全 文 ：土壤细菌 16Sr RNA 基因变异型及其与
植被的相关研究 3
杨官品 3 3 　朱艳红　陈　亮　薛小乔　(湖北大学生命科学学院 ,武汉 430062)
【摘要】　绕过细菌的分离培养 ,直接提取土壤 DNA ,扩增、克隆土壤细菌群体的 16S 核糖体 RNA 基因 (16S rD2
NA) . 根据该基因各种变异类型的限制性片段长度多型性 ,分析土壤细菌分子遗传多样性及其与植被的相互关
系. 植被的改变影响土壤养分 ,进而改变土壤细菌群落结构. 土壤细菌遗传多样性和分化能反映植被的变化.
关键词 　细菌 16S核糖体 RNA 基因 　限制性片段长度多型性 　植被
文章编号 　1001 - 9332 (2001) 05 - 0757 - 04 　中图分类号 　S15414 　文献标识码 　A
Molecular genetic variation of soil bacteria as determined by polymorphism of restrictive fragment length of
16Sr RNA genes and its relation with vegetation shift. YAN G Guanpin ,ZHU Yanhong ,CHEN Liang ,XU E Xiaoqiao
( Faculty of L if e Science , Hubei U niversity , W uhan 430062) . 2Chin. J . A ppl . Ecol . ,2001 ,12 (5) :757～760.
Bacterial 16S ribosomal RNA (hereafter rDNA) genes were PCR2amplified from soil DNA ,and cloned without artifi2
cial cultivation. The molecular genetic diversity and its relation with vegetation shift were determined by RFL P of ran2
domly selected recombinants containing rDNA inserts. Soils under different vegetation rear relative bacterial community
by formulating their physical and chemical components. The molecular genetic diversity and its differentiation could
serve as the appropriate indicators of vegetation shifts.
Key words 　Bacterial 16S ribosomal RNA gene , Restriction fragment length polymorphism , Vegetation.
　　3 湖北省自然科学基金和武汉市晨光计划资助项目.
　　 3 3 通讯联系人. 现在青岛海洋大学海洋生命科学院 , 青岛
266003.
　　1999 - 10 - 14 收稿 ,2000 - 01 - 14 接受.
1 　引 　　言
随着人类活动及其衍生污染物对环境的影响日益
加剧 ,高等动植物遗传多样性减少甚至消失 ,污染的生
物学效应超出了高等动植物甚至藻类、原生动物等微
型生物的反应范围. 在厌氧、高温等自然极端环境和各
种严重污染环境中 ,细菌成为主要生物类群. 只有细菌
遗传多样性及其群落结构变化能反映人类活动对这些
环境的影响 ,以及污染物的生态学效应. 然而 ,由于细
菌形态简单 ,生理代谢特征鉴定复杂 ,绝大多数还无法
分离培养 ,很难用传统分类法研究环境细菌的遗传多
样性[1 ] .
分子生物学技术的引入 ,逐步使细菌遗传多样性
分析摆脱对菌株分离和形态生理特征鉴定的依赖. 近
年来 , 16S 核糖体 RNA [8 ] 、固氮酶 [25 ] 、硫酸盐还原
酶[7 ] 、硝酸盐还原酶[4 ] 、氢化酶[22 ]等基因变异类型的
序列差异广泛用于描述环境细菌遗传多样性. 涉及的
环境有水体 [11 ,13 ] 、土壤[15 ,10 ] 、活性污泥 [17 ] 、生物肠
道[24 ]以及共生菌[12 ]等. 对森林砍伐[3 ] 、农药和除草剂
施用[9 ] 、重金属[20 ]等造成的土壤细菌群落变化也有分
析. 对分离的细菌 ,基因序列比较[23 ] 、限制性片段末端
标记[21 ] 、扩增片段多态性[14 ] 、重复序列间隔长度多态
性[18 ] 、基因限制性片段长度多态性[6 ]等分子标记技术
已用来确定它们的亲源关系和系统地位.
直接提取土壤 DNA ,扩增、克隆土壤细菌特定基
因 ,再根据这些基因变异类型的限制性片段长度多型
性分析土壤细菌分子遗传多样性及其与环境的相关性
既能绕过细菌的分离培养 ,又能利用针对分离菌株的
研究方法. 本文在描述随机分离的土壤细菌 16S 核糖
体 RNA 基因变异类型限制性片段长度多型性基础
上 ,对土壤细菌分子遗传多样性及其与不同植被土壤
养分的相关性进行了分析.
2 　研究地区与方法
211 　研究地自然概况
武汉市郊某小山及其邻近丘陵地大部分为人工林覆盖 ,包
括小面积果园和茶园 ,其次是耕地 ,少部分保持杂草植被. 把该
区域分为草地、人工林 (包括果园、茶园) 和农田 3 种植被类型 ,
于秋季在每种类型多个取样点取样进行分析.
212 　研究方法
21211 取样 　取 10cm 表土约 500g ,混合 ,用 100g 抽提 DNA ,其
余风干后用于养分分析.
21212 养分分析 　用重铬酸钾法测定土壤有机质含量. 用硒粉
应 用 生 态 学 报 　2001 年 10 月 　第 12 卷 　第 5 期 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
CHIN ESE JOURNAL OF APPL IED ECOLO GY ,Oct . 2001 ,12 (5)∶757～760
- 硫酸铜 - 硫酸消化法 (开氏法) 测定土壤全 N. 每样品测定 3
次 ,取平均值[16 ] .
21213 DNA 分离 　取 100g 土样 ,加 200ml PBS 缓冲液 ,剧烈搅
拌 20min ,自然沉降 30min ,12000g 离心浑浊水相 ,取沉淀. 加
20 ml PBS缓冲液重新悬浮沉淀 ,100g 离心 ,取水相. 重复差速
离心 2 到 3 次 ,直到获得略带黄色的沉淀. 用 0. 2ml 0. 2mol·
L - 1 NaOH 悬浮 , 100 ℃干浴处理 15min ,冰上冷却 ,用 0. 2ml
012mol·L - 1 HCl 中和 ,12000g 离心 ,弃上清 ,DNA 与杂质共沉
淀.用适量 TE缓冲液悬浮沉淀 ,经普通琼脂糖电泳 ,在 UV 灯
下切取含 DNA 凝胶 ,融化 ,苯酚氯仿抽提 ,回收单链 DNA ,可
称为差速离心2碱裂解法. 回收的单链 DNA 直接用于 PCR 反
应 ,通过稀释获得最佳 PCR 扩增效果.
21214 细菌 16S rDNA 的 PCR 扩增 　根据文献[1 ,5 ]合成 PCR
引物 (表 1) . 该引物能扩增所有细菌类群的 16S rDNA. 它们也
是用测序方法研究土壤细菌遗传多样性时 ,扩增细菌群体 16S
rDNA 的常用引物. 反应体系含有 2μl 模板 DNA ,1. 5 mmol·
L - 1 MgCl2 ,0. 25μmol·L - 1正反向引物 ,400μmol·L - 1 dN TP ,1
U Taq DNA 聚合酶及 1 倍反应缓冲液 (酶生产商提供) . 循环条
件为 :95 ℃3min 接 94 ℃1 min ,53 ℃3min ,72 ℃ 2min 30 个循
环 ,并在 72 ℃延伸 8min. 该引物对专一扩增细菌的 16S核糖体
RNA 基因 ,不能扩增其它生物的 rDNA. 两引物 5’端分别相当
于 E. coli 16S rDNA 的 68 和 1406 位核苷酸 ,因此 , PCR 产物
长约 1339bp.
表 1 　引物序列及其在 E. coli 16S rDNA上的对应位置和扩增专一性
Table 1 Primer sequences , their target sites in E. coli 16S rDNA and
specif icity
引物名称
Primer name
引物序列 (5′- 3′)
Primer sequence
位置
Target position
专一性
Specificity
68F TNANACATGCAATGCAKCG 16S ,68286 细菌 Bacteria
1392R ACGGGCGGTGTGTRC 16S ,140621392 通用 Universal
　　N = A + T + C + G; K = G + T ; R = A + G
21215 PCR 产物的克隆 　用 TA 克隆法 [2 ]构建土壤细菌 16S核
糖体 RNA 基因变异类型文库. 向每管 PCR 反应产物再加入
2μl 含 1U Taq 聚合酶的 1 倍反应缓冲液 ,充分混匀后于 72 ℃继
续保温 30min ,集中各管反应产物 ,立即用苯酚、氯仿抽提 ,沉淀
DNA ,溶于水中备用. pUC19 质粒用 Sma I 酶切 ,加上 T 尾用做
克隆载体. 在 100μl 加尾反应体系中含有 5μg 质粒 DNA ,5mmol
·L - 1 dTTP ,3. 75mmol·L - 1 MgCl2 ,5 U Taq 聚合酶及 1 倍的反
应缓冲液 ,混合物在 75 ℃保温 2h ,立即用苯酚、氯仿抽提 ,沉淀
DNA ,溶于水中备用. 将扩增的 rDNA 与加 T 的载体按 2∶1 摩
尔比混合 ,保持 DNA 总量在 300ng 左右 ,在 T4 连接酶作用下 ,
于 16 ℃连接 24h 以上 ,转化感受态大肠杆菌 DH5α.
21216 重组质粒的限制性内切酶酶切分析 　在获得的重组子
中 ,随机选取 100 个左右 ,分离重组质粒 ,用 4 碱基限制性内切
酶 Hinf I 消化重组质粒 ,2 % 琼脂糖凝胶电泳 ,获得随机克隆的
土壤细菌 16S rDNA 变异类型限制性片段长度多型性图谱. 载
体多克隆区两边的部分与 rDNA 的两端在酶切后连在一起 ,成
为 rDNA 限制性片段的一部分 ,而载体的其它酶切片段是相同
的 ,并可当作内源分子量标记. rDNA 的某些极小片段由于极难
获得清晰的带纹 ,在分析时被忽略.
21217 统计分析 　用 Shannon 氏信息指数 H = - 6 f i 3 ln f i 来
计量群体或其亚群体的遗传多样性 ,其中 f i 是第 i 种 rDNA
RFL P 变异类型的频率. 用μ= ( f xi - f yi ) / [ f xi 3 (1 - f xi ) / N x
+ f yi 3 (1 - f yi) / N y ]1/ 2计算μ值 ,用μ检验判定第 i 变异类型
的频率在第 x 和第 y 亚群体间差异的显著程度 , N x 、N y 分别为
第 x 和第 y 亚群体重组质粒数. 群体多样性指数可分解为亚群
体间差异的 Hs 和亚群体间遗传距离的 DS T , HS = ( Hj 3 N j /
N ,其中 , Hj 为第 j 亚群体的多样性指数 , N 为群体重组质粒
数 , DS T / HS 为亚群体间遗传分化水平.
3 　结果与分析
311 　土壤细菌 16S rDNA 限制性片段长度多型性
PCR 引物是根据几千种发表的序列设计的 ,能选
择性地扩增细菌的 16S rDNA ,而不扩增其它生物的
16S rDNA ,同时 ,能保证所有细菌类群的 16S rDNA
被扩增出来. 16S rDNA 的扩增、连接、克隆及克隆选
择等过程是随机的 ,因此 , PCR 扩增、克隆土壤细菌
16S 核糖体 RNA 基因 ,再用重组质粒中 16S 核糖体
RNA 基因的限制性片段长度多型性分析土壤细菌的
分子遗传多样性是可行的. 我们用肉眼在同一胶上判
断相同的 RFL P 变异类型 ,不同胶上的变异类型主要
靠重复电泳归并. 同时 ,借助分子量标记计算带的分子
量[19 ] ,借以归并各种变异类型 ,当允许有 50bp 的误差
时 ,计算方法与肉眼判断完全一致 ,表明当分析的样品
多或整合不同来源的数据时 ,可仅凭分子量计算进行.
本研究从 3 种类型植被的土壤中共选择了 277 个重组
质粒 , Hinf I 酶切后获得 14 种 RFL P 变异类型. 其中
有 4、5、6、8 和 10 等 5 种变异类型的频率超过0. 1. 土
壤是细菌的主要生境 ,在总样本中遗传多样性指数达
到 2. 45 ,表明土壤细菌的遗传多样性是非常丰富的.
另外 ,不同 RFL P 变异类型的频率差异较大 ,表明在土
壤中存在丰度较大的细菌类群 ,它们在土壤细菌群体
中占据相对优势 (表 2) . 用 RFL P 变异类型、频率和总
数 3 个基本参数在分子水平上描述土壤细菌遗传多样
性.
312 　不同植被土壤细菌遗传多样性比较
在草地、人工林和农田 3 种植被土壤中 ,有 1、4、
5、6、8、10 和 14 等 7 种变异类型在至少 1 种植被土壤
中的频率超过 0. 1. 这表明各种植被土壤都具有相对
占优势的细菌类群. 除了变异类型 10 在 3 种植被土壤
中频率较高且差异不显著外 ,其它变异类型的频率在
3 中植被土壤中的差异均达到显著水平 (α< 0. 01) ,表
明 3 种植被土壤的细菌群落存在明显的不同. 草地、人
工林、农田对土壤细菌遗传多样性的扰动程度是递增
的 ,相应的土壤细菌遗传多样性水平和检测到的变异
857 应 　用 　生 　态 　学 　报 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　12 卷
类型数也呈微小的递减趋势. 草地、人工林和农田多样
性水平分别为 2. 45、2. 32 和 2. 29 ,而变异类型数分别
为 14、13 和 12. 从变异类型的频率比较可以看出 3 种
植被土壤在细菌群落结构上有分化 ,同时又存在相似
的细菌类群. 3 种植被土壤的遗传分化只有 3. 88 %. 草
地与农田、草地与人工林、人工林与农田间遗传分化分
别为 8. 50 %、2. 53 %和 1. 93 % ,说明人工林和农田细
菌遗传多样性相似 ,从草地到农田植被 ,土壤细菌遗传
多样性分化加剧.
表 2 　土壤细菌 16S核糖体 RNA基因限制性片段长度多型性变异类型
及其在不同土壤中的频率
Table 2 RFLP variants of soil bacterial 16S rDNA and their frequencies in
soils analyzed
RFL P 类型
RFL P variants
草地
Grass
land
人工林
Planted
forest
农田
Crop
field
总样本
Total
sample
1 0. 010 0. 057 0. 129 0. 065
2 0. 021 0. 045 0. 054 0. 040
3 0. 031 0. 045 0. 086 0. 054
4 0. 135 0. 170 0. 097 0. 134
5 0. 146 0. 080 0. 118 0. 116
6 0. 094 0. 193 0. 140 0. 141
7 0. 042 0. 023 0. 000 0. 022
8 0. 083 0. 102 0. 129 0. 105
9 0. 073 0. 045 0. 011 0. 043
10 0. 115 0. 136 0. 140 0. 130
11 0. 073 0. 023 0. 011 0. 036
12 0. 052 0. 068 0. 032 0. 051
13 0. 021 0. 000 0. 000 0. 007
14 0. 104 0. 011 0. 054 0. 058
重组质粒数
Plasmid count 96 88 93 277
RFL P 类型数
Variant type 14 13 12 14
多样性指数
Diversity index 2. 45 2. 32 2. 29 2. 45
有机质 (g·kg - 1)
Organic substance 33. 93 28. 00 18. 93
全 N (g·kg - 1)
Total N 2. 13 1. 93 1. 187
313 　细菌遗传多样性与土壤养分相关性
植被对土壤的影响主要表现在对土壤有机质、全
N 含量等养分的影响. 我们分析了 3 种植被土壤有机
质、全 N 含量与土壤细菌多样性的相关性. 在 14 类
RFL P 变异类型中 ,第 1、7、8、9 等 4 种类型与有机质
含量表现为高度相关 (α< 0. 05) ,其中 ,第 7 和第 9 两
种类型为正相关 ,第 1 和第 8 为负相关 ,表明有机质含
量变化会导致某些细菌类群增加或减少 ,而对另一些
细菌类群不影响或影响较小 ,这些不受影响的类群是
土壤共有的或受别的生态因子影响. 在 14 中变异类型
中 ,只有第 3 类与全 N 含量表现为高度的负相关 ,说
明土壤 N 含量对细菌也有显著影响 ,但影响的细菌类
型较少. 另外 ,总体遗传多样性水平与有机质和全 N
相关性不显著 ,表明植被不显著改变土壤细菌的整体
多样性 ,但显著影响土壤细菌的群落结构. 植被的改变
影响土壤理化性质 ,进而改变土壤细菌群落结构. 土壤
细菌遗传多样性和分化能反映植被的变化. 在细菌群
落与环境的相关性上细菌表现了与高等动植物不同的
变化规律 ,一旦高等动植物的遗传多样性消失 ,就很难
有新的种类迁入并适应改变了的环境 ,而细菌则不同 ,
总有新的细菌类群适应并在改变了的环境中繁衍. 这
正是细菌在分布和适应性上的特点 ,也是用细菌群落
结构的改变指示环境变化的优势所在.
314 　土壤 DNA 分离方法的优化
从操作角度考虑 ,模板 DNA 分离方法越简单越
好. 在 LB 培养基上培养土壤细菌 ,随机获得一批菌
落 ,碱煮法 (即在 NaOH 溶液中裂解细菌体) 能使所有
细菌裂解 ,由此我们总结出差速离心2碱裂解法分离土
壤 DNA[26 ] . 该方法克服了已有方法繁复冗长、耗时昂
贵的缺点 ,但释放出的是单链 DNA. 这是一种最简洁
的 PCR 模板 DNA 分离方法. 已报道该法能裂解酵母
细胞和真菌孢子 ,可相信该法能裂解土壤中各种细菌 ,
释放出单链 DNA. 由于 PCR 引物的选择性 ,其它生物
的 DNA 不影响分析.
4 　结 　　论
411 　在丧失高等生物多样性和不存在高等生物的环
境中 ,细菌能反映环境条件的变化. 在 DNA 层次研究
细菌的遗传多样性及其与环境因子的相互关系 ,可以
克服细菌分离培养和种属鉴定的局限. 把有关的分子
生物学方法和技术用于生态学研究 ,将能拓展研究内
容 ,揭示新规律.
412 　细菌 16S rRNA 基因是环境指示基因之一 ,除系
统学研究外 ,其变异信息也广泛用于环境细菌遗传多
样性分析. 16S rRNA 基因限制性片段长度多态性分
析表明不同植被土壤具有丰富的细菌遗传多样性 ,且
不同植被土壤细菌群落具有显著的分化 ,与土壤营养
因子呈紧密相关.
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作者简介 　杨官品 ,男 ,1963 年生 ,博士 ,教授. 现主要从事分子
生态学研究. 现已发表论文 30 余篇.
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