全 文 ：卤代烷烃脱卤酶基因在拟南芥中反式失活系统的建立 3
郝　林 3 3 　(沈阳师范学院生物系 ,沈阳 110034)
曹　军　冯　树　(中国科学院沈阳应用生态研究所 ,沈阳 110016)
【摘要】　以细菌 Xanthobacter autot rophicus 卤代烷烃脱卤酶基因为遗传负选择标记 ,建立了该基因在拟南芥中
反式失活的实验系统. 在卤代烷烃脱卤酶转基因拟南芥中 ,有 1 株表现为转基因失活 ,离体核 run2off 转录实验
表明为基因转录后沉默 (这里特指沉默位点) . 用这一转基因沉默植株与同源转基因高效表达植株 (这里特指同
源转基因位点)杂交 ,结果 96 %的 F1 代植株表现为同源转基因反式失活. 将 F1 代植株自交 ,使部分沉默位点与
反式失活的同源转基因位点分离 ,结果 200 株子代中有 42 株表现 DhlA 活性 ,158 株无 DhlA 活性 ,即 dhlA 沉默
植株与表达植株之比为 3. 76∶1 ,表明沉默位点是以孟德尔显性因子方式使同源转基因位点反式失活的.
关键词 　卤代烷烃脱卤酶基因 　拟南芥 　反式失活 　转录后沉默
文章编号 　1001 - 9332 (2001) 02 - 0269 - 03 　中图分类号 　Q943. 2 　文献标识码 　A
Establishment of trans2inactivation system for haloalkane dehalogenase gene in Arabidopsis thaliana . HAO Lin ( Bi2
ological Depart ment , S henyang Teacher’s College , S henyang 110034) ,CAO J un and FEN G Shu ( Institute of A p2
plied Ecology , Chinese Academy of Sciences , S henyang 110016) . 2Chin. J . A ppl . Ecol . ,2001 ,12 (2) :269～271.
With haloalkane dehalogenase gene ( dhlA ) of Xanthobacter autothophicus as a negative selection marker , a novel
trans2inactivation system for transgenes in plants was developed. After the A rabidopsis plants were transformed with
dhlA , one plant was shown dhlA post2transcriptional silencing by nuclear run2off transcriptional analysis. The A ra2
bidopsis plants containing silencing locus were crossed to those efficiently expressed dhlA , referred as a homologous
transgenic locus ,and 96 % of F1 plants became the homologous dhlA inactivated in trans. When the F1 plants were
selfed ,and the silencing locus and the homologous locus were separated in some progenies ,42 of the 200 progenies ex2
hibited DhlA activity ,and 158 no DhlA activity , and the proportion of the DhlA2expressing plants to the dhlA2silenc2
ing ones was 3. 76 to 1 ,which suggested that the silencing locus inactivated in trans the homologous transgenic locus as
a Mendelian dominant factor.
Key words 　Haloalkane dehalogenase gene ( dhlA ) , A rabidopsis thaliana , Trans2inactivation , Post2transcriptional
silencing.
　　3 中国科学院知识创新工程资助项目 ( KZCX22401) .
　　3 3 通讯联系人.
　　2000 - 02 - 18 收稿 ,2000 - 04 - 11 接受.
1 　引 　　言
植物基因工程的主要目的之一是获得高表达的转
基因产物 ,然而近年来不断发现的转基因沉默 ( t rans2
genic silencing) [15 ]给这一研究带来困难. 另一方面 ,转
基因沉默也被用来进行作物改良 ,如生产抗病毒病的
农作物[18 ] ,还有 ,转基因沉默或许也可用于对某些基
因的表达调控上 ,如同使用反义抑制 (antisense sup2
pression)技术使西红柿多聚半乳糖醛酸酶 ( PG)基因表
达失活[19 ]一样. 事实上 ,为了区别这两种具有相似结
果的现象 ,Jorgensen[13 ]将同源依赖的基因沉默称作
“有意义抑制”( sense suppression) . 鉴于转基因沉默的
重要性 ,人们已给予了极大的关注 ,有关其机理研究十
分活跃 ,其中建立一套有效的实验系统是必需的.
细菌 Xanthobacter autot rophicus 卤代烷烃脱卤酶
(DhlA)参与环境污染物卤代烷烃类的分解代谢[11 ] ,我
们将此酶的编码基因 dhlA 克隆至拟南芥中 ,得到了
高效表达[7 ] ,并以此建立了新的遗传负选择标记[17 ] .
在含有微摩尔级的二氯乙烷 (DhlA 的作用底物) 培养
基上 ,凡是能表达 dhlA 的转基因拟南芥整株变白 ,而
野生型和 dhlA 沉默植株则能正常生长. 以此为筛选
方法 ,建立了 dhlA 转基因的反式失活系统 ,为研究转
基因沉默机理提供了新的实验模式.
2 　材料与方法
211 　植物材料
野生型拟南芥种子为生态型 Wassilewskija (简称 WS) , dhlA
转基因拟南芥的获得及遗传表达分析见前文[7 ] ,其中本文所用
的转基因植株均为 dhlA 单拷贝纯合植株 ,表达载体的结构是 :
L ← Pnos N ptII 3’nos P35S2 dhlA 3’Rbc ←R
212 　研究方法
21211 细胞核分离和离体核 run2off 转录实验 　按 Luthe 和
Quatrano 描述的方法从叶片中分离细 胞核 [14 ] . 离体核转录实
应 用 生 态 学 报 　2001 年 4 月 　第 12 卷 　第 2 期 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
CHIN ESE JOURNAL OF APPL IED ECOLO GY ,Apr. 2001 ,12 (2)∶269～271
验及 RNA 杂交按 Hagen 和 Guilfoyle 的方法[6 ]进行.
21212 植株杂交 　方法见前文[8 ] .
21213 转基因沉默植株的筛选 　以 dhlA 为遗传负选择标记进
行筛选[17 ] . 将供试种子经常规消毒后接种于 MS琼脂平板上培
养 14d(21 ℃,连续光照 ,光照度为 2000lx) ,然后在选择压力下
继续生长 2d ,转基因表达植株弱小 ,整体变白 (如图 1b) ,野生
型及转基因沉默植株则生长正常 (图 1a) . 选择条件是在一小瓶
盖中加 5μl 二氯乙烷 ,放在 MS 平板上 ,密封 ,由于二氯乙烷极
易挥发 ,在培养皿空气中含量约为 1. 5～2. 0mmol·L - 1 .
图 1 　转基因沉默植株与野生型植株在选择培养基上的表型
Fig. 1 Phenotypes of transgenic silencing plants and wild2type plants on the
selection medium.
a)野生型和 dhlA 沉默植株 (1∶1 混合后接种) Phenotypes of 1∶1 mixture
of wild2type and dhlA silencing plants ,b) dhlA 高效表达植株 dhlA effi2
ciently expressing plants.
3 　结果与讨论
311 　dhlA 转基因沉默为转录后调节
在对 dhlA 转基因植株进行 Northern 印迹和酶活
测定时[7 ] ,20 株供试转基因植株中有一株未表现任何
杂交信号和酶活力 ,但在含 50mg·ml - 1卡那霉素培养
基上植株仍表现为抗性 ,且能稳定遗传 ,说明基因载体
结构已整合入受体植株基因组中. 对这一植株进行离
体核 run2off转录实验 ,结果如图2和图3 . 结果表明 ,
图 2 　Run2off 转录试验
Fig. 2 Run2off transcriptional experiment .
分别从拟南芥野生型 (wt) 、dhlA 转基因沉默植株 ( sp) 和 dhlA 表达植
株 (ep) 分离细胞核并合成 run2off 转录本 ,与转移至尼龙膜上的 UidA
(编码 GUS) 、N pt 和 dhlA 片段 (DNA 加样量 ,左为 5μg ,右为 10μg) 杂
交. Run2off experiment was performed with the nuclei derived from the
leaves of a wild2type A rabidopsis ( wt ) , dhlA transgenic silencing plants
(sp) and dhlA expessing plants(ep) . Labelled RNA was hybridized to Ui2
dA , N pt and dhlA transferred to nylon membrane (left 5μg DNA and right
10μg DNA at each lane) .
在细胞核中能合成 mRNA 转录本 ,但在细胞质中不含
稳定的 mRNA ,这种现象就是基因的转录后沉默
(post2t ranscriptional silencing) [1 ] . 目前有许多种假说
用来解释转基因转录后沉默 ,其中具有代表性的有 :1)
植株内产生了转基因反义 RNA ,从而形成反义 RNA
与目标 mRNA 复合体 ,它可被细胞内某种机制识别并
降解[5 ] ;2)由于同源序列配对并相互作用而影响基因
表达[12 ] ;3)由于转基因的过量表达使目标 mRNA 在
细胞中含量达到某一临界值 ,从而引发其降解[3 ] ; 4)
转录后沉默与碱基甲基化有关[10 ] . 这些假说都有一定
的实验证据 ,但也有很大的局限性.
图 3 　Northern 印迹分析
Fig. 3 Northern blotting analysis.
1. 正对照 ,样品为 1ng dhlA PCR 产物 Positive control ,1ng PCR product
of dhlA ,2. 负对照 ,样品为 10μg 野生型拟南芥总 RNA Negative control ,
10μg of total RNA of wild2t ype WS ,3 ,4. 分别为 10μg sp 和 ep 总 RNA
10μg of sp and 10μg of ep total RNA respectively. 杂交探针以 dhlA 为模
板采用缺口平移法合成 The a2P32 labelled probe is made by nick transla2
tion using dhlA as the templet .
312 　dhlA 转基因反式失活
为了研究转基因沉默位点对其同源表达序列的反
式作用 ,进行了下列组合的杂交实验 :1)转基因沉默植
株 (sp) ×转基因表达植株 (ep) ,2) 转基因表达植株 1
(ep1) ×转基因表达植株 2 (ep2) ,3) 转基因沉默植株
(sp) ×野生型植株 (wt) ,4) 转基因表达植株 (ep) ×野
生型植株 (wt) ,5)转基因沉默植株 (sp)自交 ,6) 转基因
表达植株 (ep)自交 ,7)野生型植株 (wt)自交.
杂交子代种子接种于 MS 平板上 ,在选择压力下
统计转基因沉默与表达的植株数 (表 1) . 由表 1 各组
合杂交结果相比较可得出 :沉默位点强烈抑制同源
转基因位点的表达 . 将某一基因两份拷贝引入同一细
表 1 　杂交子代中 dhlA 表达状况
Table 1 State of dhlA expression in the cross progenies
杂交组合 Crossed combination
sp ×
ep
ep1 ×
ep2
sp ×
wt
ep ×
wt
sp ×
sp
ep ×
ep
wt ×
wt
dhlA 表达植株数
dhlA expression plants 2 48 0 79 0 56 0
dhlA 沉默植株数
dhlA silencing plants 49 6 44 0 73 0 62
胞 (如通过先后两次转化或通过杂交)有时会引起两拷
贝转基因同时失活 ,即同源依赖的基因沉默 ( homolo2
gy2dependent gene silencing) [15 ] ,这种方式的失活程度
在不同实验中变化很大 ,本文中 ep1 和 ep2 杂交的 54
株子代中仅有 6 株表现为无 DhlA 活性. 但两个杂交
的同源拷贝中有一个是已知的沉默位点 ,那么杂交子
代中几乎都表现为无 DhlA 活性. 在其它实验中也有
类似结果 ,如在相同启动子的控制下 ,转基因沉默位点
可使任何其它的表达基因反式失活[16 ,20 ] . 同样 ,转基
因沉默位点也能使具有相同编码序列的转基因反式失
活[9 ] .有关这种失活的机制还不清楚 ,目前只有一些
072 应 　用 　生 　态 　学 　报 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　12 卷
假说[4 ] ,本实验系统的建立为研究这种机制提供了新
的模式.
313 　反式失活的转基因沉默
将子代中转基因反式失活的植株自交 ,使部分子
代中沉默位点与同源转基因位点分离. 将自交子代
种子接种于MS培养基上 ,14d后将200株生长正常的
植株转入选择压力下继续生长 2d ,统计具有 dhlA 表
型的植株 ,其中 42 株整体变白且弱小 ,其它 158 株生
长正常 , dhlA 表达与沉默植株之比为 3 . 76∶1 ,说明
dhlA 沉默位点是以孟德尔显性因子的方式作用于同
源转基因位点. 为了确认这一结论 ,将 sp 与 ep 杂交子
代中转基因反式失活的植株与野生型植株杂交 ,结果
dhlA 表达与沉默植株之比接近 1∶1 (未附实验结果) ,
这进一步表明沉默位点确实是以显性方式反式作用于
同源转基因位点的 ,且反式失活的同源转基因沉默是
可逆的 ,当沉默位点与反式失活的同源转基因位点分
离后 ,后者恢复了正常表达. 以上结论与 Davies 等[2 ]
用 CHS(苯基苯乙烯酮合成酶) 基因在拟南芥中的实
验结果相似.
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作者简介 　郝 　林 ,男 ,1963 年生 ,中国科学院沈阳应用生态研
究所在读博士研究生 ,导师张成刚研究员和张忠泽研究员 ,研
究方向为分子生物学和微生物工程. 在国内外学术刊物上发表
研究论文 30 余篇.
1722 期 　　　　　　　　　　　　　郝 　林等 :卤代烷烃脱卤酶基因在拟南芥中反式失活系统的建立