor ganisms immobi
lized in a packedbed reacto r were used to degrade PCA. In t he packedbed bior eactor, the
biodeg radation of PCA follow ed the Logistic equation, q= qmax/ ( 1 + e
- Uv) . The majo r ki
netic parameters, K s ( half velocity constant) and qmax ( maximum specific substrate degradation
rate) , were calculated. PCA was found to be degraded with a concomitant r elease of chlor ide
ions into the substrate. Under the conditions of residence time of 3 hours and inlet stream at
PCA concentration of 360mgL - 1, t he volumetric degradation rate of t he substrate was 125mg
L - 1h- 1 , w ith r emoval efficiency of 91% .
Key words Packedbed bior eactor, Pchloroaniline, M icrobial degradation.
* 湖北省自然科学基金资助项目( 92J74) .
1996- 07- 20收稿, 1998- 02- 18接受.
1 引 言
芳香胺类化合物 ( 包括氯代苯胺
( PCA)在内)作为中间体广泛用于农药、染
料、显色剂的合成和制药工业中,是重要的
化工原料.在卤代芳香胺的合成过程中,使
一定浓度的可溶性有机污染物导入水体,
从而给水环境带来危害. 卤代芳香环赋予
该化合物以顽固性特征. 苯胺对人体的血
液和神经系统的毒性很强, PCA 更具溶血
性. PCA在土壤和水体里的难降解性主要
归因于它们可通过氧化聚合作用而产生较
其前体物结构更复杂, 毒性更大的有机化
合物.所以应在它们进入环境系统以前先
行予以处理. Surovtseva[ 8]从土壤里分离到
可降解低浓度( 20mgL - 1) 3, 4二氯代苯
胺的混合微生物. Zeyer[ 9] 曾用纯菌株
Morax ella sp. 进行苯胺和 PCA的微生物
矿化作用研究. 但这些研究者的着眼点在
于探察该化合物的环境归趋.
应 用 生 态 学 报 1998 年 6 月 第 9 卷 第 3 期
CHINESE JOURNAL OF APPLIED ECOLOGY, Jun. 1998, 9( 3)313~ 317
由于 PCA 降解菌不易从工业污水处
理系统分离到, Lattorre[ 5]通过苯胺降解菌
和氯代酚同化菌的天然遗传交换曾获得代
谢 PCA的菌株.本研究力图以芳香胺化合
物作为选择基质对本实验室保藏的降解对
二氯苯( pDCB)的富集培养物进行驯化
培养, 以使它们获得降解苯胺以至 PCA 的
生理功能. 尔后将能以 PCA作为生长的唯
一碳、氮源的微生物细胞固定到生物反应
器的载体上, 进而研究固定化细胞对这种
化合物的降解作用规律, 探索最佳降解条
件,为生物反应器直接用于处理芳胺类工
业污水提供理论参数.
2 材料与方法
2. 1 填充床生物反应器
本反应器是由直径为 64mm, 高为 380mm 的
有机玻璃筒制成,结构见图 1. 用于固定微生物细
胞的载体是直径为 2~ 5mm 的多孔凹凸棒石. 载
体加入量为 400g. 利用位差, 通过恒流装置使所
加基质自下而上导入反应器. 借助超级恒温水浴
使水流循环通过水套将反应器内温度控制在
30 左右. 空气由筛板下的气泵提供. 气体流速
控制在 498mlmin- 1 . 该反应器的工作体积为
525ml.
图 1 填充床生物反应器示意图
Fig. 1 S chemat ic diagram for packedbed reactor.
2. 2 培养基和微生物
2. 2. 1 制备无机培养基 为定量测定由靶子化合
物释放的氯离子浓度, 并迫使微生物专门利用实
验基质中的碳和氮,特制备了不含氯化物和氮化
物的无机培养基. 其培养基成分 ( g L- 1 ) 如下:
K 2HPO4 1. 0; KH2PO4 1. 0; MgSO4 7H20 0. 41;
CaCO3 0. 01; FeSO47H2O 0. 05; 蒸馏水 1000ml;
pH7. 2.分装后, 以 15 磅高压蒸汽灭菌 30min.
2. 2. 2 微生物的驯化 以芳胺类化合物为选择基
质, 对本实验室保藏的原降解 pDCB 的混合微生
物进行了驯化培养. 在盛 100ml无机培养基的
250ml三角瓶中加入乙酰替苯胺( AALD) 20mg,
接种上述富集液 5ml,置 30 摇床培养1 周后, 以
苯胺替代 AALD, 培养 2 周后, 再以 PCA 代之. 如
此驯化培养 2 月后, 得到了能以 PCA 作为生长的
唯一碳源和氮源的富集培养物 .
2. 2. 3 接种物的制备 在含以苯胺或 PCA 为基
质的无机培养基里接种降解靶子化合物的富集
培养液, 于 30 悬转摇床 ( 120 次min- 1 ) 培养
24h 后,通过离心收集菌体,用无机培养基洗涤后
再离心, 然后将沉淀菌体用同种溶液制成菌悬
液, 此悬液用做实验接种物.
在分批培养实验里, 以细胞干重 ( gL - 1 )表
示培养前后的微生物生物量 .在用生物反应器进
行的连续培养实验里, 以每单位重量载体吸附的
细胞干重( mgg - 1)表示载体的生物量负荷. 测定
方法见文献[ 3] .
2. 3 苯胺和氯离子浓度的测定
苯胺、氯代苯胺和氯离子浓度分别采用萘乙
二胺光度法和硝酸盐滴定法[ 2]测定.
2. 4 动力学常数的计算
以 Logist ic方程描述微生物对芳香胺类化合
物的降解作用. 在分批培养中, 苯胺的降解方程
为 Q= Qmax / ( 1+ e- s) , 式中, Q 为比基质降解
速率; Qmax为最大比基质降解速率; S 为基质浓
度,、是与降解作用相关的常数. 从实验得到的
一系列 S 和 Q 值, 经过数学运算可求出 Qmax和
有关的常数, 从而得到降解方程和拟合的基质降
解曲线. 因为 K s 等于 1/ 2 Qmax时的基质浓度, 所
以由方程可求得. 在连续培养条件下, 实验基质
是按设定流速导入放应器的 ,固定化微生物承受
314 应 用 生 态 学 报 9 卷
的是基质负荷 Uv ( mgL - 1h- 1) , 所以, 上述方
程中的变量 S 宜以 Uv 代之.
3 结 果
3. 1 分批培养
3. 1. 1 苯胺的微生物降解作用 将苯胺以
6个浓度梯度分别加到无菌无机培养基
中,接入制备好的接种物, 置 30 悬转摇
床培养 8h. 测定了培养前后的菌液浓度;
接着将样品离心,取上清液测定其苯胺浓
度.于是分别求出了在各个浓度下的 q
值,由此得到微生物降解苯胺的 Logistic
方程: q = 61. 92/ ( 1+ e2. 022- 0. 0051s) , ( =
- 0. 98447, p< 0. 01) . 由方程知, Q max为
61. 92mgg- 1h- 1; K s 值等于 396. 47mg
L- 1.拟合的苯胺降解曲线见图 2. 由图 2
可见, 在 163到 488mgL- 1基质浓度范围
内, Q 和S 呈线性关系.
图 2 在分批培养中于不同苯胺浓度下的比基质降解率
( q)
Fig. 2 Specific substrate degrading rates at diff erent aniline
concentrat ions in a batch culture.
3. 1. 2 PCA的微生物降解作用 在 250m l
三角瓶中分装无机培养基 100ml, 灭菌后
分别加入准确称量的 PCA 结晶到三角瓶
中,使最终浓度为 50~ 250mgL - 1. 接入
种子液后, 置 30 摇床培养 2 周. 测定了
培养前后的菌液浓度和各样品离心后的上
清液的氯离子浓度. 由图 3可见,微生物的
比生长率 ( )和释放的氯离子浓度均随
PCA浓度的增加而增加.只是微生物生长
缓慢,其 max仅为 0. 23d- 1,氯离子的实际
释放量为 PCA全部降解的理论释放量的
82%.
图 3 在不同 PCA 浓度下微生物的生长和伴随的氯离
子的释放
Fig. 3 Microbial grow th and accompanying chloride ions re
lease at diff erent concentrat ions of PCA.
3. 2 连续培养
3. 2. 1 微生物的固定化 连续培养是在填
充床生物反应器中进行的. 此前,先以摇床
培养使种子培养物增殖, 然后制备成接种
物,并将其随加有 PCA的无机培养基一起
导入已装有载体的反应器中.在通气条件
下于 30 培养 1周,以使活性微生物细胞
被吸附于载体上. 此后将 100mg L - 1
PCA.先以 83mlh- 1, 后以 120mlh- 1的
流速加入反应器中.培养 1周后,可从出水
里检测到氯离子,再继续培养 2周.在水力
停留时间为 9h 的情况下, 出水中的 PCA
浓度大幅度下降.同时,氯离子的释放率达
到理论值的 90%以上. 由此可见, 反应器
中的微生物已具备了连续降解靶子化学物
的能力.为保持其活性,在实验前不断供应
实验化学物是必需的.
3. 2. 2 在不同稀释率( D)下的 PCA降解
为检测出水的氯离子浓度, 于正式实验前
先用无菌生理盐水以恒流冲洗已排空培养
液的反应器, 直至在出水中检测不到氯离
子为止. 在进水基质浓度一定 ( 100mg
L - 1)的条件下,实验化学物以不同的流速
通过生物反应器. 由此即可求出在 6个设
3153 期 万登榜等:对氯代苯胺( PCA )在填充床生物反应器中的降解作用
定的 D下各自的基质去除百分率、体积降
解速率和释放的氯离子浓度(图 4) .从图 4
可见, 在恒定的基质浓度下, PCA 的体积
降解速率随 D 的增大而增大;在不同的稀
释率下, PCA几乎以 100%的比率被去除.
与此同时,伴随着氯离子的释放.
图 4 在设定稀释率( D)下固定化微生物对PCA的体积
降解率和百分去除率( So= 100mgL- 1)
Fig. 4 Volumetric degrading rates and percent removal rates
for PCA by immobilized microorgn isms in designed range of
dilut ion rates( D) .
3. 2. 3 不同基质负荷对 PCA 降解作用的
影响 本实验是在进水流速一定( 120ml
h- 1) ,水力停留时间一定( 4. 375h) , 而只
变更进水的 PCA浓度的条件下进行的. 反
应器进出水的 PCA 浓度和基质去除的百
分率的测定和计算结果列于表 1. 本实验
求得的生物量负荷为 0. 283mgg- 1, 从而
得到了每单位生物量的基质降解速率, 即
比基质降解速率( Q ) . 那么, 由容积负荷
( Uv )和与之对应的 Q 值便可推导出 PCA
微生物降解的 Logistic 方程. 此方程式为
Q = 1 3 3 . 8 1 / ( 1 + e4. 27- 0. 19 Uv ) ( P <
表 1 反应器中微生物对 PCA 的去除作用( 进水流速
120mlh- 1,水力停留时间 4. 375h)
Table 1 Removal rates of PCA in the bioreactor( flow ve
loci ty for inlet: 120mlh- 1; hydrolic retention time: 4. 375
h)
PCA进水( mgL- 1) 48. 82 90. 93 156. 67 187. 5 191. 49
Inf luent for PCA
PCA出水( mgL- 1) 24. 97 20. 95 23. 84 23. 49 27. 52
E ffluent for PCA
PCA去除率 48. 85 76. 76 84. 77 87. 47 85. 63
Percent removal rates( % )
0. 01) . 即 Qmax等于 133. 81mgg - 1h- 1,
经换算而得到的 K s 值为 98. 23mgL - 1.
拟合的 PCA降解曲线见图 5. 从表 1和图
5可以看到,随着进水浓度的增加, 基质去
图 5 比基质降解速率( q )和容积负荷( Uv )关系曲线
Fig. 5 Relat ion curve between specif ic subst rate degrading
rates ( q ) an d volumet ric loadings( Uv ) .
除的百分率也随之增加; Uv 值在 10~
30mgL - 1h- 1范围内,比基质降解速率和
基质的容积负荷几乎呈线性关系,尔后随
着 Uv 的增加, Q 的增加趋势变缓.此外,
检测了较高基质浓度对固定化细胞基质降
解作用的影响.在进水 PCA浓度为 360mg
L - 1,进水流速为 200mlh- 1 (停留时间,
2. 63h) ,即在基质负荷为 137mgL - 1h- 1
的条件下,其体积降解速率为 125. 05mg
L - 1h- 1, PCA的百分去除率达到91. 4% ,
说明此浓度下未对微生物的代谢产生抑制
影响.
4 讨 论
Kellogg[ 4]指出, 通过天然遗传工程,
可使多个降解基因并入到一种细菌中.本
研究使用的菌种来自降解 pDCB 的混合
微生物,那么,当以苯胺、氯代苯胺作为新
的选择基质于分批和连续培养装置中对其
进行较长时间的驯化培养后,借助于转化
或接合作用, 使菌种间遗传基因的天然交
换得以进行, 从而赋予细菌培养物以新的
316 应 用 生 态 学 报 9 卷
遗传性状,即促使其代谢新基质能力的产
生,结果获得了能降解芳胺类化合物的混
合微生物.
因芳胺的微生物降解不遵循 Monod
方程,故把通常用于描述在封闭系统里微
生物生长的 Logistic方程转换为芳胺类化
合物的微生物降解方程. 其依据是,由基质
浓度决定的比微生物生长率()和比基质
降解速率之间存在显著相关性 ( P <
0. 01) [ 1] , 而且,氯代芳烃的降解作用依赖
于活性微生物的数量. 况且, Schmidt[ 7]
早把此方程列入他的有机化合物生物降解
的动力学模型中.
实验结果指出, 当进水基质浓度较低
时,随着稀释率增加的 PCA容积负荷正可
满足固定化细胞对 PCA 的生长需求,而使
其体积降解速率也随之增加, 以致使该基
质为微生物所全部利用. 然而,伴随释放的
氯离子浓度却低于理论值, 可能由于载体
对氯离子的吸附所致. 此推论尚待进一步
证实.
固定化生物反应器的优点包括高的生
物量浓度,污染物的高去除率和对抑制性
化合物的高冲击负荷的耐受性[ 6] . 本研究
使用的固定化混合微生物显示了对基质降
解的高效率.这一点可由高的 Q max值和低
的 K s 值(即高的基质亲和性)来证实. 它
是悬浮细菌细胞所不可比拟的. 如在分批
培养中,当 PCA 浓度为 100mgL- 1时, 以
氯离子的完全释放为标志的 PCA 的全部
降解需时 2 周; 而在生物反应器里, 使
200mgL- 1的同种基质去除 85%仅需4. 5
h.按照化学结构, PCA 较苯胺更难降解,
但本实验结果表明,在生物反应器中, PCA
的 Qmax却高于在分批培养中苯胺降解的
这一常数.而且,在较高基质浓度下,其体
积降解速率和基质的百分去除率均有增大
趋势,说明生物反应器可耐受高基质负荷.
由此可见,本实验室构建的填充床生物反
应器可望直接用于处理含芳香胺类化合物
的高浓度有机废水.
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